常家琪，梅光明，張小軍，韓程程，高學(xué)慧,3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

離子色譜法測(cè)定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽含量

常家琪1,2，梅光明2，張小軍2，韓程程1,2，高學(xué)慧2,3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

建立了水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的離子色譜測(cè)定方法。對(duì)萃取溫度、提取液pH值以及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，5 種多聚磷酸鹽（磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽及六偏磷酸鹽）分別在 0.1～100、0.2～50、0.1～60、0.3～40、0.5～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)組分含量與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～0.999 8，檢出限為0.5～3.0 mg/kg；定量限為2.0～5.0 mg/kg。水產(chǎn)加工制品中5種多聚磷酸鹽不同濃度加標(biāo)水平（50、100、200 μg/kg）時(shí)，回收率為80.2～100.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）小于9%。該方法簡(jiǎn)便、快速、選擇性好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可作為測(cè)定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽含量的一種理想方法。

離子色譜法；多聚磷酸鹽；水產(chǎn)品；測(cè)定方法

多聚磷酸鹽是世界各國(guó)應(yīng)用最多的食品添加劑之一，作為重要的食品配料和功能添加劑廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、調(diào)味料、水產(chǎn)品等各類食品的加工過程中，對(duì)食品品質(zhì)的改良起著重要作用[1]。多聚磷酸鹽類主要以正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽以及六偏磷酸鹽等多種形式存在。在水產(chǎn)品加工過程中，它能夠提高水產(chǎn)品的保水性，增強(qiáng)其水分的穩(wěn)定性，減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失，在不影響水產(chǎn)品品質(zhì)的前提下降低成本，是一種高效水產(chǎn)品添加劑[2-4]。但磷酸鹽攝入量過多時(shí)會(huì)引發(fā)人體內(nèi)鈣、磷比例失調(diào)，導(dǎo)致發(fā)育遲緩、骨質(zhì)疏松、肝臟功能受損[5-6]，其降解產(chǎn)物增大心血管疾病的患病率[7]等。因此許多國(guó)家對(duì)水品中多聚磷酸鹽的使用也是有著明確的規(guī)定[8]。其中我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014規(guī)定冷凍水產(chǎn)品和冷凍魚糜制品中以磷酸根計(jì)量，磷酸鹽含量不得超過5.0 g/kg[9]，歐盟要求水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的含量不得超過0.5 g/kg[22]，美國(guó)規(guī)定最終產(chǎn)品中磷酸鹽的殘留量不得超過0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。目前水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽含量測(cè)定的方法主要有分光光度法[10-12]、薄層層析色譜法[13]、核磁共振法[14]、離子色譜法[15-21]等。其中分光光度法不能確定多聚磷酸鹽的種類；薄層層析色譜法靈敏度低且不能準(zhǔn)確定量，不能滿足檢測(cè)需求；核磁共振法均因操作過程繁瑣、對(duì)檢測(cè)人員要求較高等原因，不能廣泛地應(yīng)用到食品分析中[22]。我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.256-2016規(guī)定食品中多聚磷酸鹽的測(cè)定采用離子色譜法[23]。本實(shí)驗(yàn)采用離子色譜法對(duì)不同形態(tài)的多聚磷酸鹽同時(shí)進(jìn)行進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化了樣品前處理?xiàng)l件和色譜條件，取得了滿意的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的實(shí)際測(cè)定樣品（墨魚丸、蝦丸、日本黃姑魚丸）均購(gòu)于浙江舟山水產(chǎn)品零售市場(chǎng)，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎后作為待檢樣品。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、氫氧化鉀均分析純，甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級(jí)水。

磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L），焦磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L），六偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國(guó)sigmaaldrich公司；三偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，濟(jì)南光輝化工有限公司；三聚磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，吳江市今朝化工科技有限公司。

10 mmol/L NaoH溶液：準(zhǔn)確稱取0.4 g氫氧化鈉，溶于水并稀釋定容至1 000 mL。50 mmol/L NaoH溶液：準(zhǔn)確稱取2.0 g氫氧化鈉，溶于水并稀釋定容至1 000 mL。

磷酸根、焦磷酸根和六偏磷酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）：分別準(zhǔn)確吸取磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液17.3 mL、焦磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液15.3 mL和六偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液12.9 mL于100 mL的容量瓶中，用10 mmol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度線，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

三偏磷酸根和三聚磷酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 000 mg/L）：分別準(zhǔn)確稱取干燥4 h（80℃）后的三偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.132 g，三聚磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.148 g，用10 mmol/L氫氧化鈉溶液稀釋至100 mL，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和設(shè)備

