葉宗鑒李 靖黃 彥

（1.四川省成都市龍泉驛第一人民醫(yī)院，四川 成都 610100；2.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院，重慶401520；3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

·研究報(bào)告·

姜黃素對(duì)Lewis肺癌裸鼠Bcl-2、Bax和P53蛋白表達(dá)的影響*

葉宗鑒1李 靖2△黃 彥3

（1.四川省成都市龍泉驛第一人民醫(yī)院，四川 成都 610100；2.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院，重慶401520；3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目的 觀察姜黃素對(duì)Lewis肺癌裸鼠Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)的影響。方法 BALB/C裸鼠平均分為3組：空白組、模型組和姜黃素組，每組10只。各組小鼠右腋皮下接種Lewis瘤細(xì)胞，空白組除外?？瞻捉M與模型組灌胃0.5%的羥甲基纖維素鈉溶液，姜黃素組灌胃180 mg/kg姜黃素，連續(xù)7 d，每日1次。于末次給藥后處死小鼠，計(jì)算抑瘤率，采用Western blotting法檢測(cè)Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)姜黃素干預(yù)后，Lewis肺癌小鼠的腫瘤體積顯著縮小，Bcl-2和p53蛋白表達(dá)顯著減少，Bax的表達(dá)顯著升高。結(jié)論 姜黃素對(duì)lewis肺癌腫瘤生長有抑制作用，其機(jī)制可能和下調(diào)Bcl-2和P53水平，上調(diào)Bax水平有關(guān)。

姜黃素 Bcl-2 Bax p53

中國肺癌的發(fā)病率及死亡率位于全世界第1位［1］，每年死亡患者約160萬人。姜黃素（curcumin）是來自于姜科植物根莖中的一種多酚，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理活性［2-4］。研究表明［5］，姜黃素對(duì)多種腫瘤都具有顯著抑制作用，本實(shí)驗(yàn)通過研究姜黃素對(duì)Lewis肺癌小鼠的腫瘤抑制率、Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達(dá)等指標(biāo)的影響，探討姜黃素抗腫瘤的具體機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 純系SPF級(jí)BALB/C裸鼠，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證編號(hào)：SCXK（渝）2012-0001］。

1.2 藥物及儀器 姜黃素購自Sigma公司 （產(chǎn)品編號(hào)：C7746），溶于0.5%的CMC溶液中，備用。Lewis肺癌細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。Bcl-2、Bax及p53抗體購自Sigma公司，Western blotting相關(guān)試劑購自碧云天公司。低溫冷凍離心機(jī)購自美國Thermo公司；凝膠成像圖像分析系統(tǒng)購自美國科達(dá)公司。

1.3 造模、分組及給藥 于37℃、5%CO2的條件下對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，向10只BALB/C裸鼠右腋皮下注射肺癌細(xì)胞。7 d后，BALB/C裸鼠皮下瘤體明顯隆起，于無菌條件下剝離裸鼠腫瘤組織，研磨后制成腫瘤細(xì)胞懸液，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/0.2 mL。取0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液注射于20只BALB/C裸鼠右腋皮下。7 d后以裸鼠瘤直徑為5 mm視為造模成功，將接種成功的裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分配到模型組和姜黃素組，每組10只?？瞻捉M裸鼠僅于右腋下注射0.2 mL的PBS液。待腫瘤體積長到100 mm3后，以0.5%羥甲基纖維素鈉溶液灌胃空白組及模型組裸鼠，姜黃素組以180mg/kg的劑量灌胃姜黃素，每日1次，連續(xù)7 d。

1.4 姜黃素對(duì)Lewis小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響斷頭處死裸鼠，剝離右腋下腫瘤組織，稱質(zhì)量，測(cè)量體積，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.5 Western blotting法檢測(cè)腫瘤組織中Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達(dá) 將剝離的腫瘤組織，放入玻璃勻漿管，再加入蛋白裂解液，研磨勻漿，低溫離心取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。分別取15 μg總蛋白上樣，經(jīng)12%分離膠及5%濃縮膠SDSPAGE凝膠電泳，分離后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜。加入一抗，4℃過夜。加二抗，室溫孵育2 h，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光劑于暗室中曝光、顯影和定影。測(cè)定條帶蛋白的光密度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較采用Dunnett′s t檢驗(yàn)，多個(gè)組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠肺瘤質(zhì)量、抑瘤率比較 見表1。與空白組比較，模型組Lewis肺癌裸鼠腫瘤質(zhì)量及體積明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素組Lewis肺癌裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），腫瘤抑制率為29.31%。

