吳瑞方，胡成遠(yuǎn)，孫付保，彭明，孫海彥，*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101；2.湖北海宜生物科技有限公司，湖北襄陽441409；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

酵母浸出物對(duì)屎腸球菌活菌數(shù)的影響

吳瑞方1，胡成遠(yuǎn)2，孫付保3，彭明1，孫海彥1，*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101；2.湖北海宜生物科技有限公司，湖北襄陽441409；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）發(fā)酵飼料中的活菌數(shù)是保證其功能特性的關(guān)鍵因素，為了提高屎腸球菌發(fā)酵過程中的活菌總數(shù)，本研究以屎腸球菌為試驗(yàn)菌株，選用4種不同特性的酵母浸出物來考察其對(duì)屎腸球菌活菌數(shù)的影響。通過單因素試驗(yàn)，確定以酵母浸出物為唯一氮源培養(yǎng)屎腸球菌的活菌數(shù)，根據(jù)酵母浸出物檢測(cè)指標(biāo)找出影響屎腸球菌活菌的關(guān)鍵因子。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中主要提供生長因子和微量元素的酵母浸出物對(duì)屎腸球菌的活性有明顯的影響，其中游離核苷酸的含量是影響屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)重要因子，通過外源添加一定量的游離核苷酸，厭氧培養(yǎng)12 h，獲得的最終活菌數(shù)為176×108CFU/mL，與未添加游離核苷酸相比，活菌數(shù)提高了將近40%。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加一定量的游離核苷酸可提高屎腸球菌在發(fā)酵液中活菌數(shù)量，為工業(yè)化生產(chǎn)高活菌數(shù)的飼用屎腸球菌提供參考和借鑒。

屎腸球菌；活菌數(shù)；酵母浸出物；游離核苷酸；氨基態(tài)氮

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于革蘭氏陽性球菌，是乳酸菌類益生菌的一種，為腸球菌屬，菌落形態(tài)程圓形或橢圓形，具有調(diào)節(jié)單胃動(dòng)物腸道微生物菌群，抑制腸道致病菌的功效[1]。屎腸球菌抗逆性較強(qiáng)，對(duì)部分抗生素也具有較好的耐藥性，被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物微生態(tài)制劑和食品添加劑等領(lǐng)域，與其他益生菌配伍，可用于調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群，提高動(dòng)物免疫力、改善生長性能[2-3]。

研究表明[4-5]，屎腸球菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的存活和增殖對(duì)其功效的發(fā)揮起到?jīng)Q定性作用，要獲得理想的飼養(yǎng)效果，其活菌量必需達(dá)到足夠多的數(shù)量。然而，益生菌最大的缺點(diǎn)是活菌期時(shí)間短[6]。在屎腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中保證其存活是當(dāng)前急需解決的關(guān)鍵技術(shù)之一[7-8]，因而，屎腸球菌作為飼用益生菌類微生態(tài)制劑進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)時(shí)，需要采用有利于菌體活性穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝，使活菌量在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后盡可能維持較高的水平。

近年來，屎腸球菌的研究主要集中在飼用效果、作用機(jī)理、菌株篩選及發(fā)酵工藝等方面[9-11]，通過優(yōu)化培養(yǎng)基生長因子來提高其活菌數(shù)的研究較少[12]。在益生菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母浸出物是非常重要的氮源之一，其主要為益生菌的生長提供生長因子和微量元素，而這類營養(yǎng)物是影響益生菌生長和活性的關(guān)鍵生長因素[13]。因此，本試驗(yàn)通過以不同酵母浸粉為唯一氮源發(fā)酵培養(yǎng)屎腸球菌，對(duì)比分析不同培養(yǎng)條件下的活菌數(shù)，并找出其中的關(guān)鍵影響因子，為工業(yè)化生產(chǎn)高活菌數(shù)屎腸球菌的進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

屎腸球菌（Enterococcus faecium）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所微生物資源利用研究組保存。

NaCl、MgSO4·7H2O、CaCO3為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；MRS（de Man，Rogosa and Sharpe）合成培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蔗糖、酵母浸粉、瓊脂粉、游離核苷酸（含 AMP、CMP、GMP、UMP、IMP）均為國產(chǎn)生化試劑；酵母浸粉FM803：安琪酵母股份有限公司；高核苷酸酵母浸粉FG0342、普通酵母浸粉FY0127：湖北海宜生物科技有限公司；酵母浸粉Kerry 412：Kerry公司，其理化指標(biāo)見表1。

表1 不同酵母浸粉的理化指標(biāo)Table 1 The physical and chemical indexes of yeast extract powder

斜面、平皿和計(jì)數(shù)平皿培養(yǎng)基均為MRS固體培養(yǎng)基；搖瓶種子培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 20.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，CaCO32.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸餾水1 L。