ICS-3000離子色譜儀（配電導(dǎo)檢測(cè)器），美國(guó)Dionex公司；IKA T18基本型組織搗碎機(jī)，德國(guó)IKA公司；AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SL-502N型臺(tái)式天平，上海華巖設(shè)備儀器有限公司；Centrifuge 5810臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；超聲波清洗機(jī)，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；漩渦振蕩器，德國(guó)IKA公司；OnGuardⅡRP小柱（1.0 mL），美國(guó)Dionex公司，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水通過，靜置活化30 min。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

稱取2.500 g（精確至0.001 g）待測(cè)水產(chǎn)制品樣品置于100 mL離心管中，加50 mmol/L氫氧化鈉溶液混勻，繼續(xù)加該溶液至100 mL刻度線處，置于渦旋振蕩器混合均勻后，于80℃超聲提取30 min，間隔5 min振蕩一次直至完全分散開來，冷卻至室溫，溶液經(jīng)濾紙過濾，取部分溶液于4℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取上清液約15 mL，依次通過0.45 μm水相濾膜、OnGuardⅡRP小柱后，棄去前面3 mL，收集后面洗脫液上離子色譜儀測(cè)定。

空白試驗(yàn)除不加待測(cè)樣品外，采用完全相同的分析步驟、試劑和用量，進(jìn)行平行操作的試驗(yàn)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：分離柱為Dionex Ionpac AS11-HC（4 mm×250 mm），保護(hù)柱為Ionpac AG11-HC型（4 mm×50 mm）；淋洗液：氫氧化鉀溶液，梯度洗脫時(shí)間及濃度見表1，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：100 μL；運(yùn)行時(shí)間：30 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取磷酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液、焦磷酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液、三偏磷酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液、三聚磷酸根、六偏磷酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)分析，以不同的磷酸根離子質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程。

1.3.4 回收率和精密度

稱取2.500 g待測(cè)樣品，分別向其中加入一定量的不同濃度梯度（高、中、低）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻放置30 min，按上述方法進(jìn)行前處理和上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度

本實(shí)驗(yàn)考察了前處理過程中超聲波萃取溫度的影響。將待測(cè)樣品分別置于40℃、80℃和100℃不同溫度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80℃時(shí)，相同加標(biāo)濃度下的5種多聚磷酸根的測(cè)定峰面積值比較穩(wěn)定，離子之間轉(zhuǎn)化幅度不大，且80℃提取30 min測(cè)定值和新配置的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定值相差較小，因此本試驗(yàn)選擇80℃提取30 min作為前處理?xiàng)l件。

2.1.2 提取液pH值影響

多聚磷酸根在水溶液中不穩(wěn)定，溶液溫度升高或酸性增強(qiáng)會(huì)加速其水解，生成磷酸根或更短鏈的聚磷酸根；若溶液中有酵素、絡(luò)合陽離子等存在時(shí)會(huì)大大加快水解速度。但是改變?nèi)芤旱膒H值會(huì)使五種多聚磷酸根發(fā)生化學(xué)變化，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于多聚磷酸根離子長(zhǎng)時(shí)間在水溶液中（尤其是酸性溶液中）會(huì)發(fā)生自身酸水解現(xiàn)象，為保證方法的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH值均保持在堿性范圍內(nèi)。因此我們選擇50 mmol/L氫氧化鈉溶液作為提取液進(jìn)行樣品提取，使樣品溶液pH（8～10）呈現(xiàn)堿性。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)通過比較AS19、AS11-HC等分析柱發(fā)現(xiàn)，不同型號(hào)的分析柱均能分離多聚磷酸鹽，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AS11-HC分析柱對(duì)三聚磷酸鹽與三偏磷酸鹽的分離效果最好，更加適合分析測(cè)定高濃度多聚磷酸鹽，因此本實(shí)驗(yàn)最終選用Dionex Ionpac AS11-HC色譜柱進(jìn)行多聚磷酸根的分離。

2.2.2 柱溫的選擇

本試驗(yàn)考察了5種多聚磷酸根在不同柱溫情況下（25℃、30℃、50℃）的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)磷酸根、焦磷酸根及六偏磷酸根的峰面積和峰高影響不大，但對(duì)三偏磷酸根和三聚磷酸根的峰面積和峰高以及分離度均有影響。所以對(duì)柱溫選擇時(shí)主要考慮三偏磷酸根和三聚磷酸根分離度以及出峰情況，分別選擇濃度為2.5 μg/mL的三偏磷酸根和三聚磷酸根進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，三偏磷酸根和三聚磷酸根兩種磷酸根相對(duì)應(yīng)的信號(hào)最強(qiáng)且能夠完全分離開來，因此柱溫選擇30℃。

