周 燦，王一鳴，林 馨，王永華

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310053）

川芎嗪對慶大霉素耳毒性的抗氧化作用研究

周 燦，王一鳴，林 馨，王永華

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310053）

為了觀察川芎嗪(TMP)對慶大霉素（GM）耳毒性豚鼠氧自由基生成的影響，探討TMP對GM耳毒性損傷的保護作用。選取豚鼠作為實驗動物，將豚鼠隨機分為4組：正常對照組、GM組、GM+TMP組和TMP組。檢測豚鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合酶（NOS）活性、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）含量，并結(jié)合聽性腦干反應(yīng)（ABR）測試和耳蝸HE染色技術(shù)。結(jié)果表明：GM+TMP組血清SOD活性明顯高于GM組（P<0.05），MDA含量較GM組明顯減少（P<0.001），NOS活性和NO含量明顯低于GM組（P<0.05），且聽功能明顯改善；耳蝸形態(tài)學(xué)改變與聽力變化一致。TMP在一定程度上可以有效防護GM所致的耳蝸損傷，其機制可能與清除活性氧物質(zhì)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

川芎嗪；慶大霉素；自由基；耳蝸

氨基糖苷類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）在臨床應(yīng)用時會引起嚴(yán)重的耳毒性，目前多認(rèn)為AmAn誘導(dǎo)耳蝸產(chǎn)生過量的氧自由基，突破細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的防御能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡或凋亡[1]。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是活血化瘀類中藥川芎的有效成分，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，現(xiàn)已能人工合成，張兆輝等[2]發(fā)現(xiàn)TMP對活性氧自由基具有清除作用。本實驗將TMP與慶大霉素（gentamicin，GM）作用于豚鼠后，通過檢測豚鼠血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthse，NOS）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量，以及觀察聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）閾值和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，研究TMP對氧自由基的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及慶大霉素豚鼠耳毒模型的建立

耳廓反射正常的紅目白毛健康豚鼠，體重300 g，雌雄各半（動物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供），隨機分成4組。GM組（12只）：硫酸慶大霉素注射劑（浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號：20121019）100 mg/kg，肌注，Bid；TMP組（8只）：注射用鹽酸川芎嗪（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號：120403A1）10 mg/kg，腹腔注射，qd；GM+TMP組（12只）：注射GM和TMP的劑量、注射方法同上；正常對照組（8只）：氯化鈉注射液等量注射。連續(xù)用藥12 d，每天秤體重以調(diào)整藥量。

1.2 豚鼠ABR檢測

用藥前及最后一次用藥24 h后檢測雙耳ABR閾值。豚鼠用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，在屏蔽隔聲室內(nèi)常規(guī)測試ABR。采用美國ICS公司ICS-CHARTR型誘發(fā)電位檢測儀，記錄電極置于前額正中皮下，地極置于鼻根部，參考電極置于耳后乳突部皮下，選擇合適耳塞，插入式耳機插入豚鼠外耳道。刺激聲信號為短聲（click）帶通濾波100～3 000 Hz，掃描時間10 ms，疊加1 024次，重復(fù)率21.1次/s，刺激聲強由80 dB nHL開始，以5 dB逐次遞減，降至反應(yīng)波消失，記錄Ⅲ波閾值。

1.3 耳蝸組織石蠟切片制備和HE染色

檢測各組豚鼠ABR后，立即斷頭，速取雙側(cè)聽泡，打開聽泡分離出耳蝸，開放圓窗和前庭窗，微針挑開蝸頂后，從蝸頂小孔處緩慢灌入4%多聚甲醛固定液，將耳蝸標(biāo)本浸入4℃該固定液中充分固定24 h以上，4℃下脫鈣4周，常規(guī)石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片，再行HE染色。

1.4 豚鼠血清SOD、NOS活性和MDA、NO含量檢測

檢測ABR后，分別腹腔取血、離心，取血清-20°C凍存，采用SOD、NOS、NO、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），按說明操作檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMP對GM耳中毒豚鼠ABR閾值的影響

各組豚鼠在用藥前后ABR閾值的變化見表1。各組用藥前ABR閾值無顯著差異（P>0.05），連續(xù)用藥12 d后，GM組ABR閾值比用藥前明顯升高（P<0.05），與正常對照組比較有明顯差異（P<0.05）；GM+TMP組ABR閾值雖然在用藥后也有所升高，但較GM組明顯降低（P<0.01）；TMP組與正常對照組ABR閾值在用藥前后無明顯差異（P>0.05）。

表1 各組用藥前后豚鼠 ABR閾值（dB nHL,±S）Tab.1 The ABR threshold of guinea pigs before and after treatment

表1 各組用藥前后豚鼠 ABR閾值（dB nHL,±S）Tab.1 The ABR threshold of guinea pigs before and after treatment

注：與用藥前比，*P<0.05；用藥后，與對照組比，△P<0.05；與GM組比，▲P<0.01.