1.2 儀器設(shè)備

pH計(jì)（梅特勒FE20K Five Easy Plus pH計(jì)）：梅特勒-托利多；SPX-350智能生化培養(yǎng)箱：寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；721型可見分光光度計(jì)：天津市普瑞斯儀器有限公司；高壓滅菌鍋：日本Hirayama HVE；SWCJ-1FD單人單面垂直凈化工作臺(tái)：上海博迅。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴(kuò)培

取-80℃保存的屎腸球菌凍存管1支，在MRS平板上劃線，37℃培養(yǎng)20 h～24 h，挑取單菌落活化至新鮮斜面上，37℃培養(yǎng)18 h～20 h，用接種環(huán)從活化斜面上刮取一環(huán)菌體接種于100 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置過夜培養(yǎng)。

1.3.2 屎腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

以酵母浸粉為試驗(yàn)因子，改變搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中的唯一氮源成分，配制含不同型號(hào)酵母浸粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌15min。發(fā)酵溫度為37℃，接種量為1%的條件下靜置培養(yǎng)12 h，得到屎腸球菌發(fā)酵液。

1.4 主要指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 酸度的測(cè)定

pH值測(cè)定用梅特勒FE20K Five Easy Plus pH計(jì)直接測(cè)定。

1.4.2 OD值的測(cè)定

屎腸球菌在特定波長條件下吸光值與活菌量之間呈現(xiàn)相關(guān)性，因此可用測(cè)定的發(fā)酵液的OD600值來反應(yīng)屎腸球菌在搖瓶中的生長情況[14]。為了消除發(fā)酵液中CaCO3對(duì)吸光值的干擾，選取1%的HCl溶液作為發(fā)酵液的稀釋液，使待測(cè)溶液變澄清，測(cè)定吸光度。

1.4.3 活菌數(shù)測(cè)定

活菌總數(shù)：參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]，梯度稀釋涂布平板后，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)菌落數(shù)，以菌落平均數(shù)計(jì)為該樣品的單位活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌在以不同酵母浸粉為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長過程OD和pH值的變化情況

屎腸球菌在以不同酵母浸粉為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長過程OD和pH值的變化情況見圖1。

圖1 屎腸球菌在不同氮源條件下培養(yǎng)過程中的OD值和pH值變化Fig.1 The time courses of OD value and pH value by E.faecium with the different nitrogen sources in the initial fermentation media.

從圖1（a）可看出，屎腸球菌從一開始菌數(shù)急增，經(jīng)過短暫的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，其在8 h后生長速度開始減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期，然而其OD值并未表現(xiàn)出下降，這表明一部分菌已經(jīng)開始被自身所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制或者殺死。經(jīng)培養(yǎng)12 h后，各個(gè)搖瓶中的OD600吸光值表現(xiàn)出了差距，其中以高核苷酸酵母浸出物FG0342與Kreey 412為氮源的屎腸球菌表現(xiàn)的最為突出，OD值分別為3.62和3.51。

pH值反映游離氫離子的濃度，其中乳酸是屎腸球菌的主要代謝產(chǎn)物，也是酸度升高的重要因素。由圖1（b）可知，4組不同培養(yǎng)條件下的屎腸球菌在pH值變化程度上基本保持一致，最終達(dá)到的pH值也相當(dāng)，無明顯差別。但是Kerry 412在2 h～8 h之間產(chǎn)酸表現(xiàn)得最為突出，這說明在該氮源條件下不僅有利于屎腸球菌的產(chǎn)酸也是其細(xì)胞代謝最旺盛的時(shí)間段，這可能與其營養(yǎng)物質(zhì)的組成有關(guān)，而以高核苷酸型FG0342為唯一氮源的屎腸球菌的產(chǎn)酸則表現(xiàn)得相對(duì)緩和，盡管其生物量最終超過了以Kerry 412為氮源的屎腸球菌，這從側(cè)面說明酵母浸出物不僅對(duì)菌體自身生長產(chǎn)生影響，也會(huì)通過控制菌體的生長速率來改變其胞內(nèi)代謝途徑。

2.2 不同酵母浸出物對(duì)屎腸球菌活菌數(shù)的影響

通過使用4種不同特征的酵母浸粉來培養(yǎng)屎腸球菌，按照發(fā)酵培養(yǎng)條件，平板計(jì)數(shù)，具體結(jié)果見表2。

表2 不同氮源對(duì)屎腸球菌活菌數(shù)的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on viable count of E.faecium