2.2.3 進(jìn)樣體積的選擇

液相色譜的測(cè)定多選擇25 μL或50 μL作為進(jìn)樣體積，但在測(cè)定實(shí)際樣品過程中發(fā)現(xiàn)，25 μL或50 μL樣品上機(jī)響應(yīng)值不高，因此增大進(jìn)樣體積，選擇 100 μL進(jìn)樣量來以提高方法靈敏度。圖1是5種多聚磷酸根混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.0 mg/L）離子色譜圖。其中峰1為正磷酸根（PO43-），出峰時(shí)間5.582 min；峰 2為焦磷酸根（P2O74-），出峰時(shí)間為12.487 min；峰 3為三聚磷酸根（P3O105-），出峰時(shí)間為14.153 min；峰4為三偏磷酸根（P3O93-)，出峰時(shí)間15.064 min；峰5為六偏磷酸根（P6O18）6-，出峰時(shí)間為 17.589 min。

2.2.4 線性范圍、定量限及檢出限

圖1 10.0 mg/L時(shí)五種多聚磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.1 Ionchromatogram of standard solution of five polyphosphates

配制5種多聚磷酸根混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y軸），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五種多聚磷酸根的質(zhì)量濃度以P5O2計(jì)，用濃度稀釋法在10倍信噪比時(shí)（RSN）測(cè)得定量限，（PO4）3-、（P2O7）4-、（P3O9）3-、（P3O10）5-、（P6O18）6-的檢出限為 0.5～3.0 mg/kg，定量限為 2.0～5.0 mg/kg。線性相關(guān)系數(shù)、線性方程及線形范圍如表2所示。由表可知，目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，線性范圍、檢出限均令人滿意。

表2 5種多聚磷酸根的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限Tab.2 The linearly relevant coefficient and equation,linear range,detection limit of five polyphosphates

2.2.5 方法的回收率和精密度試驗(yàn)

在確定了檢測(cè)方法后，選取墨魚丸、蝦丸、日本黃姑魚丸水產(chǎn)制品為研究對(duì)象，通過由低到高（50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg）的3個(gè)不同濃度梯度進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。測(cè)定結(jié)果見下表3。由試驗(yàn)結(jié)果可知，低中高三個(gè)不同加標(biāo)濃度梯度下，樣品回收率在80%～100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，該結(jié)果表明此方法完全能夠滿足水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽的含量測(cè)定。

表3 不同加標(biāo)濃度下的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）Tab.3 Results of recovery and precision of samples(n=6)

2.3實(shí)際樣品測(cè)定

最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)3種不同種類的實(shí)際水產(chǎn)加工品進(jìn)行多聚磷酸鹽的6次平行測(cè)定，墨魚丸中（PO4）3-含量為 6.28 mg/kg（n=6），（P3O9）3-為 4.96 mg/kg（n=6），其他三種磷酸鹽未檢出；蝦丸中（PO4）3-含量為 5.84 mg/kg（n=6），其他四種磷酸鹽未檢出；日本黃姑魚丸中（PO4）3-含量為 5.61 mg/kg（n=6），（P3O9）3-為3.76 mg/kg（n=6），其他均未檢出。結(jié)果表明試驗(yàn)中3種不同水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽的含量均低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本文采用離子色譜法測(cè)定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽的含量，通過對(duì)前處理和色譜條件的優(yōu)化，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件，并成功應(yīng)用于墨魚丸、蝦丸、日本黃姑魚丸中5種多聚磷酸鹽的檢測(cè)。該方法具有快速、靈敏、適用范圍廣、準(zhǔn)確度精密度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于水產(chǎn)加工制品中多級(jí)磷酸鹽的檢測(cè)。

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Determination of Polyphosphates in Aquatic Products by Ion Chromatography

CHANG Jia-qi1,2,MEI Guang-ming2,ZHANG Xiao-jun2,et al
(1.School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China）

A method for determination of polyphosphates in aquatic products was developed by ion chromatography.The condition of chromatography and pretreatment temperature and solutions,pH were optimized.The results showed that a good linear relationship can be found between the responsed value and the mass concentration while five polyphosphates(phosphate,pyrophosphate,tripolyphosphate,trimetaphosphate and hexametaphosphate)were in the range of 0.1-100,0.2-50,0.1-60,0.3-40,0.5-100 mg/L in the standard solution range,and the correlation coefficient was from 0.999 2 to 0.999 8.The detect limits of the five polyphosphates(phosphate,pyrophosphate,tripolyphosphate,trimetaphosphate and hexametaphosphate)in aquatic products in the range of 0.5-3.0 mg/kg while the quantitative limits from2.0 to 5.0 mg/kg,and the average recoveries of polyphosphates in seafood spiked at the levels of 50,100,200 μg/kg from 80.2 to 100.3,while relativestandard deviations all less than 9%.With the advantages of simple operation,fast detection speed,good selectivity,good accuary and high precision,the method could be used as an ideal method for determination of polyphosphates in aquatic products.

ion chromatography;polyphosphates;aquatic products;determination method

TS254.7

：A

2016-12-15

常家琪（1993-），女，河南漯河人，研究方向：食品加工與安全.E-mail:m15257074549@163.com

梅光明，高級(jí)工程師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全.E-mail:meigm123@163.com

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