孫 婷，黨瑞華，黃永震，藍(lán)賢勇，梁小軍，陳 宏，雷初朝﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002)

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科學(xué)試驗(yàn)

黃陂牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究

孫 婷1，黨瑞華1，黃永震1，藍(lán)賢勇1，梁小軍2，陳 宏1，雷初朝1﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002)

【目的】探究黃陂牛的遺傳多樣性與母系起源。【方法】采用PCR擴(kuò)增、測(cè)序及生物信息學(xué)方法。【結(jié)果】在21頭黃陂牛mtDNA D-loop區(qū)共檢測(cè)到55個(gè)變異位點(diǎn)，定義了10個(gè)mtDNA單倍型，平均單倍型多樣度為0.7760，平均核苷酸多樣度為0.0234，表明黃陂牛具有豐富的遺傳多樣性。構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表明黃陂牛具有瘤牛和普通牛兩個(gè)母系起源?！窘Y(jié)論】黃陂牛有豐富的遺傳多樣性，有瘤牛和普通牛兩個(gè)母系起源，且受瘤牛的影響較大。

黃陂牛；mtDNA D-loop；遺傳多樣性；母系起源

中國(guó)黃牛的品種數(shù)量多且分布范圍廣泛，是世界牛屬遺傳資源的重要組成部分。目前，我國(guó)有53個(gè)地方黃牛品種[1]。按地理分布區(qū)域的不同，將中國(guó)黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛三大類[2]。黃陂牛屬于南方黃牛，是一個(gè)役肉兼用型優(yōu)良地方品種，主要分布在武漢市黃陂區(qū)，故被命名為黃陂牛[3]。1982年，全國(guó)品種志編委會(huì)將分布在大別山及其周邊地區(qū)的黃牛統(tǒng)一命名為大別山黃牛，黃陂牛也屬于此類[3]。

哺乳動(dòng)物線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一個(gè)雙鏈閉合的環(huán)狀DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遵循母系遺傳、無重組、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，在動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育、演化及遺傳多樣性方面得到廣泛應(yīng)用[4]。和其他哺乳動(dòng)物一樣，牛的mtDNA由37個(gè)蛋白編碼基因和一段910 bp的D-loop區(qū)組成[5]。Yu等[6]對(duì)12個(gè)中國(guó)南方牛品種154個(gè)個(gè)體進(jìn)行mtDNA RFLP分析，結(jié)果表明普通牛和瘤牛是中國(guó)南方牛的主要起源。Lai等[7]通過對(duì)84頭中國(guó)黃牛mtDNA D-loop區(qū)的研究表明中國(guó)黃牛可以分為普通牛和瘤牛兩大來源，且瘤牛對(duì)中國(guó)南方牛的影響更大。Lei等[8]對(duì)中國(guó)黃牛mtDNA D-loop全序列的研究也表明中國(guó)黃牛是瘤牛與普通牛的混合母系起源。本研究對(duì)黃陂牛的mtDNA D-loop全序列進(jìn)行測(cè)定，分析黃陂牛的遺傳多樣性及母系起源，為黃陂牛的保種與利用提供遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集18頭黃陂牛耳組織樣，用75%酒精保存，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩腉enBank上下載了3條黃陂牛序列，其登錄號(hào)為：AY521096-AY521098，并分別下載了一條印度瘤牛序列(L27733)和一條德國(guó)普通牛序列(AF492351)作為對(duì)照。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增測(cè)序

采用酚-氯仿法提取基因組DNA。采用雷初朝等[9]設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增線粒體DNA D-loop全序列，正鏈引物和反鏈引物分別為：F：5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; R：5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將符合測(cè)序要求的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法

利用DNASTAR軟件包中的SeqMan程序?qū)π蛄羞M(jìn)行人工校對(duì)，確保所測(cè)序列的準(zhǔn)確性。用DNASP 5.0計(jì)算單倍型多樣度、核苷酸多樣度、Tajima's D值、Fu's Fs 值等。用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃陂牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

本文分析的21條黃陂牛mtDNA D-loop全序列長(zhǎng)度在909-911 bp之間，其中，有8個(gè)是909 bp，有10個(gè)是910 bp，有3個(gè)是911 bp。mtDNA D-loop區(qū)的長(zhǎng)度變化主要是由于存在插入缺失而導(dǎo)致的。黃陂牛mtDNA D-loop全序列由A、T、C、G四種堿基組成，其中A堿基含量最高(33.20%)，其次為T(28.30%)和C(25.00%)，G堿基含量最低，僅為13.50%。A+T的平均含量為61.50%，G+C的平均含量為38.50%，A+T的平均含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出堿基的偏好性。

對(duì)21條黃陂牛mtDNA D-loop全序列進(jìn)行比對(duì)，共檢測(cè)到55個(gè)變異位點(diǎn)，包括54個(gè)轉(zhuǎn)換，1個(gè)顛換。這55個(gè)變異位點(diǎn)定義了10種單倍型，其平均單倍型多樣度(Hd)為0.7760，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0234，平均核苷酸差異(k)為21.2190。

