林建城， 許恒棋， 羅新明

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100)

中國鱟內(nèi)臟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)?

林建城， 許恒棋， 羅新明

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100)

以中國鱟(Tachypleustridentatus)內(nèi)臟為材料，分別通過30%和80%飽和度(NH4)2SO4沉淀分級分離、葡聚糖凝膠柱Sephadex G-200層析、以及離子交換柱DEAE-32層析，從而獲得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)，經(jīng)PAGE檢定達(dá)到電泳純，酶的比活力為505.21 U/mg。SDS-PAGE顯示一譜帶，測得該酶蛋白亞基分子量為121.5 kDa，等電聚焦電泳法測得酶的等電點(diǎn)pI為6.01。以pNP-β-D-GlcNAc為底物，研究NAGase催化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：中國鱟NAGase的最適pH、最適溫度、Km和Vmax分別為5.4和55 ℃、0.421 mmol/L和13.158 μmol/L·min-1；酶在pH=4.5～7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，在20～50 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性。酶在276 nm波長處有紫外吸收峰，在232.2 nm波長的內(nèi)源熒光激發(fā)下，酶內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰在330.9 nm波長處。Na+，K+和Li+對NAGase活力沒有影響，Ca2+、Ba2+和Co2+對NAGase有不同程度的激活作用，Co2+對NAGase的激活作用較大，5 mmol/L Co2+能使NAGase活力提高41.67%；Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Pb2+、Ag+、Cd2+和Hg2+等10種金屬離子對NAGase活力有不同程度的抑制作用，5 mmol/L Cd2+可使酶活力喪失85.60%，而Hg2+對酶的抑制作用最強(qiáng)，0.1 mmol/L Hg2+可使酶活力喪失90.10%。EDTA對酶活力沒有影響，推斷中國鱟NAGase屬于非金屬酶類。

中國鱟；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)是幾丁質(zhì)酶系的一個重要組分成分，NAGase具有外切酶活力，對幾丁質(zhì)進(jìn)行外切為單體—β-N-乙酰葡萄糖胺，又能將外切幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)產(chǎn)生的幾丁二糖繼續(xù)降解為單體[1]。近幾年主要集中在對甲殼動物和節(jié)肢動物NAGase的研究。前已研究了凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)內(nèi)臟NAGase的酶學(xué)特性[2]，而樸順金等[3]對凡納濱對蝦外殼膜NAGase進(jìn)一步研究表明：對蝦外殼膜NAGase與對蝦蛻殼生長發(fā)育密切相關(guān)，不同生長期對蝦外殼膜NAGase含量存在較大的差異；顏雅雯等[4]分離到鋸緣青蟹(Scyllaserrata)內(nèi)表皮NAGase，發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹內(nèi)表皮NAGase活力變化的趨勢表現(xiàn)出一定的季節(jié)性規(guī)律；而Meyer等[5]研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦(Euphausiasuperba)在蛻殼前蝦體中蛻殼激素濃度升高，幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量也明顯增加。此外，Koga等[6]從家蠶(Bombyxmori)的表皮層和消化道中分別獲得NAGase，研究表明：來自家蠶表皮的NAGase與其周期性蛻皮生理、以及生活周期中蛹的形成有關(guān)，而家蠶內(nèi)臟NAGase的主要作用是降解消化道內(nèi)幾丁質(zhì)，與家蠶周期性蛻皮無關(guān)。此后，從菜青蟲(Pierisrapae)表皮中也分離到NAGase[7]，對菜青蟲NAGase的酶學(xué)性質(zhì)有了深入研究。這些研究結(jié)果顯示：節(jié)肢動物和甲殼動物的NAGase主要功能是降解消化道內(nèi)含幾丁質(zhì)的食物，并與其周期性蛻皮密切相關(guān)。

