楊文祥，孫政國(guó)，金穗華

(1.江蘇省興化市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 興化 225700；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210014；3.農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)中心(南京) 江蘇 南京 210095)

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家畜精(子)細(xì)胞染色方法的比較與評(píng)價(jià)

楊文祥1，孫政國(guó)2，金穗華3*

(1.江蘇省興化市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 興化 225700；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210014；3.農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)中心(南京) 江蘇 南京 210095)

為進(jìn)一步提高家畜精子形態(tài)檢驗(yàn)的科學(xué)性和客觀性，本文結(jié)合種公畜精液生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗(yàn)，對(duì)精子形態(tài)的檢驗(yàn)應(yīng)用姬姆薩染色法、考馬斯亮藍(lán)染色法和伊紅—苯胺黑染色法進(jìn)行了比較、分析。結(jié)果表明，三種方法中姬姆薩染色法對(duì)精子細(xì)胞的染色效果最好，可視精液質(zhì)量檢驗(yàn)的不同要求選擇不同方法。

家畜; 精(子)細(xì)胞; 染色方法; 姬姆薩染色法; 考馬斯亮藍(lán)染色法; 伊紅—苯胺蘭染色法

家畜精液中精子所具有的生物學(xué)特性(質(zhì)量性狀)均與母畜受精有密切的關(guān)系[1]，其中精子形態(tài)是評(píng)價(jià)精液質(zhì)量的一項(xiàng)必不可缺少的技術(shù)參數(shù)；而檢驗(yàn)方法作為評(píng)價(jià)的技術(shù)手段，一直受到人們的關(guān)注。近年來(lái)對(duì)于精子形態(tài)檢驗(yàn)方法的研究與探討仍在繼續(xù)，本文對(duì)于不同的檢驗(yàn)方法的比較、分析，為進(jìn)一步提高精液質(zhì)量檢驗(yàn)方法的科學(xué)性與正確性，提供相關(guān)的試驗(yàn)基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

精液樣品，來(lái)自國(guó)內(nèi)各個(gè)家畜精液生產(chǎn)企業(yè)，涉及畜種有牛、豬和羊。

1.2 方法

1.2.1 姬姆薩染色法 姬姆薩染色液配制：見(jiàn)GB 4143中B5.2[2]，檢驗(yàn)樣品的取樣、抹片、固定、染色、鏡檢和計(jì)算(形態(tài)異常率)的操作，按照GB 4143中附錄B.5.3[2]。

1.2.2 考馬斯亮蘭染色法 高氯酸考馬斯亮藍(lán)染色液配制：取考馬斯亮藍(lán)R250(普通染料)50 mg，溶于100 mL蒸餾水，煮沸溶解，過(guò)濾后。加入高氯酸3.5 mL。

檢驗(yàn)樣品取樣、抹片、固定、鏡檢和計(jì)算(形態(tài)異常率)的操作，按照GB 4143中附錄B.5.3[2]，染色時(shí)間5～10 min。

1.2.3 伊紅—苯胺蘭染色法 伊紅苯胺蘭染液配制：分別取0.5%伊紅染液和1%苯胺蘭染液按照1︰2的比例混合。

取伊紅苯胺蘭染液5～10uL滴于載玻片的一端，另取等量精液與染液混勻后，立刻抹片，抹片操作見(jiàn)GB 4143中附錄B.5.3[2]。

1.3 形態(tài)觀察與 圖像采集

染色樣片自然晾干，在顯微鏡400～600倍和1000倍(油鏡)下觀察精子形態(tài)的染色效果(部分伊紅—苯胺蘭染色樣片采用暗視野觀察)，應(yīng)用JD801精子圖像分析軟件進(jìn)行拍攝和處理。

2 結(jié)果

2.1 圖像比較

對(duì)公牛、種豬和綿羊精液用三種不同染色方法進(jìn)行了取樣染色，對(duì)精子圖像觀察選擇了以形態(tài)(輪廓)、頭部(頂體)、尾部(細(xì)胞膜)作為評(píng)價(jià)部位，具體見(jiàn)表1。

