李小梅鄭美瑜汪麗霞徐小忠陸勝民

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院；3.浙江柚都生物科技有限公司）

常山縣不同區(qū)域胡柚果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中黃酮含量的監(jiān)測(cè)

李小梅1，2鄭美瑜1汪麗霞3徐小忠3陸勝民1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院；3.浙江柚都生物科技有限公司）

常山胡柚的植物學(xué)名為Citrus Paradisi cv.Changshanhuyou，起源于常山縣青石鄉(xiāng)胡家村，又稱“仙柚”、“孝子柚”、“長(zhǎng)壽柚”，是優(yōu)良的柚子與其它柑橘自然雜交品種[1]。常山胡柚因其具有耐瘠、耐寒、耐貯等優(yōu)良品質(zhì)，被譽(yù)為“中華第一雜柑”，至今已有100多年的栽培歷史[2]。其果實(shí)富含多種維生素和人體所必須的18種氨基酸以及磷、鉀、鐵、鈣等微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高[3]，并具有穩(wěn)定血糖、排毒養(yǎng)顏、生津止渴、解酒醒腦、消食利尿、鎮(zhèn)咳化痰、清熱解毒、延年益壽等諸多功效[4]。此外，胡柚中還含有多種有益于健康的功能性成分，主要有黃酮類化合物、檸檬苦素類化合物和類胡蘿卜素等[5]，是一種良好的純天然保健食品，其中黃酮類化合物是含量最豐富的一類活性物質(zhì)，大量地存在于胡柚幼果和成熟果皮中，代表性的為柚皮苷和新橙皮苷[6,7]。

本文對(duì)常山縣產(chǎn)區(qū)不同區(qū)域的胡柚果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的主要黃酮類成分含量進(jìn)行測(cè)定，以確定胡柚成熟過(guò)程中黃酮類物質(zhì)的變化規(guī)律，為合理疏果時(shí)間和提取原料的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胡柚，采摘區(qū)域?yàn)獒橹菔谐Ｉ娇h15個(gè)村（蔣蓮鋪村（十八里）、小白石村、紅旗村、龍繞、同弓山、太公山（趙）、太公山、新品種、青石、閣底、五里、大橋、東案、老塢、丁家塢），分別于2015年6月上旬、6月下旬、7月上旬、7月下旬、8月上旬、8月下旬、9月、10月采摘，共8個(gè)批次。所有胡柚果實(shí)均切成小塊，自然風(fēng)干，干燥后粉碎，過(guò)40目篩。

1.2 試劑與儀器

甲醇，冰醋酸，均為分析純；乙腈，色譜純；蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司。

BS200S-WE1電子天平，余姚金諾電子天平儀器有限公司；BJ-200型高速多功能粉碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；LXJ－HB 飛鴿離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；U3000高效液相分析儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HPLC條 件[8]。 色 譜 柱 ：ODS C18柱（SunFire5um，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相：水和乙腈，采用梯度洗脫，洗脫梯度為：0～15min，乙腈為20%；15～35min，乙腈為20%～60%；35～40min，乙 腈 為60%～100%；42～45min，乙腈為100%～20%；45～50min，乙腈為20%。流速：1mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.2 蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品蕓香柚皮苷5mg、柚皮苷5mg、橙皮苷5mg和新橙皮苷10mg，用甲醇超聲波輔助溶解于25mL容量瓶中，定容，制得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液。

1.3.3 蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用移液槍分別移取0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL的上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液于6個(gè)10mL的容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度線，即得6個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.4 胡柚中黃酮的提取。準(zhǔn)確稱取各個(gè)區(qū)域每個(gè)批次的干燥樣品各1g于錐形瓶中，加入15mL甲醇，在超聲功率為500W、超聲溫度為45℃的條件下提取30min，提取后離心5min，傾出上清液，濾渣再超聲兩次（每次加入15mL甲醇，超聲提取30min，離心，傾出上清液），合并三次提取液，并定容至50mL容量瓶中[9]。用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。重復(fù)三次，取平均值。

圖1 蕓香柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.1色譜條件，測(cè)定不同濃度下的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1～4)。

2.2 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中蕓香柚皮苷的含量分析

根據(jù)1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中的蕓香柚皮苷含量進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，常山縣15個(gè)村的胡柚中蕓香柚皮苷的含量普遍較低，從平均含量來(lái)看，其中太公山、丁家塢、同弓山、紅旗村和青石的胡柚中蕓香柚皮苷的含量相對(duì)較高，而五里、東案、太公山（趙）和龍繞的胡柚中含量較低。在6月上旬到7月上旬胡柚中蕓香柚皮苷的含量較高，而在7月下旬急劇下降，8月上旬到10月隨著胡柚的逐漸成熟蕓香柚皮苷的含量緩慢下降，其中10個(gè)村的胡柚中蕓香柚皮苷的含量均在6月下旬達(dá)到最高。常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中，青石村6月下旬的胡柚中蕓香柚皮苷的含量最高為26.10mg/g，其次是龍繞村6月下旬的胡柚，其蕓香柚皮苷的含量為25.27mg/ g。所以應(yīng)采摘青石和龍繞6月下旬的胡柚進(jìn)行蕓香柚皮苷的研究。