從表2可知，Kerry 412、FG0342兩種氮源的屎腸球菌活菌總數(shù)均比較高，隨著時(shí)間的推移，4種氮源培養(yǎng)的屎腸球菌活菌總數(shù)都在增加，其中4 h至8 h之間增長得最為顯著，這與發(fā)酵液OD值變化趨勢(shì)表現(xiàn)是一致的，從而說明OD值的變化能在一定程度上反應(yīng)出發(fā)酵液中的活菌總數(shù)的變化，但是在12 h時(shí)，從OD值過程曲線來看（圖1），Kerry 412、FG0342兩種氮源的屎腸球菌OD值是相近的，而實(shí)際的活菌數(shù)則分別是 164×108CFU/mL 和 192×108CFU/mL，這一結(jié)果可能是由于以Kerry 412為氮源的屎腸球菌在培養(yǎng)過程中有一部分細(xì)胞死亡而干擾了OD值的讀數(shù)。

2.3 游離核苷酸添加對(duì)屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響

在FY0127和FM803兩種酵母浸粉中按照一定的比例加入游離核苷酸混合樣，充分混勻后，按照既定的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行屎腸球菌搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵周期為12 h，梯度稀釋平板計(jì)數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 游離核苷酸對(duì)屎腸球菌活菌數(shù)的影響Table 3 Effect of free nucleotides on viable count of E.faecium

試驗(yàn)結(jié)果表明：添加一定比例的游離核苷酸，活菌數(shù)量都有所提高，幾乎達(dá)到了以Kerry 412為氮源時(shí)的相當(dāng)水平（見表2）。核苷酸的添加有利于屎腸球菌在培養(yǎng)過程中保持較高的細(xì)胞活性，加速細(xì)胞的分裂。在一定范圍內(nèi)，活菌數(shù)量隨著培養(yǎng)基中核苷酸量的增加而呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，之后，核苷酸含量的增加細(xì)胞活菌數(shù)不再增加，這表明過量的游離核苷酸不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分裂和活性維持。

3 討論

在培養(yǎng)基成分中，氮源是影響乳酸菌生長活性的主要因素，酵母浸出物能為細(xì)胞生命活動(dòng)提供大量氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和微量元素，能促進(jìn)微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有利于維持微生物的生長活力，縮短細(xì)胞分裂時(shí)間，是培養(yǎng)基中不可或缺的生長因子提供物[13]。屎腸球菌作為農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的有益微生物菌種之一，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中，為減少和避免使用抗生素做出了很大的努力和貢獻(xiàn)，但是現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的屎腸球菌其質(zhì)量要求表現(xiàn)為有效活菌數(shù)不足，直接影響其使用效果和推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)通過選取4種不同型號(hào)、不同特性的酵母粉，為屎腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一氮源，以期通過提高屎腸球菌擴(kuò)培過程中單位體積活菌數(shù)，為下游微生態(tài)制劑提供較好的質(zhì)量保障，也為進(jìn)一步開發(fā)益生菌微生態(tài)制劑提供可借鑒的理論依據(jù)。

結(jié)合酵母浸粉理化指標(biāo)（表1）和試驗(yàn)結(jié)果可得知，游離核苷酸對(duì)屎腸球菌在發(fā)酵過程維持較高的活力具有明顯的促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)槭耗c球菌自身缺乏對(duì)許多有機(jī)化合物的合成能力，其生長代謝偏向于核苷酸補(bǔ)救途徑，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中從外界攝取游離核苷酸用于合成自身生長分裂所需的核酸類物質(zhì)，這一現(xiàn)象通過隨后的額外添加游離核苷酸試驗(yàn)（表3）得以驗(yàn)證，在添加一定量的游離核苷酸后，以FM803為氮源的屎腸球菌活菌數(shù)從原先的107×108CFU/mL上升到最高176×108CFU/mL，且以FY0127為氮源的屎腸球菌活菌數(shù)從75×108CFU/mL迅速上升到最高126×108CFU/mL。培養(yǎng)基中游離核苷酸的存在，可通過細(xì)胞吸收后直接用于DNA合成，無需再從頭合成細(xì)胞分裂增殖所需的物質(zhì)，有利于促進(jìn)細(xì)胞分裂，同時(shí)還能通過回補(bǔ)途徑代謝成其它所需營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的生命活動(dòng)，使其不至于過早衰亡，但是過量的游離核苷酸卻無助于提高屎腸球菌的活細(xì)胞數(shù)量，另而會(huì)增加培養(yǎng)基成本，間接提高生產(chǎn)成本，因此，當(dāng)培養(yǎng)基中游離核苷酸量滿足細(xì)胞生長需求，則無需額外添加混合游離核苷酸，通過試驗(yàn)可以看出，初始培養(yǎng)基中游離核苷酸含量為0.01%～0.02%較宜。

