陳康勇 彭芳 薛竣仁 鐘為銘 高志鵬

摘要 [目的]研究單增李斯特氏菌生物膜的形成特性。[方法]采用24孔板法培養(yǎng)生物膜，分別采用結(jié)晶紫染色法和光學(xué)顯微鏡進(jìn)行生物膜的定量和定性研究，觀察在不同培養(yǎng)時(shí)間（8、16、24、32、40、48 h）單增李斯特氏菌生物膜的形成狀況。[結(jié)果]隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，單增李斯特氏菌生物膜生物量逐漸增加，生物膜經(jīng)歷了黏附、微菌落形成、大菌落形成到成熟的全部過(guò)程。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為單增李斯特氏菌生物膜相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；生物膜；形成特性

Biofilm Formation Characteristics of Listeria monocytogenes

CHEN Kang-yong1，PENG Fang1，XUE Jun-ren1，GAO Zhi-peng1，2* et al （1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128； 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde，Hunan 415000）

Abstract [Objective]The aim was to investigate the biofilm formation characteristics of Listeria monocytogenes. [Method]To investigate the characteristics of Listeria monocytogenes biofilm at different incubation times （8，16，24，32，40，48 h），24-well plate method was used to cultivate biofilm，and quantitative and qualitative data were obtained by crystal violet staining assay and light microscopy.[Result]With the increase of culture time，the biomass of Listeria monocytogenes biofilm increased gradually，and the biofilm went through the process of adhesion，microcolony formation，macrocolony formation to mature.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the related research of Listeria monocytogenes biofilm.

Key words Listeria monocytogenes；Biofilm；Formation characteristics

生物膜（BF）是細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境，黏附于非生物或者活性組織的表面，包被于自身分泌的胞外基質(zhì)中，形成的一種三維聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)菌生物膜是一種和浮游生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式[1-3]。生物膜參與65%以上的感染，尤其是與醫(yī)療器械相關(guān)的、機(jī)體表面的（如皮膚、軟組織等）和慢性感染，原因主要是生物膜對(duì)宿主防御和抗菌藥物具有很強(qiáng)的抵御能力[4-6]。生物膜是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因，可使細(xì)菌的耐藥性提高10～1 000倍[7-8]。生物膜感染已成為全球關(guān)注的問(wèn)題。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種能在冷藏的溫度下進(jìn)行繁殖的致病菌，由于該細(xì)胞的苯酚-水浸出物能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞生成，所以被命名為“單核增生細(xì)菌”[9]。人或者牲畜感染之后主要表現(xiàn)出敗血癥、胃腸炎、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀[10]。嬰幼兒、老年人以及免耐受病人的臨床死亡率約為30%[11]。該菌種在自然界廣泛存在，對(duì)于不利的生長(zhǎng)環(huán)境條件具有很強(qiáng)的耐受能力，在4 ℃冰箱中可生長(zhǎng)繁殖，所以各類冷凍食品均成為被感染對(duì)象，如肉制品、奶制品、冰激凌等[12]。在對(duì)含有單增李斯特氏菌的乳制品進(jìn)行超高壓處理研究中發(fā)現(xiàn)，在500 MPa、10 min、20 ℃下處理乳制品，雖然能夠降低其單增李斯特氏菌活菌量，但仍有細(xì)菌存活并繁殖[13]。同時(shí)，單增李斯特氏菌對(duì)水產(chǎn)品也具有較高的污染程度[14-15]。單增李斯特氏菌所產(chǎn)生的生物膜可保護(hù)其不受抗菌藥物作用，并且能降低機(jī)體免疫細(xì)胞的吞噬作用。試驗(yàn)表明，在任何溫度條件下，單增李斯特氏菌可在固體表面形成生物膜，并且能夠在很長(zhǎng)時(shí)間黏附于固體表面，其生物膜的形成引起了食品、用品衛(wèi)生安全的隱患[16]。

