田小菲 張 曉 張經(jīng)一 王 芳 張亞星 張國徽 龐 灝

(河北北方學院法醫(yī)教研室，河北 張家口 075000)

百草枯誘導的SH-SY5Y細胞中核連蛋白2基因的表達變化

田小菲 張 曉1張經(jīng)一1王 芳1張亞星1張國徽 龐 灝2

(河北北方學院法醫(yī)教研室，河北 張家口 075000)

目的 檢測核連蛋白(NUCB)2在百草枯(PQ)誘導的SH-SY5Y細胞中的表達變化，分析NUCB2在PQ引起的SH-SY5Y細胞凋亡中的作用機制。方法 采用MTT法進行SH-SY5Y細胞毒性分析。選擇PQ作用的最佳濃度和時間點，進一步收取經(jīng)PQ處理后的SH-SY5Y總RNA，首先采用RT-PCR方法觀察NUCB2的表達趨勢，然后采用real-time PCR方法進行NUCB2基因進行表達變化檢測，采用ΔΔCt法進行定量比較分析。結果 MTT方法在酶標儀490 nm波長下，分析得到PQ的最佳作用濃度和時間是0.5 mmol/L作用24 h，此時細胞活力較對照組低約41.67%；采用ΔΔCt法進行定量比較分析，發(fā)現(xiàn)NUCB2在mRNA水平的表達量明顯降低(P=0.001 6)；Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y細胞經(jīng)PQ誘導后引起了caspase-3酶原形式的表達量降低(P<0.05)。結論 NUCB2基因在經(jīng)PQ誘導后的SH-SY5Y細胞中表達量明顯降低，分析其可能在神經(jīng)細胞的凋亡機制中發(fā)揮重要作用。

核連蛋白(NUCB)2；PQ；SH-SY5Y；凋亡

SH-SY5Y細胞系是帕金森病(PD)發(fā)病機制研究中一種常見的體外模型，因其有多巴胺能神經(jīng)元的一些特性〔1〕，此細胞可分泌酪氨酸羥化酶、β-多巴胺羥化酶和多巴胺轉運蛋白。百草枯(PQ)可為活性氧種屬產(chǎn)生的激活因素之一〔2，3〕，位于細胞膜上的這些小葉狀活性氧簇(ROS)不飽和脂類的相互作用，將對細胞器造成一定損壞，進而導致細胞死亡的發(fā)生〔4〕。細胞凋亡涉及眾多凋亡相關基因和多種信號通道，核連蛋白(NUCB)2也稱為非酯化脂肪酸(NEFA)蛋白，此蛋白與1型腫瘤壞死因子(TNF)受體(TNFR)脫落氨肽酶調(diào)控因子(ARTS-1)形成的復合物能對TNFR1的釋放進行調(diào)節(jié)，從而影響TNFα-TNFR1系統(tǒng)介導的細胞凋亡的過程〔5〕，同時凋亡發(fā)生過程中的半胱氨酸蛋白酶(caspase)能對NUCB2進行裂解〔6〕。目前國內(nèi)外還沒有NUCB2所參與的神經(jīng)細胞死亡機制的相關報道，本研究擬采用PQ誘導SH-SY5Y細胞建立PD的發(fā)病機制模型，以探討NUCB2在經(jīng)PQ誘導后的神經(jīng)細胞中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)購于中科院細胞中心(源自美國ATCC)；胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養(yǎng)基，Hyclone公司；噻唑藍(MTT)，凱基公司；PQ，Sigma公司；Ex-Taq試劑盒，RT-PCR試劑盒和SYBR試劑盒，TaKaRa公司；TRIZOL試劑，Millpore公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y用含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)懸浮，以大約5×106個/ml的密度接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿，置于細胞培養(yǎng)箱中，在37℃，5%CO2，濕化條件下培養(yǎng)，待細胞覆蓋率達90%左右時，常規(guī)胰酶消化傳代。

1.3 MTT進行細胞毒性分析 選用不同濃度的PQ(0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 mmol/L)作用濃度作用于SH-SY5Y細胞不同時間(6，18，24，48 h)后，采用MTT方法進行細胞毒性分析，選擇最佳的PQ作用濃度和時間。

1.4 NUCB2 mRNA水平的表達變化檢測 根據(jù)1.3中的結果選擇PQ作用的最佳濃度和時間點，收取SH-SY5Y細胞總RNA，反轉錄成cDNA。設計NUCB2的特異性引物，β-actin上游引物5′-AGATGACCCAGATCATGTTTG-3′,下游引物5′-ATCACGATGCCAGTGGTA-3′;NUCB2上游引物5′-AGGCAGATGAGCTTCAGA-3′,下游引物5′-TCTGCTGTATGACCTGATGA-3′。采用RT-PCR和real-time方法對處理前后的SH-SY5Y細胞中NUCB2在mRNA水平的表達進行檢測。采用ΔΔCt法對實驗組與對照組之間NUCB2基因表達量變化進行定量分析，三組樣品分別進行分析3次。

1.5 caspase-3的檢測 根據(jù)1.3中的結果選擇PQ作用的最佳濃度和時間點，收取SH-SY5Y細胞總蛋白，采用Western印跡方法進行caspase-3激活情況的檢測。用凝膠自動分析成像軟件FluorChem V2.0進行蛋白灰度值(分別以caspase-3的整合密度值比內(nèi)參β-actin的整合密度值)分析，進而做定量比較，三組樣品分別進行分析3次。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用Excel2007進行t檢驗。

