鄧宇豪 曾國亮 李林鋒

摘要[目的]探討秋水仙堿處理誘導(dǎo)鴉膽子多倍體的可能性。[方法]以二倍體鴉膽子[Brucea javanica （L.）Merr.]為材料，用0.1%、 0.3% 、0.5%和1.0%的秋水仙堿對幼苗莖尖生長點進行點滴處理，研究其對鴉膽子生長的影響。[結(jié)果]0.1%、0.3%、0.5%、1.0%秋水仙堿處理不同程度地抑制了鴉膽子幼苗植株的生長速度，與對照植株相比，分別平均降低8.3%、36.4%、37.0%和55.4%。各處理鴉膽子幼苗葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞縱徑、橫徑、周長、等視野氣孔數(shù)及葉綠粒數(shù)間存在顯著差異；隨處理濃度的增加，葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)減少，氣孔變大，葉綠粒數(shù)增多。秋水仙堿頂芽生長點誘變處理后形成的瘤塊嚴(yán)重影響誘變新梢次年生長。[結(jié)論]鴉膽子幼苗生長點秋水仙堿誘變處理獲得多倍體植株的途徑不可行。

關(guān)鍵詞 鴉膽子；秋水仙堿；幼苗生長；多倍體誘導(dǎo)

中圖分類號 S723 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）02-0156-02

Abstract[Objective] To discuss the feasibility of inducing Brucea javanica polyploidy by colchicine.[Method] With diploid B. javanica seedlings as the experimental materials， 0.1%， 0.3%， 0.5% and 1.0% colchicine were used on the stem apex growing point to study the effect of colchicines on its growth.[Result] The results showed that colchicine treatment inhibits the growth of B. javanica seedlings at different levels. As compared with control， the plant height decreased averagely 8.3%， 36.4%， 37.0% and 55.4%， respectively. There was a significant difference among stomatal number at visual field， chloroplast number， the length， width and perimeter of guard cell of B. javanica seedlings. Stomatal number decreased， individual guard cell enlarged and chloroplast number increased with increasing concentration of colchicines. However， the mass located at the growing tip of bud after treatment affects the shoot growth of B. javanica seedlings seriously during the next year.[Conclusion] The way is not workable through the inducement of colchicine on growing tip of bud of B. javanica seedlings.

Key words Brucea javanica；Colchicines；Seedling growth；Polyploidy induction

鴉膽子[Brucea javanica （L.）Merr.]是苦木科鴉膽子屬常綠灌木或小喬木，又名苦參子、老鴉膽、苦棒子等，始載于《本草綱目拾遺》，主要分布于海南、廣東、廣西和云南等地。鴉膽子性寒，味苦，具有清熱解毒、截瘧、止痢、腐蝕贅疣的功效，為我國傳統(tǒng)中藥[1-2]。自1973年Kupchan等[3]從苦木科植物抗痢鴉膽子的莖皮醇提取物中分離得到對人體鼻咽癌（KB）、P-388白血病及L1210淋巴白血病有較強抑制作用的活性成分鴉膽?。˙ruceantin）和鴉膽醇（Bruceantinol）后，引起了人們對苦木科植物抗腫瘤活性成分研究的極大關(guān)注，鴉膽子也不例外。到目前為止，從鴉膽子種子（果實）、根、莖（莖皮）、枝葉及花中已發(fā)現(xiàn)了153種化學(xué)成分[4]，主要有苦木內(nèi)酯、生物堿、三萜和脂肪酸等。其中四環(huán)三萜苦木內(nèi)酯類化合物是鴉膽子植物的特征性成分，具有殺蟲止痢、抗瘧、抗腫瘤、抗白血病、抗病毒、抗食素、抗炎以及降低血糖等多種生物活性[5]。雖然鴉膽丁具有較強的抗L1210淋巴白血病、抗Lewis肺癌及B16黑色素瘤的作用，但其在抗痢鴉膽子莖皮中含量為0.02 %[6]，分離和提純都比較困難。如何開發(fā)更高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、更適合工業(yè)化生產(chǎn)的藥用植物種質(zhì)資源以滿足人們對醫(yī)療保健方面的需求就顯得越發(fā)必要和迫切。但鑒于藥用植物的特殊性，無論何種用途，對其成分穩(wěn)定性的要求均比糧食和香料等植物高[7]，這無疑給藥用植物的育種工作提出了更高的要求。