表1 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

表1 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

與模型組比較，**P＜0.01。下同。

組 別 n 腫瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）空白組 10 0.00±0.00 -模型組 10 4.64±0.77 -姜黃素組 10 3.28±0.42**29.31

2.2 各組裸鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)的影響 見表2，圖1。與空白組相比，模型組Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素組Bcl-2和p53蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

3 討 論

姜黃素源自于姜科植物根莖中的一種多酚，安全無毒，目前已被聯(lián)合國衛(wèi)生組織食品藥品管理局批準(zhǔn)作為天然的食品添加劑。已有多項(xiàng)研究證實(shí)姜黃素具有顯著抗腫瘤作用，如卵巢癌、結(jié)腸癌等。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，也有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長［6-7］，是一種極具應(yīng)用前景的抗癌藥物。

表2 各組裸鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達(dá)（±s）

表2 各組裸鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和p53蛋白的表達(dá)（±s）

組別n p53 Bcl-2 Bax空白組 10 0.80±0.01**模型組 10 0.37±0.01 0.60±0.04**0.88±0.03**0.32±0.05 1.54±0.03姜黃素組 10 0.58±0.01**0.47±0.03**1.06±0.03**

圖1 各組裸鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)的Western blotting圖

細(xì)胞的增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多蛋白在細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。Bcl-2是Bcl-2基因家族和蛋白中研究最早的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因。Bcl-2是該家族中最有代表性的抑制凋亡蛋白［8］，而Bax蛋白是該家族中最有代表性的促進(jìn)凋亡蛋白［9］。Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的高低，與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)，Bcl-2水平升高會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，Bax水平升高則促進(jìn)凋亡。所以腫瘤細(xì)胞的生存受Bcl-2和Bax蛋白的共同影響［10］。p53蛋白是另一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或凋亡的蛋白，其不僅可轉(zhuǎn)錄活化多種靶基因如p21、p53DINPI、Bax等，還可通過轉(zhuǎn)錄非依賴的形式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［11］。p53是一種抑癌蛋白，被認(rèn)為是目前與腫瘤相關(guān)性最密切的癌基因之一［12］，且常與另外一些癌基因共同產(chǎn)生協(xié)同作用。在多種惡性腫瘤中p53呈現(xiàn)高表達(dá)［13］，因此降低腫瘤組織中p53的表達(dá)對(duì)腫瘤治療有重要意義［14］，p53也因此被認(rèn)為是多種腫瘤的診斷、治療與預(yù)后的重要分子標(biāo)志物［15］。

綜上所述，經(jīng)姜黃素治療的Lewis肺癌裸鼠，其腫瘤體積與質(zhì)量顯著降低，Bcl-2和p53蛋白的表達(dá)顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)顯著減少，提示姜黃素可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白而抑制Lewis肺癌腫瘤的生長，從而為姜黃素的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

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Effects of Curcumin on Bcl-2，Bax and p53 Expression in Lewis Lung Nude Mice

YE Zongjian，LI Jing，HUANG Yan. The First People's Hospital of Longquanyi，Sichuan，Chengdu 610100，China.

Objective：To investigate the effects of curcumin on Bcl-2，Bax and p53 expression in Lewis lung nude mice.Methods：Nude mice were divided into three groups：control group，tumor model group and curcumin treatment group（180 mg/kg）with 10 mice in each group.For preparation of transplanted tumor model，Lewis cells were subcutaneously injected into the right limb armpit of the BALB/C nude mice，except the control group.The mice of control group and tumor model group

0.5%CMC-Na solution by intragastric administration，once a day for 7 days.The mice of curcumin treatment group received suspension of curcumin 180 mg/kg by gavage once a day for 7 days.After final administration，the mice were killed and tumor inhibition rate was measured. Bcl-2，Bax and p53 protein expression was analyzed by Western blotting.Results：The lung tumor size reduced significantly in curcumin group.Bcl-2 and p53 protein expression decreased significantly in lung tumor tissues，while Bax expression increased.Conclusion：Curcumin inhibits the development of lung tumor through downregulating Bcl-2 and p53 expression and up-regulating Bax expression.

Curcumin；Bcl-2；Bax；p53

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0794-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.012

2017-02-07）

重慶市科委基礎(chǔ)與前沿一般項(xiàng)目（cstc2016jcyjA0268）

△通信作者（電子郵箱：1307198425@qq.com）