2 結 果

2.1 PQ作用最佳濃度及時間選擇 MTT方法在酶標儀490 nm波長下，分析得到的細胞經(jīng)不同濃度處理6、18、24、48 h的生存活力，因6、18 h細胞活性無明顯差異，48 h細胞死亡太多，故僅對24 h進行分析，見圖1，0.5 mmol/L PQ作用24 h后，細胞活力相對于未經(jīng)PQ作用組比較降低了約41.67%，標準偏差為0.033；雖然隨著PQ濃度的增大，細胞生存活力降低越明顯，但是當PQ濃度大于0.5 mmol/L以后，顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞即出現(xiàn)皺縮，呈現(xiàn)出明顯的病理形態(tài)，所以不宜選擇大于0.5 mmol/L的PQ濃度進行后續(xù)分析。

2.2 caspase-3表達檢測 SH-SY5Y細胞經(jīng)PQ誘導后活性明顯降低，進一步收取SH-SY5Y細胞經(jīng)0.5 mmol/L PQ作用24 h后的總蛋白，進行caspase-3酶原形式的表達量變化檢測。SH-SY5Y經(jīng)PQ作用后，導致了caspase-3酶原形式的表達量降低(P<0.05)。見圖2。

2.3 NUCB2 mRNA表達檢測 SH-SY5Y細胞經(jīng)0.5 mmol/L PQ作用24 h后，PQ組NUCB2 mRNA水平的表達量(1.452 715±0.038 37)明顯低于對照組(1.519 701±0.057 78)(P<0.05)。見圖3。

圖1 PQ作用于SH-SY5Y 24 h后MTT分析圖

圖2 caspase-3表達檢測

圖3 NUCB2 mRNA表達水平

3 討 論

有報道SH-SY5Y細胞經(jīng)凋亡誘導劑作用后，將導致此細胞各種凋亡現(xiàn)象的發(fā)生〔7〕，因其有多巴胺能神經(jīng)元的一些特性，因此SH-SY5Y細胞模型已在由PQ引起的PD發(fā)病機制的研究中得到了廣泛認可。流行病學報道顯示，經(jīng)常接觸PQ的人群患PD的概率明顯增高〔8，9〕。有報道在經(jīng)PQ作用后的神經(jīng)細胞，亦有線粒體膜電位發(fā)生改變，進而引起細胞色素C的釋放，caspase凋亡途徑的激活等的相關報道〔10〕。內(nèi)環(huán)境中Ca2+的紊亂，也是細胞凋亡的一個主要誘因。正常情況下，胞外液中Ca2+的濃度為1 mmol/L水平，而胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的濃度為0.1 mmol/L。當經(jīng)1-甲基-4-苯基-吡啶(MPP+)作用后，可引起機體Ca2+內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的紊亂，進而誘發(fā)細胞色素C的釋放，激活caspase-3調(diào)控的凋亡途徑的發(fā)生，進而引起細胞死亡的發(fā)生〔11〕，而PQ的化學結構與其極其相似〔12〕，本研究顯示caspase-3酶原形式的表達量經(jīng)PQ作用之后明顯降低。

NUCB2可參與TNFα-TNFR1系統(tǒng)介導的細胞凋亡的過程〔5〕，參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外 Ca2+的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。NUCB2可調(diào)節(jié)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)〔13〕。胞外TNFR1與NUCB2-Arts1結合形成復合物，進而影響其與TNF-α的結合，從而影響TNFα-TNFR1系統(tǒng)介導的程序性細胞死亡過程的發(fā)生〔14〕。當TNFα與TNFR1結合后，激活細胞凋亡信號，啟動細胞內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸酶的級聯(lián)反應過程，誘導細胞凋亡的發(fā)生〔15〕，又有報道，細胞凋亡發(fā)生過程中的caspase能對NUCB2進行裂解〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)，當PQ作用于SH-SY5Y細胞后，神經(jīng)細胞的存活率明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡過程中涉及的重要蛋白酶caspase-3酶原形式的表達量經(jīng)PQ作用之后亦明顯降低。PQ作用于SH-SY5Y細胞之后引起了細胞凋亡的發(fā)生，進一步發(fā)現(xiàn)經(jīng)PQ處理組NUCB2的表達量明顯低于對照組。

綜上，可得NUCB2的表達變化參與了TNFα-TNFR1系統(tǒng)介導的細胞凋亡的過程，但是又因為細胞凋亡激活信號引起的caspase的激活可能導致了NUCB2的降解。即在整個過程中NUCB2既參與了TNFα-TNFR1系統(tǒng)介導的細胞凋亡途徑的激活，又可能是caspase-3的作用底物。因此，NUCB2在PQ引起的神經(jīng)細胞凋亡過程中的具體機制還需進一步研究探討。

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〔2016-02-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省教育廳青年指導項目(Z2017027)

龐 灝(1962-)，男，教授，博士生導師，主要從事法醫(yī)物證學研究。

田小菲(1983-)，女，講師，主要從事法醫(yī)學研究。

R285

A

1005-9202(2017)13-3158-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.016

1 河北北方學院2012級法醫(yī)學本科1班

2 中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)血清教研室