多倍體植物染色體數(shù)量增多，有多套基因，新陳代謝旺盛，酶活性增強，從而提高了蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、植物堿、單寧等的合成速率[8]。生產(chǎn)實踐發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)藥用植物多倍體化后其藥用有效活性含量增加。如四倍體白芷藥材中歐前胡素含量較二倍體增加了104.4%[9]；四倍體藥用薯蕷中的薯蕷皂苷元含量比二倍體對照提高了20.0%[10]；多倍體杜仲幼苗中綠原酸含量較正常植株幼苗提高了17.78%[11]。雖然傳統(tǒng)上鴉膽子以種子入藥，其脂溶性成分鴉膽子油制劑已廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤的輔助治療，但其同樣具有較強抗腫瘤活性的水溶性苦木內(nèi)酯類成分如鴉膽丁、鴉膽苦醇（brusatol）和鴉膽子苦素D（bruceine D）也有望應(yīng)用于臨床，成為新的化療藥物[12]。鑒于此，筆者以鴉膽子實生幼苗為材料，研究秋水仙堿莖端生長點點滴處理對其生長的影響，為鴉膽子多倍體育種方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鴉膽子種子采集于廣東海洋大學(xué)后山交椅嶺周邊野生多年生鴉膽子母樹，種子除去果肉，洗凈陰干后用層積催芽法催芽。種子發(fā)芽（露白）后將其移栽到營養(yǎng)缽中，土壤為學(xué)校園林試驗基地田園土。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計。

營養(yǎng)缽中的鴉膽子出土后待其子葉展開頂端分生組織剛剛開始萌動時，將脫脂棉球放在試材的生長點上，用針管將秋水仙素溶液滴在脫脂棉上，每次20 μL（藥液呈水珠狀而不滴落）[13]，秋水仙素濃度設(shè)0.1%、 0.3% 、0.5% 和1.0% 4個水平，每天07：00—08：00、18：00—19：00各處理1次，連續(xù)處理3 d，每處理20株幼苗，重復(fù)3次，以點滴蒸餾水為對照。達到處理時間后用清水將藥液沖洗干凈。所有處理植物均放在室外露天培養(yǎng)，自然光照，保證水肥充足。

1.2.2 測定內(nèi)容。

1.2.2.1

形態(tài)指標(biāo)觀察。試驗幼苗生長60 d后，測定幼苗株高，以植株生長緩慢、葉片變寬或增厚、葉片皺縮、畸形或質(zhì)地粗糙等為形態(tài)變異標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計形態(tài)變異率。

1.2.2.2

氣孔保衛(wèi)細(xì)胞大小測定。10：00左右，取各處理植株葉片，用鑷子撕下下表皮置于載玻片上，用碘-碘化鉀溶液染色，制成片后在顯微鏡下觀測。各處理葉片隨機選取10個氣孔器，分別測定氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的縱徑和橫徑、保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠粒數(shù)，并隨機取10個視野（10×40倍鏡下）測量氣孔器密度。由于在顯微鏡下觀察到鴉膽子幼苗葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞為腎形，兩邊對稱，氣孔外緣清晰，呈橢圓形，故鴉膽子葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞外圍周長值則利用橢圓周長的近似計算公式L=1.57×[1.5×（A+B）-（A-B）1/2] 來計算[14]，式中，A、B分別代表整個氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的縱、橫徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用SPSS 19.0軟件對所有觀測數(shù)據(jù)進行方差和多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙堿處理對鴉膽子植株的影響

由表1可知，不同濃度秋水仙堿生長點處理后，對鴉膽子幼苗葉長、葉寬、葉長/葉寬、葉厚、株高的影響差異顯著。秋水仙堿處理幾乎不同程度地抑制了鴉膽子幼苗植株的生長速度，與對照植株相比，1.0%處理幼苗株高生長受抑制最嚴(yán)重，僅為對照植株高度的55.4%，其次為0.5% 和 0.3%處理，植株高度分別降低37.0%和 36.4%，0.1%處理影響較小。大部分生長點處理幼苗植株新長出的葉子形態(tài)發(fā)生了明顯變化，葉片出現(xiàn)皺縮、粘合或畸形。經(jīng)統(tǒng)計，發(fā)生葉形變化的植株在0.1%、0.3%、0.5%和1.0%處理水平的變異率分別為36.2%、50.0%、76.7%和86.7%；對照處理并無變異植株。由于葉片皺縮或畸形，故葉長和葉寬均有影響，隨處理濃度的增加，葉寬比逐漸減??；且誘變?nèi)~葉片厚度較對照顯著加厚。

2.2 不同濃度秋水仙堿處理對鴉膽子幼苗葉片氣孔的影響

從圖1可看出，秋水仙堿處理對鴨膽子幼苗葉片氣孔器的密度、大小等特征均產(chǎn)生影響。各處理鴉膽子幼苗葉片的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞在縱徑、橫徑、周長、等視野氣孔數(shù)上均具有顯著差異（P<0.05）。與對照相比，隨著秋水仙堿濃度的增加，鴉膽子幼苗葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞顯著增大，1.0%處理增幅最大，其葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞縱徑、橫徑和周長分別比對照增加26.4%、19.5%和56.4%；與此相反，等視野氣孔數(shù)隨處理濃度的增加顯著減小。與對照相比，1.0%處理等視野氣孔數(shù)減小最大，其葉片氣孔數(shù)僅為對照的45.2%。同樣，隨著秋水仙堿濃度的增加，鴉膽子幼苗葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠粒數(shù)顯著增多，但0.1%、0.3%處理與對照之間差異不顯著；1.0%處理葉綠粒數(shù)較對照增加近1倍，其次為0.5%處理，較對照增加33.8%，低濃度處理葉片氣孔葉綠粒數(shù)與對照差異不顯著（表2）。