中國鱟(Tachypleustridentatus)是暖水性近海名貴珍稀節(jié)肢動物，是地球上最古老的物種之一，被稱為“活化石”，是具有很好藥用價值和重要科研意義的古老海洋底棲動物。但目前鱟資源不斷減少，成為了瀕危物種。究其原因，除了過度捕殺造成鱟資源嚴(yán)重衰減外，還由于近年來對海洋的過度開發(fā)利用，工業(yè)化不斷推進(jìn)使得沿海地區(qū)工業(yè)和生活污水及廢物大量排入大海，近海污染嚴(yán)重，直接威脅到鱟的生長發(fā)育和生存。在中國鱟的胚胎發(fā)育過程中，受精卵要經(jīng)過4次的胚內(nèi)蛻皮和2次的胚外蛻皮，才能孵化出幼鱟，每次蛻皮體長即增加約25%，從幼鱟到達(dá)性成熟，還要蛻皮13～14次。海洋環(huán)境因素變化會直接對鱟胚胎發(fā)育和幼體生長造成影響，已有海水中重金屬、溫度、鹽度等環(huán)境因素對中國鱟胚胎和幼體發(fā)育影響的報(bào)道[8,9]，但有關(guān)中國鱟幾丁質(zhì)酶的催化生理以及與周期性蛻皮之間相關(guān)性研究還是空白。因此，本課題從中國鱟中分離提取NAGase，研究其酶學(xué)特性，探討環(huán)境因素對中國鱟幾丁質(zhì)酶催化生理的影響，這對揭示鱟幾丁質(zhì)酶與蛻皮生理之間的相關(guān)性具有重要的科學(xué)與實(shí)踐意義，為鱟資源減少成因提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國鱟購自莆田市城南市場。酶催化的底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室合成；葡聚糖凝膠G-200(Sephadex G-200)出自Pharmacia，二乙氨基乙基纖維素32(DE-32)是Whatman產(chǎn)品。牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，SDS-PAGE使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量為14.4～116 kDa，等點(diǎn)電測定使用DH020-1載體兩性電解質(zhì)，來自天根生化科技(北京)有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 中國鱟內(nèi)臟NAGase的分離純化 中國鱟內(nèi)臟NAGase分離純化方案參照文獻(xiàn)[2]。挑取中國鱟活體的內(nèi)臟部分，加入1∶3(W/V)預(yù)冷0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)，勻漿后抽提(4 ℃)4 h，在離心力為40 000×g (4 ℃)下離心0.5 h。再依次采用30%、80%飽和度的(NH4)2SO4分級分離，沉淀物經(jīng)透析后在50 000×g，4 ℃下離心0.5 h，離心上清液為粗酶制劑。酶制劑經(jīng)過Sephadex G-200層析柱(2.6 cm×60 cm)層析，采用0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)為洗脫液，洗脫液內(nèi)含0.2 mol/L NaCl，流速0.4 mL/min，自動部分收集器收集流出液，按每管4 mL收集，共收集120管，集中有酶活力的收集管，收集液透析后用于DE-32離子交換柱層析；在纖維素DE-32層析柱(1.6 cm×40 cm)層析中，采用與分子篩層析柱相同的洗脫液，內(nèi)含0～1.0 mol/L NaCl，采用直線梯度洗脫，洗脫液流速為0.25 mL/min，每管收集5 mL，共收集110管，收集酶活力峰，得到的酶制劑在4 ℃下經(jīng)過雙蒸餾水透析后，用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1.2.2 中國鱟內(nèi)臟NAGase活力測定 中國鱟內(nèi)臟NAGase活力的測定方法：分別加入75 mmol/L pH=5.4 HAC- NaAC緩沖液1 mL，5 mmol/L底物pNP-β-D-GlcNAc 0.2 mL，雙蒸餾水0.78 mL，混勻，在37 ℃下恒溫10 min后，加入20 μL酶液，共2 mL的反應(yīng)體系，反應(yīng)時間為10 min，最后加入0.5 mol/L NaOH 2 mL終止反應(yīng)，測定其光吸收值(A405 nm)，以未加入酶制劑的為對照組。以產(chǎn)物硝基酚(pNP)為標(biāo)準(zhǔn)物，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1個酶活力單位(U)定義為：在上述條件下，每分鐘催化水解產(chǎn)生1 μmol/L pNP所需的酶量規(guī)定為1 U。比活力定義為每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)(U)。

1.2.3 中國鱟內(nèi)臟NAGase蛋白濃度測定 NAGase蛋白濃度測定參考Bradford[10]采用的考馬斯亮藍(lán)法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；用A280 nm表示各收集管中的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 中國鱟內(nèi)臟NAGase純度鑒定和蛋白亞基分子質(zhì)量的測定 NAGase的純度通過PAGE檢定；而NAGase蛋白亞基的相對分子質(zhì)量采用SDS-PAGE測定，SDS-PAGE所用的分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.5%和3.0%；以電泳圖譜中各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率(變量x)對各蛋白分子質(zhì)量的對數(shù)(變量y)作圖，得一直線：y=-2.515x+5.123。