從表1中的精子形態(tài)圖像比較看出，不同染色方法對(duì)精子的染色效果不盡一致。特別是對(duì)精子細(xì)胞膜的表現(xiàn)效果，姬姆薩染色效果最為理想。

3 討論

3.1 染色方法

3.1.1 姬姆薩染色法 主要優(yōu)點(diǎn)是染色后樣片在顯微鏡下觀察，精子呈深紫紅色，底色為空白，不論400～600倍還是1000倍均可達(dá)到清晰觀察精子形態(tài)變化的效果，特別是在1000倍油鏡下對(duì)于精細(xì)胞質(zhì)膜的變化，精子頭部頂體結(jié)構(gòu)是否異常、尾部質(zhì)膜是否受損及受損程度，都可以清晰的鑒別和評(píng)價(jià)。肖婉芬等人應(yīng)用對(duì)瑞氏-姬姆薩與巴氏染色法對(duì)精子形態(tài)染色效果的試驗(yàn)，結(jié)果表明：姬姆薩染色法是一種簡(jiǎn)單有效的精子形態(tài)染色方法[3]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于種畜精子形態(tài)的常規(guī)檢驗(yàn)，在GB4143-84[2]、GB23238-2009[4]、GB20557-2006[5]等標(biāo)準(zhǔn)均明確應(yīng)用姬姆薩染色法。

表1 不同染色方法的精子形態(tài)圖像比較

3.1.2 考馬斯亮蘭染色法 在蛋白質(zhì)染色方法中，目前以考馬斯亮藍(lán)染色最為常用。國(guó)內(nèi)有技術(shù)人員人試驗(yàn)用考馬斯亮蘭染色法對(duì)家畜精子作為快速染色和精子形態(tài)鑒別方法，樣品染色后在顯微鏡下觀察，精子為淡紫色，頭部、頂體著色不明顯，尾部顏色略深，染色效果與姬姆薩染色法比較，有不同結(jié)果的報(bào)道，主要是在對(duì)精子頭部及頂體結(jié)構(gòu)變化的鑒別。對(duì)人類精子形態(tài)的檢測(cè)，采用考馬斯亮蘭染色法，高久春等用改良巴氏染色法、瑞-吉(姬)染色法和考馬斯亮藍(lán)染色法精液涂片染色，檢測(cè)、計(jì)算形態(tài)正常精子率和頂體完整率，結(jié)論：瑞-吉(姬)染色法更適于頂體完整率判讀[6]。

3.1.3 伊紅—苯胺蘭染色法 在上世紀(jì)八十年代曾作為精液中活精子計(jì)數(shù)方法之一，其原理是利用活精子對(duì)特定染料不著色的特點(diǎn)來(lái)區(qū)分計(jì)算死、活精子的比例；顯微鏡下觀察，活精子不著色(無(wú)色)，死精子呈粉紅色，苯胺黑(蘭)為背景襯托，以此作為目測(cè)評(píng)定精子活力的校正參考。以后有人提出甘油對(duì)精子著色有干擾，使精子可滲透性增加，著色精子增多，不便用于冷凍精液的精子形態(tài)鑒別[7 ]。以后對(duì)于精子細(xì)胞的染色、觀察應(yīng)用不多，近期有人提出以此作為精子形態(tài)檢驗(yàn)的快速染色方法，在試驗(yàn)中，400～600倍和1000倍下觀察，精子形態(tài)的輪廓可以看到，但對(duì)于精細(xì)胞膜的變化，特別是頭部、頂體部和尾部細(xì)胞膜的損傷和缺陷，與姬姆薩、考馬斯亮蘭染色法比較，難以清晰顯示。在高倍鏡下觀察時(shí)，精子未著色形態(tài)難以鑒別，特別是頂體部位不宜區(qū)分。Oral[8]等認(rèn)為未著色的精液涂片僅適用于分析形態(tài)正常精子?！禬HO人類精液分析與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版推薦的精子存活率試驗(yàn)方法分別是伊紅Y染色法、伊紅-苯胺蘭染色法和低滲膨脹試驗(yàn)，目前也多用于死、活精子的染色，少有用于精子形態(tài)的檢驗(yàn)。

