余興 丁偉 王蕾

摘要[目的]克隆杜梨硝酸鹽高親和性轉(zhuǎn)運酶NRT2基因。[方法]以杜梨葉片為試驗材料，采用CTAB法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運用3′-RACE和5′-RACE技術(shù)，克隆獲得杜梨硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶NRT2基因的全長，并運用生物信息學(xué)技術(shù)對硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶NRT2基因進(jìn)行了分析。[結(jié)果]杜梨硝酸鹽轉(zhuǎn)運NRT2基因cDNA全長為1 422 bp，可編碼473個氨基酸，分子式為C2346H3631N589O637S26，相對分子質(zhì)量為51 112.7，等電點（pI）為7.03。[結(jié)論]該試驗為進(jìn)一步研究梨氮素代謝提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞 杜梨；硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶基因；克隆

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）02-0161-03

Abstract[Objective] To clone the highaffinity nitrate transporter gene NRT2 of Pyrus betulaefolia Bunge.[Method] The leaves of P.betulaefolia Bunge were used as materials，total RNA was extracted by CTAB method，then the RNA was reversetranscribed into the cDNA，and the full nitrate transporter gene NRT2 was cloned by 3′RACE and 5′RACE technique.The NRT2 gene were analyzed by bioinformatics techniques.[Result] The cDNA fulllength of the nitrate transporter NRT2 gene was 1 422 bp，encoding 473 amino acids，molecular formula was C2346H3631N589O637S26，molecular weight was 51 112.7，and isoelectric point （pI） was 7.03.[Conclusion] This study provides basic data for further research on nitrogen metabolism in pear.

Key words Pyus betulaefolia Bunge；Nitrate transfer enzyme gene；Cloning

氮是植物生長的三大營養(yǎng)元素之一，廣泛地參與植物生長、發(fā)育的全部過程[1]。植物從土壤中吸收的氮素主要來自土壤中的硝酸鹽類化合物，而吸收氮素的主要部位是植物根表皮細(xì)胞[2]。植物根表皮細(xì)胞上有NO3-高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和低親和系統(tǒng)，高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在NO3-濃度為0.2～0.5 mmol/L時發(fā)揮作用，而在NO3-濃度高于0.5 mmol/L時主要是低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)發(fā)揮作用[3-5]。2條轉(zhuǎn)運途徑能夠保證植物較好地利用土壤中的硝酸鹽類化合物，從而減少因為土壤硝酸鹽濃度過大或過小對植物造成傷害。

我國是梨的第一大生產(chǎn)國，2012年栽培面積達(dá)108.9 hm2，占世界梨樹栽培面積的70.0%，產(chǎn)量1 707.3萬t，達(dá)世界總產(chǎn)的69.0%[6]。在我國梨主產(chǎn)區(qū)，如西北地區(qū)、黃河古道地區(qū)等，多為堿性土壤，多數(shù)品種都是用杜梨（Pyus betulaefolia Bunge）作為砧木，因此研究杜梨硝酸鹽高親和性轉(zhuǎn)運酶有重要意義。氮素在梨樹器官中轉(zhuǎn)移的主要存在形式是硝酸根和銨根，其中硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶基因在植物體內(nèi)硝酸根的轉(zhuǎn)移與吸收中起重要作用。目前，國內(nèi)外關(guān)于杜梨硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶NRT2基因研究還未見報道，該試驗擬克隆硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶基因，以期為今后開展梨樹氮素吸收與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 杜梨組培苗的幼嫩葉片，加液氮處理，研磨成粉末，保存在-80℃冰箱中備用。

1.2 儀器 DYY-6型水平雙穩(wěn)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、DU800分光光度計、WH-1微型漩渦混合儀、LX-200迷你離心機、Biometra PCR擴增儀、冷凍高速離心機、化水機等。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取。采用改良CTAB法提取總RNA[7]。

1.3.2 RNA反轉(zhuǎn)錄。將提取的總RNA用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3.3 NRT2基因克隆。從基因庫中查找到梨的硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶基因相關(guān)序列，并在其保守區(qū)域使用軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計（表1）。

3′-RACE和5′-RACE按試劑盒操作步驟進(jìn)行，經(jīng)測序、剪接、拼接后獲得NRT2基因的cDNA全長序列。

1.3.4 生物信息學(xué)分析。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)在線分析，http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/；疏水性分析，http：//www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl，參數(shù)選擇，Hphob./ Kyte & Doolittle；磷酸化位點分析，http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/；亞細(xì)胞定位分析，http：//psort.hgc.jp/form.html；氨基酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測運用PBIL LYON-GERLAND數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線分析，http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及cDNA檢測 從圖1可以看出，提取的總RNA有很明顯的2個條帶，分別是28S和18S，從亮度上可以判斷28S帶比18S帶亮2倍左右，且2個條帶后面都沒有拖帶現(xiàn)象，說明RNA沒被降解，完整性較好。