1.2.5 中國鱟內(nèi)臟NAGase等電點(diǎn)的測定 參照高英杰等[11]方法，采用等電點(diǎn)聚焦電泳法進(jìn)行測定。

1.2.6 中國鱟內(nèi)臟NAGase最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的測定 改變緩沖液 HAC-NaAC的pH(3.6～10.0)，檢測在不同pH的反應(yīng)體系中NAGase活力，確定NAGase的最適pH。然后，將NAGase酶液分別與不同pH的HAC-NaAC緩沖液等量混勻處理(4 ℃)1 h，取處理后的酶液20 μL，測定其酶活力，分析NAGase的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.7 中國鱟內(nèi)臟NAGase最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定 改變反應(yīng)體系的溫度(20～90 ℃)，檢測不同溫度下反應(yīng)體系中NAGase活力，確定NAGase的最適溫度。將NAGase酶液經(jīng)不同溫度處理(4 ℃)1 h，取20 μL處理過的酶液，測定其酶活力，分析NAGase的溫度穩(wěn)定性。

1.2.8 中國鱟內(nèi)臟NAGase米氏常數(shù)(Km)測定 在NAGase活力的測定體系中，改變pNP-β-D-GlcNAc底物的摩爾濃度，選擇底物濃度為0.15、0.2、0.25、0.33、0.4和0.5 mmol/L，分別檢測其酶活力，以底物濃度倒數(shù)(1/[S])對測定的相應(yīng)酶反應(yīng)速度(1/v)倒數(shù)作圖，從直線在縱、橫坐標(biāo)軸的交點(diǎn)可分別求出NAGase的最大反應(yīng)速度Vmax和Km。

1.2.9 NAGase紫外吸收光譜和內(nèi)源熒光發(fā)射光譜特征 在pH=5.4 NaAc-HAc緩沖液體系中，NAGase濃度為7.2 μg/mL，用日本島津UV-2550型紫外分光光度計(jì)掃描，測定酶的紫外吸收峰；再用美國Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)掃描，在酶內(nèi)源熒光激發(fā)光譜波長為232.2 nm下，測定酶的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰。

1.2.10 金屬離子對中國鱟內(nèi)臟NAGase活力的影響

在中國鱟內(nèi)臟NAGase活力的測定體系中，分別加入一定濃度的不同金屬化合物(NaCl，KCl，Li2SO4，CaCl2，BaCl2，CoCl2，MgSO4，CuSO4，ZnSO4，MnCl2，F(xiàn)eCl3，AlCl3，Pb(NO3)2，AgNO3，Cd(NO3)2，HgCl2和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，測定加入各金屬離子和EDTA后的NAGase活力，分析金屬離子對中國鱟內(nèi)臟NAGase活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國鱟內(nèi)臟NAGase的分離純化

中國鱟內(nèi)臟NAGase各步分離純化結(jié)果見表1。從Sephadex G-200層析洗脫曲線(見圖1a)可知，分子篩層析第一個蛋白峰周圍就出現(xiàn)NAGase活性，Sephadex G-200是大孔徑葡聚糖凝膠，NAGase分子先被排阻洗脫出，說明該NAGase分子質(zhì)量較大。在離子交換柱DE-32層析色譜(見圖1b)中，又出現(xiàn)兩個蛋白峰，但只有第二個蛋白峰具有NAGase活性，收集酶活力峰；從NaCl洗脫曲線分析，在0.20 mol/L NaCl下NAGase開始洗脫出來，最終得到純化倍數(shù)5.55，比活力為505.21 U/mg的NAGase酶制劑。

圖1 中國鱟內(nèi)臟NAGase的Sephadex G-200層析色譜(a)和DE-32層析色譜(b)

純化步驟Purificationsteps總蛋白含量Totalprotein/mg酶活力Enzymeactivity/(U·mL-1)總酶活力Totalactivity/U比活力Specificactivity/(U·mg-1)純化倍數(shù)Purification(fold)得率Yield/%粗酶液Crudeextract396．41202．8836112．6491．101．00100．0030%(NH4)2SO4鹽析上清液30%(NH4)2SO4fraction258．19213．2831458．80121．801．3487．1180%(NH4)2SO4鹽析透析液80%(NH4)2SO4fraction97．03438．1222563．18232．542．5562．48SephadexG?200凝膠層析液SephadexG?200fraction41．02149．1310856．66264．672．9130．06DEAE?32纖維素離子交換層析液DEAE?cellulosechromatography13．19115．896663．68505．215．5518．46