此外，結(jié)合表1，從圖1可以看出，氨基態(tài)氮對(duì)細(xì)胞生長也有較大的影響，酵母浸出物中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽，其中游離氨基酸、小肽（分子量約在180～1 000之間）對(duì)乳酸菌的生長和維持較高生產(chǎn)速率有一定的幫助，能夠提高乳酸菌的最大比生長速率[13]。但是過高的氨基肽氮卻不利于維持細(xì)胞活性，4種酵母浸粉中FM803氨基氮高達(dá)6.27%，在發(fā)酵初期其生長速率明顯快于其它3組試驗(yàn)，但在第6 h時(shí)開始放緩，顯得后勁不足，這可能是前期過快地生長消耗掉培養(yǎng)基中大量的營養(yǎng)物，細(xì)胞死亡自溶有關(guān)，使得其提前進(jìn)入穩(wěn)定期，最終的活菌數(shù)為107×108CFU/mL（表2）也說明了這一事實(shí)。然而，培養(yǎng)基中氨基氮過低卻也不利于屎腸球菌的生長，其中以FY0127為氮源的屎腸球菌生長速率在整個(gè)過程中保持較低，這與乳酸菌自身酶系不發(fā)達(dá)，尤其是蛋白酶活性較弱甚至缺乏必要的蛋白酶有關(guān)[16]，對(duì)分子量較大的多肽利用效率不如小分子小肽和游離氨基酸，盡管在外源游離核苷酸添加后其活菌數(shù)得到了一定的改善，但是其最高也只達(dá)到了126×108CFU/mL，具體結(jié)果見表3，與對(duì)照組相比，活菌數(shù)一直處于較低數(shù)量。因此在培養(yǎng)屎腸球菌過程中如何控制屎腸球菌保持一定的生長速率，使其不至于過早衰亡也是是我們?cè)谄綍r(shí)生產(chǎn)過程中應(yīng)該考慮的問題之一。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選定4種不同理化指標(biāo)的酵母浸出物來發(fā)酵生產(chǎn)高密度活菌的屎腸球菌，通過分析酵母浸粉產(chǎn)品指標(biāo)，結(jié)合試驗(yàn)現(xiàn)象得到以下結(jié)論：

1）培養(yǎng)基中的游離核苷酸有利于提高和維持屎腸球菌細(xì)胞活性，但是過量的游離核苷酸對(duì)進(jìn)一步提高活菌數(shù)沒有明顯的幫助，出于生產(chǎn)成本考慮，初始培養(yǎng)基中游離核苷酸含量為0.01%～0.02%較宜。

2）在培養(yǎng)屎腸球菌過程中，氨基態(tài)氮對(duì)屎腸球菌的生物量具有決定性作用，作為培養(yǎng)基中的速效氮源，能快速被細(xì)胞吸收直接用于自身生命活動(dòng)，但是初始培養(yǎng)基中過高的氨基態(tài)氮會(huì)使細(xì)胞不加控制地快速生長，消耗培養(yǎng)基中大量營養(yǎng)物，提早衰亡，不利于細(xì)胞活性的維持。

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Influence of Yeast Extract on Viable Count of Enterococcus faecium

WU Rui-fang1，HU Cheng-yuan2，SUN Fu-bao3，PENG Ming1，SUN Hai-yan1，*
（1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，Hainan，China；2.Hubei HIYEE Biotechnology Co.，Ltd.，Xiangyang 441409，Hubei，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The viable count of Enterococcus faecium was the key factor to functionality of fermented feed.To get the highest viable count of E.faecium during the fermentation period，the effects of the four different characteristics of yeast extracts on that was discussed.With the method of single factor experiment，the viable count of E.faecium was determined by shake-flask cultures using yeast extract as a sole nitrogen source.Then based on the detecting results of yeast extract，the crucial factors of effect on the viable count could be finding out.Experiments have indicated that yeast extract which provides growth factors and microelement has significant impact on the cellular activity of E.faecium，and the initial concentration of free nucleotides in the media was the important factor that affects the vitality of E.faecium.By adding a certain amount of free nucleotides，and incubating under anaerobic conditions for 12 hours，the maximum number of viable count wasattained 176×108CFU/mL，which was nearly 40%higher than the maximum number of viable count before the optimization process.The conclusion was that the viable count of E.faecium could be improved by added a certain amount of free nucleotides in the initial media，and it was applied to the industrialized production of probiotic strains used in fermented feed production.

Enterococcusfaecium；viable count；yeast extract；free nucleotides；amino nitrogen

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.037

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基金（1630052016007、1630052016012、1630052016021）

吳瑞方（1986—），男（漢），研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向：發(fā)酵工程。

*通信作者：孫海彥，副研究員。