2.2 NRT2基因的克隆

以杜梨cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果如圖2所示，獲得了1條400 bp左右的條帶，經(jīng)測序，NRT2基因片段大小為403 bp，與蘋果的MdNRT2.7（Accession：XM_008359511）相似性達(dá)90.58%。

用NRT2PR1 out primer與3′-RACE Outer Prime進(jìn)行第1輪擴增，以其PCR產(chǎn)物為模板，用NRT2PR1 inner primer和3′-RACE Inner Primer為引物進(jìn)行第2輪擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，得到大小為744 bp NRT2的3′-RACE序列（圖3）。

用5′-NRT2O與UPM Long進(jìn)行第1輪擴增，以其PCR產(chǎn)物為模板，用5′-NRT2I與UPM Short作為引物進(jìn)行第2輪擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，得到大小為313 bp NRT2的5′-RACE序列（圖4）。

2.3 杜梨硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶NRT2基因生物信息學(xué)分析

將NRT2基因擴增片段序列、3′-RACE和5′-RACE序列拼接，基因全長1 460 bp，其中編碼序列長為1 422 bp，編碼473個氨基酸序列。在GenBank上進(jìn)行Nucleotide Blast比對，與MdNRT2.7硝酸鹽轉(zhuǎn)運基因相似性最高，達(dá)99%。

將試驗得到的NRT2氨基酸序列與基因庫中其他植物的轉(zhuǎn)運硝酸鹽蛋白進(jìn)行多重氨基酸序列對比，結(jié)果表明杜梨NRT2蛋白與蘋果MdNRT2.7蛋白相似度最高（圖5），達(dá)94.28%。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，杜梨NRT2蛋白首先與蘋果MdNRT2.7蛋白聚為一類（圖6），因此，克隆的NRT2基因就是杜梨硝酸鹽轉(zhuǎn)運基因，將其命名為PbeNRT2。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)在線分析結(jié)果表明，分子式為C2 346H3 631N589O637S26，相對分子質(zhì)量為51 112.7，等電點（pI）為7.03。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，亮氨酸Leu（12.9%）是含量最高的氨基酸，其次為甘氨酸Gly（9.5%）、丙氨酸Ala（9.3%），最低的是組氨酸His（1.5%）。

蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果表明，親水性最強的氨基酸是分值為-2.589的第239位谷氨酸Glu，疏水性最強的氨基酸是分值為3.011的第345位亮氨酸Leu。蛋白質(zhì)磷酸化位點分析結(jié)果表明，蛋白激酶的磷酸化位點可能是1個絲氨酸Ser、1個蘇氨酸Thr和2個酪氨酸Tyr。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，該蛋白定位于葉綠體基質(zhì)的概率為60.0%，定位于葉綠體類囊體膜的概率為45.8%，定位于高爾基體的概率為40.0%，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率為36.0%，推測該蛋白定位于葉綠體的概率最大。蛋白預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋（54.12%）、無規(guī)則卷曲（36.58%）和延伸鏈（9.30%）組成。

3 討論

根據(jù)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的不同可以將植物NO3-轉(zhuǎn)運蛋白基因分為低親和NO3-轉(zhuǎn)運家族（NRT1）和高親和NO3-轉(zhuǎn)運家族（NRT2和NAR2）[8-10]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtNRT1家族共有53個成員[11]，參與NO3-轉(zhuǎn)運蛋白基因主要是AtNRT1.1、AtNRT1.2[12-13]。NRT1.1編碼1個受硝酸鹽誘導(dǎo)的雙重親和的轉(zhuǎn)運蛋白，在低氮和高氮條件下均能較好地吸收NO3-[14]。而NRT1.2編碼的是典型的低親和轉(zhuǎn)運蛋白，主要在根系表皮細(xì)胞中表達(dá)，在高NO3-濃度下起作用[15]。NRT2在擬南芥有7個家族基因，其中起主要作用的轉(zhuǎn)運蛋白基因是AtNRT2.1和AtNRT2.2[16]。NRT2.1和NRT2.2是植物重要的NO3-轉(zhuǎn)運蛋白基因，在低氮條件下，調(diào)控植物根系吸收NO3-[17]。該研究克隆的杜梨PbeNRT2為高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶基因，對于低濃度的NO3-起作用，為今后開展梨樹根系氮素的高效利用和分子機理研究提供了基礎(chǔ)資料。

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