組別 耳數(shù) click ABR閾值用藥前 用藥后對照組GM組GM+TMP組TMP組8 12 12 8 9.37±4.03 10.00±4.47 11.67±3.53 10.00±4.33 5.77±6.07 76.47±13.20△*24.16±3.76▲△*7.69±4.84▲

2.2 豚鼠耳蝸HE染色細(xì)胞形態(tài)觀察

光鏡下正常對照組耳蝸底轉(zhuǎn)Corti器結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，無缺失，細(xì)胞膜光滑；GM組Corti器毛細(xì)胞減少，有較多缺失，呈現(xiàn)水腫狀態(tài)；GM+TMP組Corti器毛細(xì)胞散在缺失，呈現(xiàn)空泡化，但較GM組損傷輕；TMP組Corti器毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整（圖1）。

光鏡下正常對照組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)正常，排列密集，細(xì)胞核邊界清晰；GM組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞間隙增大，有空泡變性，側(cè)壁的小血管擴張，內(nèi)紅細(xì)胞增多；GM+TM組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均有不同程度改變，細(xì)胞數(shù)量有所減少，但較GM組輕。TMP組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化較輕，細(xì)胞核致密且染色深，核膜邊界清晰，細(xì)胞排列較密集（圖2）。

圖1 各組豚鼠耳蝸Corti器（HE×200）Fig.1 Guinea pig cochlea Corti organ(HE×200)

圖2 各組豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（HE×200）Fig.2 Guinea pig cochlear spiral ganglion cells(HE×200)

2.3 豚鼠血清中SOD、NOS活性及MDA、NO含量

用藥后，GM組血清中SOD活性下降，MDA含量明顯升高，與正常對照組比較有差異（P<0.05，P<0.01）；GM+TMP組血清SOD活性顯著高于GM組（P<0.05），MDA含量明顯低于GM組（P<0.001）。GM組血清NOS活性顯著增強，NO含量顯著增高，與正常對照組比較差異顯著（P<0.01，P<0.05）；GM+TMP組血清NOS活性和NO含量明顯低于GM組（P<0.05）。TMP組與正常對照組相比無顯著性差異（表2）。

表2 各組用藥后豚鼠血清SOD、NOS活性和MDA、NO含量（±S，n=40）Tab.2 The activity of SOD,NOS and MDA and NO in serum of guinea pigs after treatment

表2 各組用藥后豚鼠血清SOD、NOS活性和MDA、NO含量（±S，n=40）Tab.2 The activity of SOD,NOS and MDA and NO in serum of guinea pigs after treatment

注：*由XRD結(jié)果，通過Scherrer公式XRD譜圖中Ni（111）晶面半峰寬計算金屬Ni粒徑.

組別 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1 NOS/U·mL-1 NO/umol·mL-1對照組GM組GM+TMP組TMP組122.89±7.30 114.22±5.76△130.35±10.64☆128.13±6.23﹡4.68±1.02 8.38±0.76※5.69±1.33﹡3.88±0.65﹡14.31±1.33 16.80±0.89※13.60±2.05☆13.75±1.30﹡87.19±19.21 118.94±22.56△89.64±13.20☆85.03±6.00☆

3 討論

AmAn耳毒作用機制之一為自由基學(xué)說。已有研究表明GM通過與游離鐵離子形成復(fù)合物，催化產(chǎn)生了自由基，自由基可通過生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化導(dǎo)致生物膜形態(tài)和功能的改變，從而引起細(xì)胞壞死或凋亡，并因此形成脂質(zhì)過氧化物如MDA。MDA可帶著原自由基的損傷潛能從其生成部位如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴散到線粒體、核糖體、細(xì)胞核等部位，造成進一步嚴(yán)重?fù)p害[3]。AmAn還可激活內(nèi)耳組織中，NOS，催化生成NO水平增高。過量的NO會產(chǎn)生病理性損傷，干擾細(xì)胞的能量代謝，還可導(dǎo)致過氧亞硝基陰離子形成，作用于酶、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生更大的細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞損傷或死亡[1]。正常情況下,耳蝸中存在著自由基清除系統(tǒng)，其中以SOD活性較高，SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著關(guān)鍵作用，它可以清除超氧陰離子自由基，保護毛細(xì)胞免受損傷。SOD活性的檢測可間接反映耳蝸在GM耳毒性時清除氧自由基的能力。