圖2 中國鱟NAGase的PAGE(a)及SDS-PAGE(b)圖譜

NAGase酶制劑經(jīng)PAGE檢定發(fā)現(xiàn)只有一條蛋白帶(見圖2a)，說明經(jīng)分離純化后NAGase已達(dá)到電泳純。SDS-PAGE檢測結(jié)果(見圖2b)顯示，只獲得單一條帶的NAGase酶制劑。根據(jù)NAGase的相對遷移率，求得NAGase亞基分子質(zhì)量為121.5 kDa。等電聚焦電泳法測定NAGase等電點(diǎn)為6.01。

2.2 中國鱟內(nèi)臟NAGase的最適pH值和酸堿穩(wěn)定性

圖3顯示，中國鱟內(nèi)臟NAGase的最適pH為5.4，在pH=5.0～6.0下，NAGase有較高活力，當(dāng)pH>7.0時酶失活速度加快。NAGase在pH=4.5～7.0區(qū)域內(nèi)相對穩(wěn)定，在pH=10.0緩沖液中處理1 h后，酶活力只有19.1%。

2.3 中國鱟內(nèi)臟NAGase的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

從圖4可見，溫度對中國鱟內(nèi)臟NAGase活力影響呈鐘罩型曲線變化，NAGase對底物pNP-β-D-GlcNAc催化水解的最適溫度為55 ℃。NAGase在20～50 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性，在60 ℃下處理1 h相對酶活力僅為21.3%，90 ℃下酶接近失活。

2.4 NAGase水解底物pNP-β-D-GlcNAc的動力學(xué)分析

從圖5可知，底物濃度[S]在0.15～0.5 mmol/L范圍內(nèi)，隨著[S]的增大，中國鱟內(nèi)臟NAGase反應(yīng)速度[v]也增大。以1/[S]對1/v作圖(雙倒數(shù)作圖)，獲得一直線，直線方程為：y=0.032x+ 0.076。求得Km為0.421 mmol/L，Vmax為13.158 μmol/L·min-1。

(a.最適pH; b.酸堿穩(wěn)定性。a.Optimum pH； b. pH stability.)

(a.最適溫度; b.熱穩(wěn)定性。a.Optimum temperature； b.Temperature stability.)

圖4 中國鱟NAGase的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

Fig.4 Optimum temperature and temperature stability of NAGase fromTachypleustridentatus

2.5 NAGase紫外吸收光譜和內(nèi)源熒光發(fā)射光譜特征

選擇腹部或心臟線圈，以胎頭為中心，盡量貼緊掃描部位，協(xié)助孕婦取側(cè)臥位，保證胎兒與線圈距離更近。為孕婦帶耳塞，減少噪聲干擾，減少其不自主運(yùn)動。先對胎頭進(jìn)行三平面定位，因?yàn)樘簳顒?，檢查時隨時進(jìn)行實(shí)時定位。

中國鱟內(nèi)臟NAGase在NaAc-HAc緩沖液體系中，在276 nm波長處有紫外吸收峰；而在232.2 nm波長的光激發(fā)下，NAGase的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰在330.9 nm波長處。

2.6 金屬離子對NAGase活力的影響

從表2可知，在本試驗(yàn)條件下，Na+， K+和Li+對中國鱟內(nèi)臟NAGase活力沒有影響；Ca2+、Ba2+對NAGase活力有微弱的激活作用，5 mmol/L Co2+能使NAGase活力提高41.67%；Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Pb2+、Ag+、Cd2+、Hg2+等10種金屬離子對NAGase活力有不同程度的抑制作用，5 mmol/L Cd2+可使NAGase活力喪失85.60%，而Hg2+對NAGase抑制作用最強(qiáng)，0.1 mmol/L Hg2+可使酶活力喪失90.10%。EDTA對NAGase活力沒有影響，說明NAGase活性中心不含金屬離子，不屬于金屬酶類。

(圖內(nèi)插圖為底物濃度對初速度的雙曲線。The inset shows the relationship between the substrate concentration and the initial rate.)

