王杏+鄧青芳+陳華國+周欣

[摘要] 該實(shí)驗(yàn)采用回流法提取桑椹多糖，經(jīng)脫蛋白及DEAE-Cellulose 52分離純化得到4種多糖組分（中性多糖MFP-1，微酸性多糖MFP-2，酸性多糖MFP-3和MFP-4）。通過化學(xué)法和儀器分析法對各多糖組分進(jìn)行理化性質(zhì)測定和結(jié)構(gòu)表征，并研究其對乙醇脫氫酶（ADH）活性的影響。結(jié)果表明，MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4中的多糖量分別為75.3%，83.7%，79.1%，74.3%，其平均相對分子質(zhì)量分別為112.2，128.8，199.5，181.9 kDa。MFP-1主要含有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖（26.8∶20.4∶8.7∶5∶1）；MFP-2主要含有阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸（34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1）；MFP-3主要含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖（28.3∶22.6∶20.9∶18.6∶12.5）；MFP-4主要含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸（47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1）。紅外光譜分析結(jié)果表明，MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4中均有多糖的特征吸收峰，其中MFP-3和MFP-4是以β苷鍵為主的吡喃型多糖?；钚越Y(jié)果表明，4種多糖對ADH均有激活作用，其ADH激活能力順序?yàn)椋郝?lián)苯雙酯>MFP-3>MFP-1>MFP-2>硫普羅寧>MFP-4，MFP-1，MFP-2和MFP-3對ADH的激活作用均大于陽性對照硫普羅寧，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MFP-3對ADH的激活效果與陽性對照聯(lián)苯雙酯的激活效果相當(dāng)，推測其與之連接的糖醛酸種類有關(guān)，這為桑椹多糖的“構(gòu)-效”研究提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 桑椹多糖； 理化性質(zhì)； 結(jié)構(gòu)表征； ADH活性

[Abstract] Mori Fructus polysaccharides （MFPs） have been used as a source of therapeutic agents. The most promising activities of these biopolymers are their immunomodulation and anti-cancer effects. It was reported that polysaccharides were a potential drug against liver injury， but the hepatoprotective effect of MFPs was ambiguous. In this study， the fractionation of crude polysaccharides on DEAE-Cellulose 52 gave four fractions （MFP-1， MFP-2， MFP-2 and MFP-4）. The results showed that the contents of carbohydrates were 75.3%， 83.7%， 79.1%， 74.3%， and the molecular weight of them were 112.2， 128.8， 199.5， 181.9 kDa. Monosaccharide component analysis indicated that MFP-1 was composed of galactose， glucose， arabinose， rhamnose and mannose with the molarity rate of 26.8∶20.4∶8.74∶5∶1； MFP-2 contained arabinose， galactose， rhamnose， glucose and galacturonic acid with the molarity rate of 34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1； MFP-3 was composed of galacturonic acid， galactose， glucose， rhamnose and arabinose with the molarity rate of 28.3∶22.6∶20.9∶18.6∶15.1； MFP-4 contained glucose， galactose， rhamnose， galacturonic acid， arabinose and glucuronic acid with the molarity rate of 47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1. IR analysis′s results indicated that MFP-3 and MFP-4 may be polysaccharides containing β-glycosides. The alcohol dehydrogenase （ADH） activity text showed that， all these four MFPs were found have a positive effect on the activity of ADH， with order： bifendate>MFP-3>MFP-1>MFP-2>tioprnin>MFP-4， and the MFP-3 had the highest activity and demonstrated outstanding hepatic protecting activity.

[Key words] Mori Fructus polysaccharides； physic-chemical characters； characterization； activity effect of ADH

據(jù)2015年版藥典記載[1]，桑椹具有滋陰補(bǔ)血、生津潤燥的藥效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、心悸失眠、須發(fā)早白、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘等。此外，還有少量文獻(xiàn)報(bào)道[2]桑椹對酒精/四氯化碳所致的肝損傷有潛在的保護(hù)作用，國家已把桑椹列為藥食同源的保健品行列。

桑椹多糖（Mori Fructus polysaccharides，MFPs）是從桑樹果實(shí)中得到的具有抗氧化、降血糖、抗疲勞等[3-4]生物活性的一類高分子化合物。文獻(xiàn)報(bào)道[5]，桑椹多糖可提高妊娠小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力和速度，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和綿羊紅細(xì)胞所致的小鼠抗體生成，增強(qiáng)小鼠遲發(fā)性過敏反應(yīng)強(qiáng)度，改善妊娠小鼠免疫功能。

乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是參與乙醇體內(nèi)代謝的主要酶，可抑制人體對乙醇的吸收，加強(qiáng)乙醇在胃腸道的首過效應(yīng)，從而減輕乙醇對人體消化系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的損害，起到有效的解酒護(hù)肝作用[6]。

由于多糖的相對分子質(zhì)量大、黏度高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等因素，不利于對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的研究和進(jìn)一步“構(gòu)-效”關(guān)系的探索。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，多糖是潛在的抗肝損傷藥物制劑，但桑椹多糖的抗肝損傷作用尚不明確。因此，本研究從桑椹中分離純化得到4種多糖，通過理化性質(zhì)、單糖組成、紅外光譜（FT-IR）分析等手段對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并通過考察4種多糖對ADH活性的影響，探索桑椹多糖的解酒作用，為其在肝損傷方面的活性研究提供科學(xué)依據(jù)，也為桑椹多糖的“構(gòu)-效”關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1/10萬電子分析天平（XS105DU），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酶標(biāo)儀（Max Plus 384），美國Moleaular Devices公司；紅外光譜儀（TENSOR27），德國Bruker公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260），安捷倫科技有限公司；冷凍干燥機(jī)（FD-80），北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試劑

二乙氨基乙基纖維素52（DEAE-Cellulose 52），Sigma公司；葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、甘露糖（mannose，Man）、木糖（xylose，Xyl）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalUA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）對照品，均購于貴州迪大生物有限公司；氧化型輔酶 Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺），Roche公司；乙醇脫氫酶，Sigma公司；聯(lián)苯雙酯、硫普羅寧，中國食品藥品檢定研究院；考馬斯亮藍(lán)G-250，上海藍(lán)季生物有限公司；1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；苯酚、濃硫酸、乙醇，均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 桑椹多糖的提取 取一定量的桑椹鮮果，勻漿，加水回流處理2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，Sevag法[8]對濃縮液進(jìn)行脫蛋白處理，取上層液，邊振搖邊緩慢加入適量的95%乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，4 ℃冷藏24 h，離心（3 500 r·min^-1，15 min），取沉淀復(fù)溶，再次醇沉，重復(fù)3次，真空冷凍干燥，即得桑椹粗多糖，于干燥罐保存，備用。

2.1.2 桑椹多糖的分離純化 配制10 g·L^-1的桑椹粗多糖溶液，離心（3 500 r·min^-1，10 min），取上清液20 mL經(jīng)DEAE-Cellulose 52纖維素離子交換樹脂柱（3.2 cm×30 cm），依次用蒸餾水，0.1，0.3，0.5 mol·L^-1NaCl溶液分段洗脫（流速為2.5 mL·min^-1），每管收集10 mL，采用苯酚-硫酸法[9]對洗脫液跟蹤測定，直至無多糖洗出為止，按組分洗脫峰合并獲得不同組分，減壓濃縮，透析，真空冷凍干燥，得各組分桑椹多糖。

2.1.3 桑椹多糖的理化性質(zhì) 總糖含量的測定是以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照，采用苯酚-硫酸法測定總糖的含量。蛋白質(zhì)含量的測定是以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量[10]。硫酸基含量的測定是以硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照，采用氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸基的含量[11]。糖醛酸含量的測定是以葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照，采用硫酸-咔唑法測定糖醛酸的含量[12]。

2.1.4 單糖組成分析 采用PMP柱前衍生化HPLC色譜[13]。樣品的處理：稱取15 mg各組分多糖樣品，分別加入2 mol·L^-1TFA溶液6 mL，封口，105 ℃水解10 h，水解液蒸發(fā)至干，再反復(fù)加入甲醇，蒸干，除去多余的TFA，加入少量水溶解，得完全酸水解溶液，備用。

取完全酸水解溶液和對照品（Rha，Glc，Man，Xyl，Gal，GlcUA，GalUA，Ara）各1 mL，依次加入1.2 mL PMP溶液和0.3 mol·L^-1NaOH溶液1 mL，70 ℃水浴1 h，冷卻至室溫后加入0.3 mol·L^-1HCl溶液1 mL中和NaOH溶液，加入二氯甲烷除去多余的PMP，離心（3 500 r·min^-1，10 min），取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得衍生化的樣品和對照品溶液。