3.1.4 染色技術(shù)要求與質(zhì)量控制 對(duì)于精子形態(tài)檢驗(yàn)染色方法的選擇，應(yīng)是操作過(guò)程簡(jiǎn)單，能夠獲得最佳色效果，保證精子形態(tài)檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。在染色過(guò)程中，應(yīng)注意對(duì)精子有最大保護(hù)，避免某些染色液(試劑)、溫度、pH值、滲透壓等物理因素對(duì)精子形態(tài)的損傷。

4 結(jié)論

任何染色方法的選擇是根據(jù)最終需要的染色效果決定的。試驗(yàn)表明，以上三種染色方法均可作為檢驗(yàn)精子形態(tài)的染色方法。姬姆薩染色法精子各部位著色效果好，特別是精細(xì)胞的質(zhì)膜和精子的頭部(頂體及核部位)、頸、尾部線粒體容易鑒別，而且染色簡(jiǎn)便,目前仍是實(shí)驗(yàn)室追求高質(zhì)量精子形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)的首選。

[1] 秦和春，金穗華.牛精液質(zhì)量與受精率的關(guān)系[J].畜牧與獸醫(yī),2007.39(4)：29-30.

[2] 牛冷凍精液GB4143-84[S].北京：中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).

[3] 肖婉芬,等.瑞氏-姬姆薩與巴氏染色法對(duì)精子形態(tài)染色效果比較[J].華中醫(yī)學(xué)雜志,2007.31(6)：436-438.

[4] 種豬常溫精液GB23238-2009[S].北京：中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).

[5] 山羊冷凍精液GB20557-2006 [S].北京：中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).

[6] 高久春，王瑞雪,等.精子形態(tài)學(xué)分析中染色方法的比較[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2005.31(05)：778-780.

[7] 馮建超.家畜繁殖技術(shù)進(jìn)展[M].重慶：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社重慶分社，1979：17-18.

[8] Oral E,Yetis O ,Elibol F,etal.Assessment of human spermmorphology by strict criteria:comparison of wet preparationversus stained with the modified Diff-Quik method[J] ArchAndrol,2002,48(4):307-314.

Comparison and Evaluation on Staining Methods of Livestock Sperm Cell

YANG Wen-xiang1,SUN Zheng-guo2,JIN Sui-hua3*

(1.XinghuaAnimalHealthSupervisionInstitute,Xinghua,Jiangsu,China225700; 2.CollegeofPratacultureScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,China210095; 3.QualitySupervisionandTestCenterofFrozenBovineSemenofMinistryofAgriculture(Nanjing),Nanjing,China210095)

In order to furtherimprove thecorrection and objectivity of morphology test of livestock sperm cell,three staining methods applied in the examination and test of livestock sperm morphology,namely Giemsa staining method,Coomassie blue staining method and eosin-nigrosine blue staining method,were analyzed and compared in this research,connecting with sire semen production.It is concluded that the staining effect by the Giemsa staining method was the best among the three methods,and the staining method could be selected in terms of the different requirements of the examination and test of semen quality using this method.

livestock;sperm cell;staining method;giemsa staining method;coomassie blue staining method;eosin-nigrosine blue staining method

7-03-06

2017-03-20

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目(SXGC[2014]246)

楊文祥(1967-)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

S814

A

1001-9111(2017)03-0024-03

*通訊作者：金穗華 (1948-)，男，江蘇南京，高級(jí)畜牧師，主要從事家畜繁殖與家畜精液質(zhì)量檢驗(yàn)技等方面的研究。