3 討論與結(jié)論

不同濃度的秋水仙堿處理對鴉膽子的生長造成很大影響，不僅幼苗株高生長受抑制而變矮，葉片皺縮變寬或增厚，且隨秋水仙堿處理濃度的增加，葉片氣孔變大，氣孔數(shù)減少。有研究認(rèn)為，多倍體較直觀粗放的鑒定方法主要以受處理材料幼苗的子葉和真葉是否發(fā)生畸形、皺縮、增厚、葉色加深，中胚軸是否腫大變粗，植株生長是否受到抑制等標(biāo)準(zhǔn)來判斷[15]，而氣孔大小、密度，保衛(wèi)細(xì)胞的長度、寬度和葉綠粒的數(shù)目可作為多倍體鑒定的間接指標(biāo)[16]，植物葉片氣孔大小、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠粒數(shù)與植株的染色體倍性存在明顯的相關(guān)性，葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠粒數(shù)隨染色體倍性的增高而增加，不同染色體倍性間氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)差異顯著[17]。該試驗0.5% 和1.0%濃度的秋水仙堿處理條件下，鴉膽子幼苗的葉片形態(tài)變異率較高，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長較大，葉綠粒數(shù)較多，但由于未進行細(xì)胞學(xué)鑒定，各誘變植株的染色體是否加倍，需要進一步研究。但秋水仙堿對鴉膽子幼苗的毒害作用比較大，尤其是隨著處理濃度的增大，抑制生長的效果越大。藥劑處理后，莖端生長點愈傷組織隆起、膨大形成瘤塊，著生其上的誘變新芽和枝條早期生長比較緩慢，在處理當(dāng)年秋季落葉后，次年春季則逐漸干枯死亡，嚴(yán)重影響對誘變植株的進一步篩選和培育。由此可見，鴉膽子通過秋水仙堿幼苗頂芽誘變處理獲得多倍體的途徑不可行。

參考文獻

[1] 楊峰，于江，王鳳禮，等.鴉膽子的研究概況[J].黑龍江醫(yī)藥，1998，11（2）：112-113.

[2] 丁晨旭，索有瑞.中藥鴉膽子化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進展[J].中成藥，2006，28（1）：117-120.

[3] KUPCHAN S M，BEAR A，KUOHSING，et al.Bruceantin，a new polent antieukemic simaroubolide from Brucea antidysenterica.[J].Journal of organic chemistry，1973，38（3）：178.

[4] ZHAO L J，LI C，ZHANG Y，et al.Phytochemical and biological activities of an anticancer plant medicine：Brucea javanica[J].Anticancer agents in medicinal chemistry，2014，14（3）：440-458.

[5] 周中流，梁燕君，黃詩瑤，等.鴉膽子屬植物苦木內(nèi)酯類化合物的研究進展[J].中成藥，2013，35（5）：1040-1046.

[6] 李銑.鴉膽丁及有關(guān)苦木內(nèi)脂的抗腫瘤活性[J].沈陽藥學(xué)院學(xué)報，1978（10）：28-37.

[7] 何韓軍，楊躍生，吳鴻.藥用植物多倍體的誘導(dǎo)及生物學(xué)意義[J].中草藥，2010，46（6）：1000-1006.

[8] 李鐵軍，王麗珍，杜雪.藥用植物多倍體的研究概況[J].中藥材，2009，32（9）：1481-1485.

[9] 彭菲，張勝，劉塔斯，等.四倍體白芷藥材中歐前胡素的含量測定[J].中國中藥雜志，2002，27（6）：426-427.

[10] 劉選明，李光明，秦玉芝，等.藥用薯蕷高皂素新種質(zhì)選育的研究[J].湖南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，31（3）：19-22.

[11] 王躍華.杜仲種子的多倍體誘導(dǎo)研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2006（8）：73-76.

[12] 趙麗娟.鴉膽子化學(xué)成分及生物活性研究[D].濟南：山東大學(xué)，2014：19-21.

[13] 童俊.秋水仙素誘導(dǎo)紫薇多倍體的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：10-12.

[14] 張菊平，周快索，鞏振輝，等.用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長鑒定辣椒植株的倍性[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，16（2）：133-135，141.

[15] 王真，陳道明，李春燕，等.半支蓮多倍體誘導(dǎo)的初步研究及鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（8）：74 -77.

[16] 王艷英，鄧傳遠(yuǎn)，趙曉明，等.秋水仙素處理對連翹生長的影響[J].蚌埠學(xué)院學(xué)報，2014，3（1）：20-23.

[17] 姚焱，李巖松，王藝霖，等.利用何首烏葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目鑒定植株倍性[J].中藥材，2014，37（6）：939-942.