表1 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中蕓香柚皮苷的含量（mg/g）

2.3 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中柚皮苷的含量分析

根據(jù)1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中的柚皮苷含量進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，常山縣15個(gè)村的胡柚中柚皮苷的含量均較高，從平均含量來(lái)看，其中新品種、紅旗村、同弓山、太公山和小白石村的胡柚中柚皮苷的含量相對(duì)較高，而蔣蓮鋪村（十八里）、閣底、太公山（趙）和龍繞的胡柚中含量較低。從6月上旬到10月，隨著胡柚的成熟柚皮苷的含量逐漸下降，其中11個(gè)村的胡柚中柚皮苷的含量均在6月上旬最高。常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中，老塢村6月上旬的胡柚中柚皮苷含量最高為144.40mg/g，其次是東案村6月上旬的胡柚，其柚皮苷含量為141.05mg/g。所以應(yīng)采摘老塢和東案6月上旬的胡柚進(jìn)行柚皮苷的研究。

表2 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中柚皮苷的含量（mg/g）

2.4 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中橙皮苷的含量分析

根據(jù)1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)常山縣15十五個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中的橙皮苷含量進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，常山縣15個(gè)村的胡柚中的橙皮苷的含量普遍較低，從平均含量來(lái)看，其中太公山（趙）、太公山、同弓山、紅旗村和大橋的胡柚中橙皮苷的含量相對(duì)較高，而五里、青石、老塢、閣底和龍繞的胡柚中含量較低。在6月上旬和6月下旬，胡柚中橙皮苷的含量較高，而在7月上旬快速下降，從7月下旬到10月隨著胡柚的逐漸成熟橙皮苷的含量緩慢下降，其中13個(gè)村的胡柚中橙皮苷的含量均在6月上旬最高。常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中，同弓山村6月上旬的胡柚中橙皮苷含量最高為32.11mg/g，其次是太公山（趙）六月下旬的胡柚，其橙皮苷含量為32.04mg/g。所以應(yīng)采摘同弓山6月上旬的胡柚或太公山（趙）6月下旬的胡柚進(jìn)行橙皮苷的研究。

表3 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中橙皮苷的含量（mg/g）

2.5 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中新橙皮苷的含量分析

根據(jù)1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中的新橙皮苷含量進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，常山縣15個(gè)村的胡柚中的新橙皮苷的含量普遍較高，從平均含量來(lái)看，其中紅旗村、同弓山、小白石村、太公山（趙）和新品種的胡柚中新橙皮苷的含量相對(duì)較高，而青石、老塢、閣底和龍繞的胡柚中含量較低。15個(gè)村的胡柚中新橙皮苷的含量都在6月上旬為最大值，且?guī)缀鯙?月下旬的兩倍，從7月上旬到10月隨著胡柚的逐漸成熟新橙皮苷的含量緩慢下降。常山縣15個(gè)村6～10月份的胡柚樣品中，太公山（趙）6月上旬的胡柚中新橙皮苷含量最高為158.82mg/ g，其次是太公山6月上旬的胡柚，其新橙皮苷含量為149.94mg/g。所以應(yīng)采摘太公山（趙）和太公山6月上旬的胡柚進(jìn)行新橙皮苷的研究。

2.6 胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中四種黃酮含量的變化

由圖5可知，不同生長(zhǎng)時(shí)期常山胡柚中四種黃酮的含量隨著果實(shí)的成熟而逐漸下降。在6月上旬時(shí)柚皮苷和新橙皮苷的含量均非常豐富，高達(dá)116.88mg/g和121.91mg/ g。從6月上旬到7月下旬柚皮苷和新橙皮苷的含量下降明顯，7月下旬到8月下旬，則趨于穩(wěn)定，但仍有緩慢降低的趨勢(shì)，在9月份，兩種黃酮的含量均有所增長(zhǎng)。而蕓香柚皮苷的含量在6月下旬達(dá)到最大值，之后也一直緩慢下降，橙皮苷的含量則一直保持緩慢下降。所以應(yīng)當(dāng)采用6月上旬胡柚進(jìn)行黃酮的提取制備。

表4 不同區(qū)域胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中新橙皮苷的含量（mg/g）

圖5 胡柚生長(zhǎng)過(guò)程中四種黃酮含量的變化

3 結(jié)論

本文監(jiān)測(cè)了常山縣15個(gè)主栽村的胡柚在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中主要黃酮類成分含量的變化規(guī)律，得到如下結(jié)論。

3.1 四種黃酮中，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量最高的分別是太公山、新品種、太公山（趙）和紅旗村的胡柚，含量分別為11.17mg/g、65.76mg/g、10.51mg/g和49.00mg/ g；龍繞胡柚中的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量均為最低，分別為7.57mg/g、40.93mg/g、6.56mg/g和31.17mg/g。

3.26 ～10月份的胡柚中四種黃酮總含量大小按時(shí)間排序依次為：6月上旬＞6月下旬＞7月上旬＞9月＞7月下旬＞8月上旬＞8月下旬＞10月。

3.3 常山胡柚中的黃酮主要為柚皮苷和新橙 皮 苷 ，平 均 含 量 分 別 為54.51mg/g和39.61mg/g，而蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量較少，平均含量只有8.97mg/g和7.90mg/g。

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2017-04-18

浙江省重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2014C02021）