色譜條件，色譜柱為ZORBOX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相磷酸鹽緩沖液pH 7.4（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～28 min，13%～19% B；28～38 min，19%～16% B；38～50 min，16%～25% B）；柱溫30 ℃；流速1 mL·min^-1；進(jìn)樣量2 μL；檢測波長250 nm。

2.1.5 紅外分析 分別取1～2 mg干燥的各組分桑椹多糖，與100 mg干燥的KBr晶體混合，研細(xì)后壓片，在400～4 000 cm^-1進(jìn)行紅外掃描。

2.1.6 相對分子質(zhì)量分析 將不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖對照品（Mw=70，130，175，300，256，580 kDa）配制成5 g·L^-1溶液，由小分子到大分子依次進(jìn)樣，記錄各對照品相應(yīng)的保留時(shí)間，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件，色譜柱為Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）；流動相 0.1 mol·L^-1NaNO₃；柱溫 40 ℃；流速 0.6 mL·min^-1；進(jìn)樣量 20 μL；檢測器為示差檢測器；檢測溫度 55 ℃。將各組分桑椹多糖配制成5 g·L^-1溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，操作條件同上，然后根據(jù)MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4的保留時(shí)間計(jì)算其相對分子質(zhì)量。

2.1.7 桑椹多糖各組分對ADH活性的影響 采用改良后的瓦勒-霍赫（Valle & Hoch）法[14]檢測ADH活性，在測定板中依次加入100 μL焦磷酸鈉緩沖液（pH 8.8），75 μL NAD⁺，35 μL乙醇，10 μL各組分桑椹多糖溶液和陽性對照溶液，混合后37 ℃加蓋溫育5 min。立即加入10 μL ADH，搖勻后立即測定340 nm處的吸光度（A₃₄₀），每隔10 s讀數(shù)1次，連續(xù)測定5 min，記錄數(shù)據(jù)。以蒸餾水代替乙醇溶液調(diào)零點(diǎn)，以不加藥物組為空白組，以硫普羅寧和聯(lián)苯雙酯為陽性對照。采用以下公式計(jì)算ADH活性和激活率。

2.2 結(jié)果與討論

2.2.1 桑椹多糖分離純化 桑椹多糖經(jīng)DEAE-Cellulose 52分離得到4種多糖組分，分別為中性多糖MFP-1，微酸性多糖MFP-2，酸性多糖MFP-3和MFP-4，見圖1。

2.2.2 桑椹多糖理化性質(zhì) MFP-2的總糖含量最高，與上述洗脫曲線結(jié)果一致，見表1。各組分均存在一定量的蛋白質(zhì)，推測這些組分可能是糖蛋白結(jié)合物。其中MFP-1含有少量的硫酸基和糖醛酸，表明MFP-1基本上為一些中性多糖。相反的，MFP-3和MFP-4中含有糖醛酸較多，表明這2種組分可能是一些果膠物質(zhì)。

2.2.3 單糖組成分析 桑椹多糖各組分的單糖組成結(jié)果，見圖2，MFP-1主要含有Gal，Glc，Ara，Rham，Man，其摩爾比為26.8∶20.4∶8.7∶5∶1；MFP-2主要含有Ara，Gal，Rham，Glc，GalUA，其摩爾比為34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1；MFP-3主要含有GalUA，Gal，Glc，Rham，Ara，其摩爾比為28.3∶22.6∶20.9∶18.6∶12.5；MFP-4主要含有Glc，Gal，Rham，GalUA，Ara，GlcUA，其摩爾比為47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1。由結(jié)果可知，MFP-1中主要由5種中性單糖組成，這與上述結(jié)果MFP-1為中性多糖一致。值得注意的是，MFP-3和MFP-4除了含有半乳糖醛酸和半乳糖等單糖外，還含有一定比例的葡萄糖，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的果膠的理化性質(zhì)（一般果膠物質(zhì)含有很少比例的葡萄糖）有較大的差異[15]。