TMP是從傘形科蒿本屬植物川芎的根莖中提取的主要化學(xué)成分。TMP具有多種藥理作用，臨床上被廣泛用于心、腦血管、肺、肝、腎等疾病的治療。由于該藥具有解除血管痙攣、改善微循環(huán)、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用,故常用于耳科突發(fā)性耳聾、老年性聾等感音神經(jīng)性聾的治療。研究發(fā)現(xiàn)TMP對心、腦缺血再灌注損傷具有保護性，與其能提高SOD活性，增強氧自由基的清除、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)[4]。韓明等[5]研究證實，TMP可提高順鉑中毒豚鼠耳蝸SOD活性，明顯降低MDA含量，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，對順鉑耳毒性具有防護作用。崔城等[6]的研究顯示，TMP可降低GM中毒耳蝸NOS活性，減輕GM耳毒性?？酌舻萚7]的實驗結(jié)果表明，TMP可以通過減少應(yīng)用順鉑時耳蝸內(nèi)NOS的表達，從而對抗順鉑的耳蝸毒性。

本實驗血清學(xué)檢測結(jié)果表明，GM組用藥后SOD活力低于對照組，NOS活性、NO和MDA含量明顯高于對照組；GM+TMP組SOD活力明顯高于GM組，NOS活性、NO和MDA含量低于GM組。GM+TMP組用藥后的ABR閾值與對照組相比雖有所升高，但與GM組相比明顯降低，且與SOD活力增高、NOS活性減弱、NO和MDA含量減少相關(guān)；在光鏡鏡下觀察到GM+TMP組耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷較GM組明顯減輕。表明TMP能有效提高SOD活力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并可能通過抑制NOS活性的異常增高，減少NO的過量生成，從而減少自由基生成，保護耳蝸組織免受GM的毒性破壞，改善聽功能。我們在實驗中也觀察到，TMP組與正常對照組的NOS活性、NO含量及ABR閾值無顯著差異，表明川芎嗪注射液對正常豚鼠耳蝸NO的生成無明顯影響，證實了川芎嗪注射液的安全無毒。

從以上結(jié)果可以看出，TMP可通過提高耳蝸SOD活力，抑制NOS活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少氧自由基的過量生成，從而保護耳蝸毛細(xì)胞，改善聽功能，這可能也是TMP對GM耳毒性損傷的保護機制之一。

[1]SHA Suhua,SCHACHT J.Antioxidants attenuate gentamicin-induced free radicals Formation in vitro and ototoxicity in vivo:D-methionine is a potential protectant[J].Hearing Research,2000,142(1/2):34-40.

[2]張兆輝,衛(wèi)濤濤,余紹租,等.川芎嗪的抗氧化機制對缺性腦損傷的保護作用[J].中國臨床康復(fù),2004,34(8):7 742-7 744.

[3]FORGE A,LI Lin.Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia[J].Hearing Research,2000,139(1/2):97-115.

[4]QIAN Weidong,XIONG Xingjiang,FANG Zhuyuan,et a1.Protective effect of tetramethylpyrazine on myocardial isehemiareperfusion injury[J/OL].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,http://dx.doi.org/10.1155/2014/107501

[5]韓 明,程 鑫,程秀臻,等.川芎嗪對順鉑耳中毒誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2008,14(4):343-344.

[6]崔 城,湯 浩,崔桂英,等.川芎嗪拮抗慶大霉素耳毒性作用的實驗研究[J].現(xiàn)代康復(fù),2001,5(2):53-54.

[7]孔 敏,劉儒林.川芎嗪對順鉑所致耳蝸毒性保護作用的實驗研究[J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,32(4):253-255.

Study on Antioxidation Effect of Tetramethylpyrazine on Gentamicin Ototoxicity

ZHOU Can,WANG Yi-ming,LIN Xin,et al
(Department of Hearing,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China)

To observe the effect of tetramethylpyrazine(TMP)on the oxygen free radicals of gentamicin(GM)ototoxicity in guinea pig,and to explore the protective effect on the toxicity of GM.Guinea pigs were used as experimental animals and randomly assigned 4 groups:control group,GM-treated alone,GM and TMP in combination and TMP-treated alone.Serum levels of superoxide dismutase(SOD),nitric oxide synthase(NOS),nitric oxide(NO)and maIondiaIdehyde(MDA)in guinea pig were measured,combined with auditory brainstem response(ABR)test and cochlear HE staining.The results showed that SOD level in serum of the GM+TMP group was much higher than that in the GM group(P<0.05),MDA concentration was significantIy lower than that in the GM group(P<0.001),NOS level and NO concentration were significantly lower than those in the GM group (P<0.05),ABR thresholds were significant lower than that in the GM group(P<0.01),and cochlear morphology is consistent with hearing changes.TMP can effectively reduce the effects of ototoxicitycaused by GM to a certain degree,and its mechanism may be explained by the fact that TMP can clean out the oxygen free radicals and inhibit oxidative response caused by GM.

tetramethylpyrazine;gentamicin;oxygen free radicals;cochlea

R285.5

：A

2016-12-14

浙江省教育廳科研項目（Y201017253）

周燦（1994-），男，貴州大方人，研究方向：耳聾康復(fù).

王一鳴，研究方向：中醫(yī)藥耳聾防治.E-mail:924866694@qq.com

1008－830X(2017)01－0086－05