卞光明，王娜泠，胡則輝，王躍斌，胡成碩，柴學(xué)軍

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

舟山帶魚線粒體COI基因SNP位點(diǎn)分析

卞光明，王娜泠，胡則輝，王躍斌，胡成碩，柴學(xué)軍

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

為探討舟山帶魚種質(zhì)狀況，本研究利用直接測(cè)序法對(duì)舟山帶魚線粒體COI基因進(jìn)行SNP挖掘分析，獲得長(zhǎng)度一致的985 bp基因片段，檢測(cè)到22個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)SNP位點(diǎn)在樣品中分布情況分析，發(fā)現(xiàn)部分SNP位點(diǎn)分布情況類似甚至完全相同，推測(cè)基于線粒體COI基因片段不同位點(diǎn)突變可能存在關(guān)聯(lián)性。

帶魚；線粒體COI基因；SNP；關(guān)聯(lián)性

舟山帶魚Trichiurus lepturus是舟山漁場(chǎng)最重要的海洋捕撈經(jīng)濟(jì)魚類，是全國(guó)首批海鮮類地理標(biāo)志證明商標(biāo)海鮮，其眼睛呈黑色、骨小體肥、背脊無(wú)凸骨、鱗片易脫落、肉質(zhì)鮮而不腥，與其他帶魚相比，具有DHA成分、無(wú)大骨粒異物感，被稱為“世界上最好吃的帶魚”[1]。由于舟山帶魚捕撈強(qiáng)度過(guò)度、人工繁育技術(shù)難度較大以及生存環(huán)境變化，舟山漁場(chǎng)甚至出現(xiàn)無(wú)帶魚可撈現(xiàn)象，隨著休漁、種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)、產(chǎn)出控制等措施實(shí)施，帶魚資源狀況雖有所好轉(zhuǎn)，但群體小型化、年齡結(jié)構(gòu)失衡、產(chǎn)卵期延長(zhǎng)以及單位漁獲量下降等現(xiàn)象仍較為嚴(yán)峻[2]。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）嚴(yán)格遵守母系遺傳、分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，具有可溯源性等，常應(yīng)用于進(jìn)化生物學(xué)及群體遺傳學(xué)研究。細(xì)胞色素C氧化酶I亞基（cytochrome c oxidase subunit I,COI）攜帶的遺傳信息量大、進(jìn)化速率適中、中間解析能力強(qiáng)，已普遍應(yīng)用于銀鯧Pampus argenteus[3]、黃姑魚屬Nibea[4]、四指馬鲅屬 Eleutheronoma[5]、太湖新銀魚 Neosalanx taihuensis[6]、脊尾白蝦 Exopalaemon carinicauda[7]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[8]、大眼蟹屬M(fèi)acrophthalmus[9]、紫貽貝Mytilus galloprovincialis[10]以及厚殼貽貝Mytilus coruscus[11]等水生動(dòng)物種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、分子進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育。SNP分布廣、覆蓋率高、遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性豐富，直接測(cè)序法操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、無(wú)需通過(guò)多個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建遺傳圖譜，特別適合魚類等較小目的基因片段研究[12]。目前所報(bào)道的研究主要采用 16S rRNA[13]、18S rDNA[14]、D-loop[15-16]、COI[17]、SSR[18]分析不同海域帶魚群體，未見具體分析舟山帶魚線粒體COI基因SNP位點(diǎn)特性研究。本研究利用直接測(cè)序法對(duì)舟山帶魚的線粒體COI基因區(qū)域進(jìn)行SNP位點(diǎn)挖掘和分析，以期為舟山帶魚遺傳學(xué)研究、種質(zhì)資源的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用60個(gè)帶魚樣品由雙拖船取自舟山朱家尖附近海域（122°47′E，29°97′N），取樣時(shí)間為2016年4月中旬，現(xiàn)場(chǎng)取樣并剪下背部肌肉于95%酒精中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-20℃保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

按照天根海洋動(dòng)物基因組提取試劑盒操作說(shuō)明提取總基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性后，用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量與濃度，稀釋為50 ng/μL，-20℃保存待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

從GenBank中下載帶魚線粒體全基因組序列[19]，用Oligo7軟件[20]設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，目的片段大小在1 200 bp左右，引物序列為COI-F：CTTATCCGAGCAGAACTAAG，COI-R：ACGGCTCCTATTGATAGAAC，退火溫度55℃左右，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR 反應(yīng)總體系為 50 μL，模板 DNA 100 ng，0.5 μL 上、下游引物（10 μmol/L），1 μL dNTP（10 mmol/μL），5 μL 10×Buffer（含Mg2+），0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），去離子水補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用ContigExpress Project[21]對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，再使用BioEdit[22]對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)篩選，利用Chromas 2.4.1分析序列峰圖，以測(cè)序波峰整齊，沒(méi)有雜峰，突變堿基位點(diǎn)樣品數(shù)不少于2個(gè)的位點(diǎn)記作有效突變位點(diǎn)，以排除測(cè)序機(jī)器誤讀或錯(cuò)讀產(chǎn)生的變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖如圖1所示，Marker為2 000 bp，從下至上依次為（100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp），從電泳圖上可觀察到，產(chǎn)物片段的大小與設(shè)計(jì)的目的片段的長(zhǎng)度一致（1 200 bp），且條帶明亮、清晰，沒(méi)有雜帶，滿足直接測(cè)序的要求。