單增李斯特氏菌生物膜所導(dǎo)致的相關(guān)性疾病患病率逐年上升，至今很少有藥物能有效控制該類感染，深入研究單增李斯特氏菌生物膜形成特性，對(duì)于尋找有效的防治藥物和方法具有重要意義。筆者研究了單增李斯特氏菌生物膜的形成過(guò)程，以期為單增李斯特氏菌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（編號(hào)：ATCC19115），購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.1.2 主要試劑。LB肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、技術(shù)瓊脂粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、0.1%結(jié)晶紫溶液（Sigma公司）、95%乙醇溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛（Sigma公司）。

1.1.3 主要儀器。

熒光多功能酶標(biāo)儀、光學(xué)顯微鏡、24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、高壓滅菌鍋和高速彩色平臺(tái)掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特氏菌生物膜培養(yǎng)。

采用24孔板法，具體操作：取單個(gè)單增李斯特氏菌菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取10 μL 菌液轉(zhuǎn)接至預(yù)先加入無(wú)菌蓋玻片（12 mm）和2 mL 新鮮LB培養(yǎng)液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)單增李斯特氏菌生物膜形成特性的影響。

按培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置8、16、24、32、40、48 h 6個(gè)試驗(yàn)組，每組分別做6個(gè)平行，按照“1.2.1”進(jìn)行生物膜培養(yǎng)，在上述時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行結(jié)晶紫染色試驗(yàn)和顯微鏡觀察。

1.2.3 單增李斯特氏菌生物膜結(jié)晶紫染色試驗(yàn)。

利用生物膜內(nèi)物質(zhì)可與特殊染料結(jié)合的原理，通過(guò)染色的方法對(duì)生物膜進(jìn)行定性或定量分析。單增李斯特氏菌生物膜形成后，將24孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸出培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS浸洗蓋玻片3次，然后用4%多聚甲醛固定20 min，棄固定液，并用無(wú)菌PBS浸洗3次，洗去浮游菌，使黏附在蓋玻片的生物膜自然風(fēng)干，室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，吸除染色液后，用無(wú)菌PBS浸洗3次，自然風(fēng)干，然后用高速彩色平臺(tái)掃描儀掃描拍照。

1.2.4 單增李斯特氏菌生物膜生物量的測(cè)定。

單增李斯特氏菌生物膜形成后，吸出培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS浸洗蓋玻片3次，每孔加入200 μL 95%乙醇，置于搖床30 min使結(jié)晶紫完全溶解，溶解液轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，即OD540，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 顯微鏡觀察單增李斯特氏菌生物膜。

方法同“1.2.3”，結(jié)晶紫染色后，用無(wú)菌PBS浸洗蓋玻片3次，然后置于100倍油鏡下觀察生物膜的形成狀況，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間下單增李斯特氏菌生物膜結(jié)晶紫染色結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特氏菌生物膜的形成分為4個(gè)階段，即黏附階段、微菌落形成階段、大菌落形成階段和成熟階段。①黏附階段（0～16 h）：細(xì)菌逐漸聚集并黏附于介質(zhì)（蓋玻片）表面，生物膜形成速度較慢；②微菌落形成階段（17～24 h）：生物膜結(jié)晶紫染色較淺，微菌落開始形成，并呈斑塊狀分布；③大菌落形成階段（25～32 h）：細(xì)菌聚集明顯，生物膜斑塊變大，32 h時(shí)布滿蓋玻片，結(jié)晶紫染色加深；④成熟階段（33～48 h）：結(jié)晶紫染色比前32 h明顯加深，生物膜斑塊更加密集，厚度增大，40 h時(shí)生物膜基本形成，33～48 h形成的生物膜的OD540快速增長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，單增李斯特氏菌的生物膜呈現(xiàn)出從黏附聚集到成熟的過(guò)程，于48 h達(dá)到最成熟的狀態(tài)（圖1、2）。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間下單增李斯特氏菌生物膜顯微觀察結(jié)果