圖5 中國鱟NAGase米氏常數(shù)Km的測定

Fig.5 The determination of Michaelis constant(Km)of NAGase fromTachypleustridentatus.

3 討論

3.1 NAGase的功能與基本性質(zhì)

前人研究[12]表明：植物NAGase主要是在抵抗真菌等微生物的侵染中進(jìn)行應(yīng)激防衛(wèi)反應(yīng)而產(chǎn)生；細(xì)菌類NAGase主要是起到降解幾丁質(zhì)的作用，細(xì)菌進(jìn)而從中獲得營養(yǎng)；而在節(jié)肢動物以及甲殼動物中，NAGase的作用除了用于消化含幾丁質(zhì)的食物，還參與到周期性蛻皮的生理過程。此外，目前認(rèn)為動物精巢中的NAGase與動物生殖機(jī)能還存在密切相關(guān)[13]，動物卵子表面的糖蛋白鏈參與精卵結(jié)合過程，而動物精子中的NAGase可能在受精后又能水解該糖蛋白鏈。黃小紅等[12,14]已從番鴨(Cairinamoschata)睪丸、豬精液中獲取NAGase，并闡明其酶學(xué)性質(zhì)。目前，NAGase的功能與性質(zhì)的研究已越來越受重視。不同動物來源的NAGase，它們的酶學(xué)性質(zhì)存在差異。豬[14]精液來源的堿性NAGase，該酶蛋白亞基的相對分子質(zhì)量為58.03 kDa，米氏常數(shù)Km為1.94 mmol/L；而菜青蟲[7]表皮的NAGase是由2個相對分子質(zhì)量分別為59.5和57.2 kDa的酶蛋白亞基組成，Km為0.285 mmol/L；蝦類體內(nèi)的NAGase，如中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[15]體壁NAGase的酶蛋白亞基分子質(zhì)量為48.88 kDa，Km為0.23 mmol/L；而中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[16]內(nèi)臟NAGase則含有3個相對分子質(zhì)量分別為121.21、98.63、73.48 kDa的酶蛋白亞基，Km為0.357 mmol/L。本試驗(yàn)結(jié)果表明：中國鱟內(nèi)臟NAGase酶蛋白亞基分子質(zhì)量為121.5 kDa，亞基分子質(zhì)量較大，Km為0.421 mmol/L。前人研究結(jié)果表明：不同動物NAGase降解底物(pNP-β-D-GlcNAc)的Km大小不同，即不同來源的NAGase對同一底物親和力不同，中國明對蝦[15]體壁NAGase的Km較小，對底物親和力相對較大。

表2 16種金屬離子對中國鱟NAGase的影響

pH對不同生物來源的NAGase有不同效應(yīng)。菜青蟲[7]表皮NAGase最適pH是6.2，而前研究的中國明對蝦[15]體壁NAGase的最適pH為6.0，本試驗(yàn)結(jié)果表明：中國鱟內(nèi)臟NAGase的最適pH為5.4。與中華絨螯蟹[16]內(nèi)臟NAGase最適pH(5.5)、豬[14]精液堿性NAGase最適pH(5.5)和羅非魚(Oreochromisniloticus)[17]精巢NAGase最適pH(5.7)相近，這些來自不同動物的NAGase，其最適pH均偏向酸性。

在溫度對動物NAGase影響的研究中，菜青蟲[7]表皮NAGase最適溫度為42 ℃，中華絨鰲蟹[16]內(nèi)臟NAGase最適溫度為45 ℃，而番鴨[12]睪丸與羅非魚[17]精巢NAGase的最適溫度均為55 ℃。試驗(yàn)結(jié)果顯示：中國鱟內(nèi)臟NAGase的最適溫度為55 ℃。因?yàn)橹袊c幼體發(fā)育適宜水溫為30 ℃左右[8]，在此水溫下，中國鱟內(nèi)臟NAGase活力較低。