2.2.4 紅外分析 MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4均出現(xiàn)了多糖特征吸收峰，4種多糖均在3 400 cm^-1附近出現(xiàn)較強(qiáng)的寬吸收峰，應(yīng)是糖類的O-H和蛋白質(zhì)的N-H伸縮振動，說明多糖存在分子間或分子內(nèi)氫鍵；在2 925，2 930，2 935，2 944 cm^-1附近出現(xiàn)了弱吸收峰，是糖類不對稱C-H伸縮振動；在1 615，1 636，1 635 cm^-1處出現(xiàn)寬吸收峰是-COO-非對稱伸縮振動，在1 415 cm^-1附近出現(xiàn)吸收峰，應(yīng)是-COO-對稱伸縮振動；在1 300～1 000 cm^-1處出現(xiàn)吸收峰是吡喃環(huán)的伸縮振動，因此，可以推測4種多糖是吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)[16]，見圖3。MFP-3和MFP-4多糖在897 cm^-1處出現(xiàn)吸收峰，推測這2種多糖含有β-糖苷鍵[17]。

2.2.5 相對分子質(zhì)量測定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)多糖相對分子質(zhì)量的計(jì)算公式lgMw =-0.41tR+6.77，其中tR為保留時(shí)間。在相同條件下測定MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4的相對分子質(zhì)量，MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4的保留時(shí)間分別為11.512，11.366，10.902，11.000 min，將其代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，得各多糖的平均相對分子質(zhì)量分別為112.2，128.8，199.5，181.9 kDa。

2.2.6 各組分桑椹多糖對ADH的激活作用 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，桑椹多糖分離的4種組分對ADH均有不同程度的激活作用。當(dāng)ADH激活率為50%時(shí)，陽性對照（硫普羅寧，聯(lián)苯雙酯）及4種多糖（MFP-1，MFP-2，MFP-3，MFP-4）的質(zhì)量濃度分別為16.7，9.3，14.1，16.6，10.3，18.6 mg·L^-1，ADH激活能力順序?yàn)槁?lián)苯雙酯>MFP-3>MFP-1>MFP-2>硫普羅寧>MFP-4，其中MFP-1，MFP-2和MFP-3對ADH激活作用均大于陽性對照硫普羅寧對ADH激活作用，并且MFP-3與陽性對照聯(lián)苯雙酯對ADH的激活作用相當(dāng)，表明MFP-3具有很好的解酒護(hù)肝的應(yīng)用前景。

3 討論

桑椹多糖經(jīng)提取、除蛋白及純化，得到4組多糖（MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4），綜合上述結(jié)果，MFP-1屬于中性多糖，MFP-2屬于微酸性多糖，含有總糖量最高，MFP-3屬于酸性多糖，含有較多的糖醛酸，MFP-4屬于酸性多糖，含有的糖醛酸最高，并且這些多糖在除去游離蛋白后仍然檢測到含有少量蛋白質(zhì)，說明這4種多糖可能是蛋白質(zhì)的結(jié)合物。

柱前衍生化HPLC法，具有分離效果好、分析時(shí)間短、分析成本低和產(chǎn)物無立體結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過PMP柱前衍生化HPLC色譜、紅外光譜及高效凝膠滲透色譜對桑椹多糖各組分的單糖組成、結(jié)構(gòu)及分子量測定。初步推測4種多糖是含有吡喃環(huán)的多糖，MFP-3和MFP-4是含有β-糖苷鍵和糖醛酸的多糖。

人體攝入乙醇后，90%～98%的乙醇在肝臟代謝，乙醇代謝的途徑之一是乙醇通過激活體內(nèi)ADH，將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，從而降低體內(nèi)酒精含量。ADH激活率可能與多糖中單糖組成、苷鍵類型、連接順序、分枝情況、二級結(jié)構(gòu)等有關(guān)。當(dāng)ADH激活率為50%時(shí)，MFP-3的效果明顯高于陽性對照硫普羅寧，且與陽性對照聯(lián)苯雙酯的效果相當(dāng)。結(jié)合桑椹多糖的理化性質(zhì)、單糖組成和結(jié)構(gòu)不同的分析，ADH激活率可能與各組分多糖中所含的單糖種類和比例有關(guān)。MFP-3中半乳糖醛酸的量為27.5%，比MFP-2與MFP-4中含半乳糖醛酸分別高出15.3%和8.7%，這說明ADH激活率可能與其糖醛酸的種類和糖醛酸連接位點(diǎn)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)為研究多糖結(jié)構(gòu)與ADH活性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]