圖1 21個(gè)黃陂牛個(gè)體 mtDNA D-loop區(qū)10個(gè)單倍型的多態(tài)位點(diǎn)“.”代表與第一條序列相同。

對(duì)黃陂牛進(jìn)行錯(cuò)配分布分析(圖2)，分布圖呈現(xiàn)多峰，表明黃陂黃牛過去沒有經(jīng)歷過強(qiáng)烈的群體擴(kuò)張。且對(duì)黃陂牛進(jìn)行中性檢驗(yàn)，Tajima's D值(1.4533)和Fu's Fs(0.8913)值均差異不顯著(P>0.10)，也表明黃陂牛在過去沒有經(jīng)歷過群體擴(kuò)張，群體數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定。

圖2 黃陂牛不配對(duì)分布圖。實(shí)線代表穩(wěn)定種群的期望錯(cuò)配分布；虛線代表錯(cuò)配分布的觀察值。

2.2 黃陂牛NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

利用MEGA5.0軟件對(duì)黃陂牛進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以印度瘤牛(L27733)和德國(guó)普通牛(AF492351)作為參考序列，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可以看出，黃陂牛被分為瘤牛和普通牛兩大支系，說明黃陂牛是瘤牛與普通牛的混合母系起源。

圖3 黃陂牛10個(gè)mtDNA D-loop單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹

3 討論

本文分析了21頭黃陂牛的mtDNA D-loop區(qū)全序列，其四種堿基的含量分別為：A(33.20%)、T(28.30%)、C(25.00%)、G(13.50%)，表現(xiàn)出堿基的偏好性，這是一般多細(xì)胞動(dòng)物mtDNA的顯著特征[10]。A+T(61.50%)的平均含量明顯高于G+C(38.50%)，而在綿羊[11]、山羊[12]、牦牛[13]、豬[14]、雞[15]等的研究結(jié)果也表明，mtDNA D-loop區(qū)的A+T 含量高于G+C含量，說明動(dòng)物mtDNA D-loop區(qū)的核苷酸含量在物種間有一定的相似性。

單倍型多樣度(Hd值)和核苷酸多樣度(Pi值)是衡量一個(gè)群體 mtDNA 變異程度的重要指標(biāo)[16]，單倍型多樣度和核苷酸多樣度的值越大，說明群體的遺傳多樣性越豐富，反之，則說明群體的遺傳多樣性越缺乏。周艷等[17]對(duì)8個(gè)中國(guó)南方牛品種的mtDNA D-loop區(qū)研究表明，其單倍型多樣度為0.2860～0.9000，核苷酸多樣度位0.0003～0.2840，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。黃陂牛在地理分布上屬于南方牛，本研究中的21頭黃陂牛的mtDNA D-loop區(qū)的單倍型多樣度(Hd)為0.7760，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0234，說明黃陂牛也具有豐富的遺傳多樣性。構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹將黃陂牛分為瘤牛和普通牛兩大支系，在21個(gè)黃陂牛個(gè)體中，13個(gè)瘤牛起源的個(gè)體(占61.90%)共享4個(gè)單倍型，8個(gè)普通牛起源的個(gè)體(占38.10%)共享6個(gè)單倍型，表明黃陂牛受瘤牛的影響更大。Lai等[7]、周艷等[17]的研究結(jié)果也表明中國(guó)南方黃牛受瘤牛的影響更大?？傊狙芯拷Y(jié)果表明，黃陂牛mtDNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性比較豐富，具有普通牛和瘤牛兩大母系起源，且受瘤牛的影響更大。

[1] 國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì).中國(guó)畜禽遺傳資源志—牛志 [M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[2] 《中國(guó)牛品種種志》編寫組.中國(guó)牛品種志[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1988.

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Genetic Diversity of Mitochondrial DNA D-loop Region in Huangpi Cattle

SUN Ting1,DANG Rui-hua1,HUANG Yong-zhen1,LAN Xian-yong1,LIANG Xiao-jun2,CHEN Hong1,LEI Chu-zhao1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.InstituteofAnimalScience,NingxiaAcademyofAgricultureandForestryScience,Yinchuan,Ningxia,750002,China)

【Objective】The aim of the study was to analyze the genetic diversity and maternal origin of Huangpi cattle.【Method】 The complete mitochondrial DNA (mtDNA) D-loop regions of 21 Huangpi cattle were analyzed using PCR,sequencing and bioinformatics methods.【Result】There were 55 polymorphic sites were detected in mtDNA D-loop of Huangpi cattle,which constituted10 haplotypes.The average haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.7760 and 0.0234,respectively,which indicated that the genetic diversity of Huangpi cattle was abundant.The NJ tree indicated that Huangpi cattle had two types of maternal origins from Bos taurus and Bosindicus.【Conclusion】The genetic diversity of Huangpi cattle was abundant.Huangpi cattle had two types of maternal origins from Bos taurus and Bosindicus,and Bosindicus contributed more.

Huangpi cattle;mt DNA D-loop;genetic diversity;maternal origin

7-02-10

2017-02-15

國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助(CARS-38)

孫 婷(1989-)，女，陜西鳳翔人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳資源研究。

*通訊作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常寧人，教授，博導(dǎo)，主要從事牛遺傳資源研究。

S823

A

1001-9111(2017)03-0001-03