3.2 NAGase的穩(wěn)定性

不同動物來源的NAGase對酸堿穩(wěn)定性不同。羅非魚[17]精巢NAGase在pH=3.3～8.1內(nèi)穩(wěn)定，豬[14]精液堿性NAGase酸堿穩(wěn)定區(qū)域是pH=3.0～8.9，而家蠶[6]和菜青蟲[7]表皮NAGase分別在pH=5.5～8.5、pH=4.0～9.0內(nèi)穩(wěn)定，可見，這些不同來源的NAGase在酸堿區(qū)域內(nèi)均具一定的穩(wěn)定性。在本試驗(yàn)中，中國鱟內(nèi)臟NAGase在pH=4.5～7.0區(qū)域內(nèi)較為穩(wěn)定，穩(wěn)定區(qū)域偏酸性，在pH=10.0緩沖液中處理1 h后，酶活力只有19.1 %，說明中國鱟內(nèi)臟NAGase較不耐堿性。

對NAGase的溫度穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，來自菜青蟲[7]表皮、番鴨[12]睪丸、中國明對蝦[15]體壁、中華絨螯蟹[16]內(nèi)臟和羅非魚[17]精巢的NAGase在45 ℃以上失活速度均加快，但中國鱟內(nèi)臟NAGase在20～50 ℃區(qū)域內(nèi)穩(wěn)定，在55 ℃以上酶才迅速失活，說明中國鱟內(nèi)臟NAGase具有較好的熱穩(wěn)定性。

3.3 金屬離子對NAGase的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明：Ca2+對中國鱟內(nèi)臟NAGase呈現(xiàn)微弱的激活作用，而Mg2+對NAGase活力又具有微弱的抑制作用。Mg2+和Ca2+往往對酶會呈現(xiàn)激活作用，它們對中國明對蝦[15]體壁NAGase和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)[18]內(nèi)臟NAGase均有激活作用，但兩者對中華絨螯蟹[16]內(nèi)臟NAGase又都沒有影響，Ca2+對番鴨[12]睪丸NAGase反而呈現(xiàn)抑制作用。在本試驗(yàn)中，Ba2+和Co2+對中國鱟內(nèi)臟NAGase活力有不同程度的激活作用，但Ba2+和Co2+對凡納濱對蝦[2]內(nèi)臟NAGase又均呈現(xiàn)抑制作用。試驗(yàn)還表明，Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+和Al3+等金屬離子對中國鱟內(nèi)臟NAGase活力有不同程度的抑制作用。在相關(guān)研究中，Cu2+、Zn2+對菜青蟲[7]表皮、中國明對蝦[15]體壁和中華絨螯蟹[16]內(nèi)臟的NAGase均有抑制作用；Mn2+對羅非魚[17]精巢NAGase有一定抑制作用，但對凡鈉濱對蝦[2]內(nèi)臟NAGase又呈現(xiàn)激活作用；Fe3+對凡納濱對蝦[2]內(nèi)臟NAGase呈現(xiàn)抑制作用，但對中國明對蝦[15]體壁NAGase又有激活作用。此外，Al3+對番鴨[12]睪丸和中華絨螯蟹[16]內(nèi)臟NAGase也均有抑制作用。因此，這5種金屬離子對不同來源的NAGase影響效應(yīng)存在差異。

Pb2+、Ag+、Cd2+和Hg2+這4種重金屬離子對生物毒性大，往往是生物體內(nèi)酶的強(qiáng)烈抑制劑。Pb2+對中華絨螯蟹[16]內(nèi)臟和羅非魚[17]精巢NAGase均有抑制作用；當(dāng)Ag+濃度超過0.27 mmol/L時，Ag+開始對中華絨螯蟹[19]內(nèi)臟NAGase產(chǎn)生抑制作用。本試驗(yàn)中，50 mmol/L Pb2+可使中國鱟內(nèi)臟NAGase活力喪失71.05%，而1 mmol/L Ag+則可使中國鱟內(nèi)臟NAGase活力喪失82.74%。Cd2+對凡納濱對蝦[2]內(nèi)臟NAGase有較強(qiáng)的抑制作用，Hg2+對鋸緣青蟹[18]內(nèi)臟和菜青蟲[7]表皮NAGase均有很強(qiáng)的抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明：5 mmol/L Cd2+可使中國鱟內(nèi)臟NAGase活力喪失85.60%，Hg2+對中國鱟內(nèi)臟NAGase抑制作用最強(qiáng)，0.1 mmol/L Hg2+可使酶活力喪失90.10%。這4種重金屬離子對中國鱟內(nèi)臟NAGase抑制作用從大到小順序?yàn)椋篐g2+>Ag+>Cd2+>Pb2+。