①黏附階段：在物鏡為100倍的顯微鏡下可觀察到生物膜的厚度小，菌落間的通道多，說(shuō)明生物膜形成并不成熟。②微菌落形成階段：微菌落開始形成，生物膜斑塊數(shù)量增多，生物膜的厚度開始增加，菌落間通道變少。③大菌落形成階段：結(jié)晶紫染色變深，開始形成較為致密的生物膜，但生物膜斑塊比較分散，菌落間通道繼續(xù)變少。④成熟階段：生物膜斑塊大量增加并且形成了牢固、穩(wěn)定的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，生物膜厚度明顯增加，染色顯著加深，培養(yǎng)至48 h時(shí)生物膜極厚，菌落之間幾乎沒有通道，生物膜完全成熟（圖3）。可見，生物膜形成期間，菌落間的通道不斷減少，生物膜斑塊逐漸增加并且密集，生物膜的厚度逐漸增加，并趨于成熟。

3 討論

細(xì)菌生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，生物膜對(duì)營(yíng)養(yǎng)因子的通透性變差，同時(shí)細(xì)菌也開始老化甚至失去了成膜能力。進(jìn)入成熟期后，隨著生存環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)等限制因子的消耗以及代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)菌的生長(zhǎng)開始受到限制，生物膜的形成達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，此時(shí)生物膜的厚度基本穩(wěn)定。進(jìn)入衰老期后，伴隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，生物膜中細(xì)菌的大部分蛋白質(zhì)和RNA的合成速率降低，致使胞外多糖的合成量減少，生物膜的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)崩解甚至細(xì)菌也開始從生物膜表面脫落，再次成為游離菌，使生物膜的厚度減少。

單增李斯特氏菌生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多種蛋白、核酸分子和多糖等因素，同時(shí)也受到各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共同作用。深入研究單增李斯特氏菌生物膜的形成和調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)尋找特異性干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。該試驗(yàn)?zāi)壳爸皇茄芯颗囵B(yǎng)時(shí)間對(duì)單增李斯特氏菌生物膜形成的影響，主要是通過(guò)觀察細(xì)菌生物膜的形成情況來(lái)說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物膜的影響，后續(xù)試驗(yàn)還可研究環(huán)境因素對(duì)單增李斯特氏菌生物膜基質(zhì)組成的影響，通過(guò)觀察環(huán)境因素對(duì)生物膜中蛋白質(zhì)、胞外多糖、胞外DNA組成的影響，進(jìn)一步探究單增李斯特氏菌生物膜的形成機(jī)制。

4 結(jié)論

采用24孔板法和結(jié)晶紫染色法研究單增李斯特氏菌生物膜的形成過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在靜置培養(yǎng)條件下的單增李斯特氏菌生物膜的形成經(jīng)歷了4個(gè)階段，0～16 h為細(xì)菌黏附階段，17～24 h為微菌落形成階段，25～32 h為大菌落形成階段，33～48 h為成熟階段。細(xì)菌黏附階段，菌落間的通道多，形成生物膜速度慢。微菌落形成階段，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物膜結(jié)晶紫染色顏色變深，細(xì)菌開始形成微菌落，但形成速度較慢，并開始形成生物膜斑塊。大菌落形成階段，細(xì)菌形成的大量微菌落聚集成大菌落，生物膜斑塊增大，開始形成較為致密的生物膜，結(jié)晶紫染色快速變深。成熟階段，生物膜斑塊快速增大并且密集，形成了具有牢固、穩(wěn)定的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)的生物膜，菌落間的通道不斷減少。培養(yǎng)48 h期間，單增李斯特氏菌生物膜的生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大，表明細(xì)菌生物膜的生長(zhǎng)經(jīng)歷了從黏附聚集到成熟的過(guò)程，在48 h生物膜生長(zhǎng)達(dá)到完全成熟的狀態(tài)。

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