2.2 SNP位點(diǎn)峰圖

圖1 部分PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis results of part PCR product

本文對(duì)三個(gè)突變頻率大于25%的SNP位點(diǎn)進(jìn)行峰圖分析（23位點(diǎn)、500位點(diǎn)、773位點(diǎn)），位點(diǎn)具體突變形式如圖2～4所示，三個(gè)SNP位點(diǎn)波峰整齊、無(wú)雜峰。

SNP23突變形式：C/T轉(zhuǎn)換

SNP500突變形式：T/C轉(zhuǎn)換

SNP 773突變形式：G/A轉(zhuǎn)換

圖2 COI基因23位點(diǎn)突變形式Fig.2 Mutation forms of COI gene at 23rdlocus

圖3 COI基因500位點(diǎn)突變形式Fig.3 Mutation forms of COI gene at 500thlocus

圖4 COI基因733位點(diǎn)突變形式Fig.4 Mutation forms of COI gene at 733rdlocus

2.3 SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析

使用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序序列比對(duì)分析，刪除兩端不穩(wěn)定序列，獲得985 bp基因片段，共檢測(cè)到22個(gè)變異位點(diǎn)，檢測(cè)到SNP位點(diǎn)具體情況見表1，773位點(diǎn)、23位點(diǎn)、500位點(diǎn)以及953位點(diǎn)突變率較高，分別為43.67%、25.00%、25.00% 以及23.33%。

表1 COI基因序列部分區(qū)域SNP位點(diǎn)Tab.1 SNPs identified in COI gene subregio

表2為SNP位點(diǎn)在60個(gè)帶魚樣品中的具體分布情況，從表中可以發(fā)現(xiàn)，815位點(diǎn)、857位點(diǎn)、968位點(diǎn)以及983位點(diǎn)發(fā)生突變可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，位點(diǎn)突變率均為18.33%，在11個(gè)樣品中均檢測(cè)到且分布情況完全一致；位點(diǎn)119、位點(diǎn)404以及位點(diǎn)977的位點(diǎn)突變率為6.67%；位點(diǎn)353與位點(diǎn)413的位點(diǎn)突變率為6.67%，在樣品中的分布情況也呈現(xiàn)一致，雖然突變數(shù)量較少（位點(diǎn)突變率僅為6.67%），但不排除相關(guān)位點(diǎn)之間的突變存在關(guān)聯(lián)性。除此以外，440位點(diǎn)、500位點(diǎn)以及953位點(diǎn)在樣品中的分布情況相似度也較高。

表2 SNP位點(diǎn)在樣品中的分布情況Tab.2 The distribution of SNP locus in samples

續(xù)表

3 討論

本文采用直接測(cè)序法對(duì)帶魚COI基因進(jìn)行測(cè)序，有效避免傳統(tǒng)基因克隆方法對(duì)變異位點(diǎn)分型產(chǎn)生誤讀、錯(cuò)讀等影響。在獲得的985 bp片段中檢測(cè)到22個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為0.021 3，與帶魚其他相關(guān)研究結(jié)果相近[17]。根據(jù)Chromas 2.4.1分析序列峰圖所示，變異位點(diǎn)峰圖清晰、無(wú)雜帶，能夠?qū)NP位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)。對(duì)線粒體COI基因片段SNP位點(diǎn)在60個(gè)舟山帶魚樣品中的分布情況統(tǒng)計(jì)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)一些SNP位點(diǎn)變異頻率以及分布情況存在相似性甚至完全相同，關(guān)于不同位點(diǎn)變異是否存在關(guān)聯(lián)性，還有待于進(jìn)一步研究。

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Analysis on Mitochondrial COI Gene SNP Loci of Trichiurus lepturus from Zhoushan Sea Area

BIAN Guang-ming,WANG Na-ling,HU Ze-hui,et al
(Marine and Fisheries Institute of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Marine Fisheries Institute,Zhoushan 316021,China)

To investigate the germplasm resources of Trichiurus lepturus collected from Zhoushan coastal sea area,SNP loci and analysis based on mtDNA COI gene were carried out using direct sequencing technique.The fragments with the length of 985 bp were obtained,detecting 22 SNP locus.According to the similar or even identical distribution of SNP locus in samples,there may be a correlation between mutations of mtDNA COI gene fragments at different sites.

Trichiurus lepturus;mitochondrial COI gene;SNP;correlation

Q953+.3

：A

2016-11-10

浙江省科技廳合作與轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2013F50003）；舟山市公益項(xiàng)目（2015C31013）

卞光明（1992-），男，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：種質(zhì)與種苗工程.E-mail:mingbg@163.com

柴學(xué)軍（1972-），男，教授級(jí)高工，研究方向：魚類繁育與海洋生物技術(shù).E-mail:chaixj6530@sohu.com

1008－830X(2017)01－0019－06