因此，不同金屬離子對NAGase存在不同生理效應(yīng)，相同金屬離子對不同動物來源的NAGase影響也不同，海洋水體中金屬離子含量會直接影響到中國鱟NAGase的催化生理。

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Study on Purification and Enzymatic Characteristics ofβ-N-acetyl-D-glucosaminidase

Abstract： Chitinase was composed of endochitinase, exochitinase, and β-N-acetyl-D-glucosaminidase(EC3.2.1.52, NAGase). Chitin was cleavaged into monomer and oligomers of β-N-acetylglucosamine by NAGase, thenNAGase hydrolyzed chitobiose into monomer. NAGase had many functions in arthropod. NAGase not only degraded chitin in food, but also played important roles in the molting and hatching processes. Horseshoe Crab (Tachypleustridentatus) was an important marine species. Tachypleustridentatus needed no more than six times molting during embryonic development and thirteen to fourteen times molting in its life cycle. Therefore, the appropriate level of NAGase activity was a benefit to the molting cycle, especially during embryonic development. Marine environmental factors, such as temperature, pH, metal ions and others pollutants might influence the NAGase activity, which would regulate the animal's molting. Now, the purpose of this study was to discuss the purification of NAGase from the viscera of Tachypleustridentatus and its enzymatic characteristics. The NAGase was purified from the viscera of Tachypleustridentatus by 30% and 80% ammonium sulfate fractionation and chromatography on Sephadex G-200 and DEAE-cellulose(DE-32). The purified enzyme preparation was homogeneous as judged by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)and SDS-PAGE. The specific activity of purified enzyme was 505.21 U/mg. The molecular weight of enzyme protein subunit was determined to be 121.5 kDa. The pI value was calculated to be 6.01 by isoelectric focusing. The optimal pH value was 5.4 and the optimal temperature was 55 ℃. The NAGase was stable at a temperature range from 20 ℃ to 50 ℃ and in the pH range of 4.5 to 7.5. The activity of NAGase also had 21.3% at temperature 60 ℃ for one hour treatment. The result suggested that the thermal stability of NAGase in Tachypleustridentatus was better than other species. In addition, the activity of NAGase was 19.1% at pH 10.0 for one hour treatment. The result suggested that NAGase was not stable at alkaline environment. The enzyme followed typical Michaelis-Menten kinetics for the hydrolysis of ρ-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide(pNP-β-D-GlcNAc). TheKmandVmaxvalues were determined to be 0.421 mmol/L and 13.158 μmol/L·min-1, respectively. The peak wavelength of UV absorption of the NAGase was 276 nm. When the excitation wavelength was 232.2 nm, the peak wavelength of fluorescence emission spectra of the NAGase was 330.9 nm. The effect of metal ions on the NAGase was studied. Metal ions Na+, K+and Li+had no effect on the enzyme activity. Ca2+and Ba2+activated the enzyme slightly. 5 mmol/L Co2+led enzyme activity to increase by 41.67%. Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Pb2+、Ag+、Cd2+and Hg2+showed various degrees of inhibitory effects on the enzyme. 5 mmol/L of Cd2+inhibited the activity of enzyme by 85.60% when 0.1 mmol/L of Hg2+inhibited the activity of enzyme by 90.10%. EDTA had no effect on the enzyme activity indicating the NAGase was nonmetallic enzyme.

Key words：Tachypleustridentatus;β-N-acetyl-D-glucosaminidase; purification; enzymatic characteristics

責(zé)任編輯 高 蓓

from the Viscera of Horseshoe Crab(Tachypleustridentatus)

LIN Jian-Cheng, XU Heng-Qi, LUO Xin-Ming

(College of Environmental and Biological Engineering, Fujian Provincial Key Laboratory of Ecology-toxicological Effects & Control for Emerging Contaminants, Putian University, Putian 351100, China)

福建省科技引導(dǎo)性項(xiàng)目(2015N0013)；福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(PY16009)資助 Supported by the Science and Technology Pilot Project of Fujian Province(2015N0013)；the Open Project from Fujian Provincial Key Laboratory of Ecology-toxicological Effects&Control for Emerging Contaminants(PY16009)

2016-08-29；

2016-09-23

林建城(1966-)，男，教授，從事海洋生物酶學(xué)的研究工作。E-mail: ptljc660402@sina.com

Q556.2

A

1672-5174(2017)09-062-08

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160301

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