張 蓓， 王 林， 柏玉蘭， 石少亭， 張 雷， 李亞軍

氨甲?；偌t細胞生成素經(jīng)PI3-K/Akt信號通路抗腦缺血損傷

張 蓓， 王 林， 柏玉蘭， 石少亭， 張 雷， 李亞軍

目的 觀察腦缺血后氨甲?；偌t細胞生成素(CEPO)的神經(jīng)保護作用并探討其可能機制。方法 健康雄性SD大鼠隨機分為6組(n=10)：(1)假手術(shù)組；(2)缺血組；(3)EPO組；(4)CEPO組；(5)LY(LY294002)組；(6)CEPO+LY組。應(yīng)用大腦中動脈線栓法(MCAO)制作大鼠局灶性腦缺血模型，評定大鼠神經(jīng)功能并計算腦梗死體積，Western blot 方法檢測PI3-K/Akt活性變化。結(jié)果 EPO組與CEPO組腦梗死體積均明顯縮小，神經(jīng)功能顯著改善，磷酸化Akt(pAkt)水平明顯增高，且兩組之間無明顯差異，但CEPO的神經(jīng)保護作用及對Akt磷酸化的誘導(dǎo)效應(yīng)均可被PI3-K抑制劑 LY294002部分抵消。結(jié)論 CEPO具有與EPO相當(dāng)?shù)娜毖竽X保護作用，其機制可能與PI3-K/Akt信號通路激活有關(guān)。

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶； 促紅細胞生成素； 氨甲?；偌t細胞生成素； 腦缺血

氨甲?；偌t細胞生成素(carbamylated erythropoietin,CEPO)是促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)的一種衍生物。與EPO相比，CEPO沒有促紅細胞生成的作用，但仍具有對腦、脊髓、心臟等的組織保護功能，且CEPO不能與經(jīng)典型EPO受體(EPOR)2結(jié)合[1]，因此CEPO誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用的分子機制可能與EPO存在差異，目前尚不明晰。本實驗擬觀察EPO及CEPO干預(yù)后局灶性腦缺血大鼠中PI3-K/Akt活性變化，初步探討介導(dǎo)CEPO腦保護作用的可能的信號通路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年SD大鼠60只(雄性，260～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，隨機均分為6組(n=10)：(1)假手術(shù)組(僅分離暴露頸部動脈不阻斷血流)；(2)缺血組；(3)EPO組(于術(shù)后30 min經(jīng)尾靜脈注射重組人促紅細胞生成素(rhEPO) 5000 IU/kg)；(4)CEPO組(于術(shù)后30 min經(jīng)尾靜脈注射CEPO 50 μg/kg)[2]；(5)LY組(PI3-K/Akt抑制劑LY 294002 0.3 mg/kg于栓塞前15 min經(jīng)尾靜脈給藥)；(6)CEPO+LY組(于相應(yīng)時間點分別給予LY294002和CEPO)。

1.2 主要試劑 rhEPO(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)，CEPO(lundbeck公司)，LY294002(Selleck公司)，pAkt抗體、Akt抗體(Cell Signaling公司)，β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)，HRP標記山羊抗兔IgG、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度定量試劑盒(上海浩然生物技術(shù)有限公司)，ECL顯色試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.3 動物模型制備 參照Zea-Longa法[3]改良后制作右側(cè)大腦中動脈閉塞模型：大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.3 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定，備皮，消毒，沿頸前正中線切開皮膚，逐層分離，暴露右側(cè)頸動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，于頸總動脈近分叉處切口，將自制線栓(4-0單絲尼龍手術(shù)縫合線，頭端加熱成直徑0.3 mm光滑球形，酒精消毒、 肝素浸泡后備用)自切口插入頸內(nèi)動脈18～20 mm至大腦中動脈起始處，結(jié)扎固定線栓。

1.4 神經(jīng)功能評定 所有動物均于術(shù)前及術(shù)后24 h參照Zea-longa[3]標準進行神經(jīng)功能評定。0分：無神經(jīng)功能缺損； 1分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，有意識障礙。1～4分視為造模成功，術(shù)前大于0分、術(shù)后評0分及術(shù)后24 h內(nèi)死亡者剔除，并隨機補足。

1.5 腦梗死體積測定 每組各取5只大鼠于術(shù)后24 h斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，以前囟(Bregma)為標志點，從Bregma+4.0 mm～Bregma-8.0 mm，以2 mm間隔行連續(xù)冠狀切片共6片，放入1%紅四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，37 ℃孵育30 min。正常腦組織著深紅色，梗死灶呈蒼白色，4%多聚甲醛固定，拍照，利用Photoshop等軟件計算腦梗死體積。

1.6 Western blot方法檢測Akt表達及PI3-K/Akt活性變化 每組動物各取5只，術(shù)后24 h斷頭取腦，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。按常?guī)方法提取腦組織總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，經(jīng)變性取20%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF，4 ℃封閉過夜，加入一抗(Akt：1∶400，pAkt：1∶400)，相應(yīng)抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物標記的二抗(1∶2000)，化學(xué)發(fā)光法進行顯色反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 死亡率 假手術(shù)組大鼠無死亡，缺血組、LY組各死亡兩只，CEPO組1只(術(shù)中刺激頸動脈竇引起迷走減壓反射而迅速死亡)，CEPO+LY組1只。以上大鼠均死于術(shù)后24 h內(nèi)，不列入統(tǒng)計，另隨機選取大鼠補齊。各組大鼠死亡率比較無明顯差異(P>0.05)。

2.2 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組全部動物未檢測到神經(jīng)功能缺損(0分)，其余各組大鼠術(shù)后24 h均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。 EPO及CEPO干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能明顯改善，且兩組的神經(jīng)功能評分無明顯差異(P>0.05)；LY組神經(jīng)功能損傷較缺血組加重；CEPO+LY組與缺血組沒有明顯差異(P>0.05)(見表1)。

2.3 腦梗死體積測定 假手術(shù)組未見TTC不著色區(qū)， EPO或CEPO干預(yù)可顯著減小梗死體積，且兩組之間無明顯差異，腦保護作用相當(dāng)(P>0.05)；而LY組(P<0.01)、 CEPO+LY組(P<0.05)腦梗死體積均較缺血組增大，這表明特異性PI3-K/Akt抑制劑LY294002可以抑制CEPO減小腦梗死體積的作用，PI3-K/Akt信號途徑可能介導(dǎo)了CEPO的腦保護作用(見表1)。

2.4 Akt蛋白表達及PI3-K/Akt活性變化 Akt的持續(xù)活化是其發(fā)揮促細胞生存、抑制細胞凋亡等功能的重要前提，而其相關(guān)位點的磷酸化是Akt激活的必要條件。各組大鼠Akt表達無明顯差異(P>0.05)；缺血組磷酸化Akt(pAkt)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；與缺血組比較，EPO組和CEPO組pAkt水平均明顯增高(P<0.01)，且兩組之間無顯著差異(P>0.05)，LY組pAkt明顯降低(P<0.01)，CEPO+LY組無明顯差異(P>0.05)；相較于CEPO組，Akt被CEPO誘導(dǎo)增強的磷酸化作用被LY294002部分阻斷(P<0.01)(見圖1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及 腦梗死體積測定

與缺血組比較*P<0.05，**P<0.01；與CEPO組比較#P<0.05，##P<0.01；與LY組比較△P<0.05，△△P<0.01

與假手術(shù)組比較▲P<0.05；與缺血組比較**P<0.01；與CEPO組比較#P<0.01；與LY組比較△P<0.01

圖1 各組大鼠Akt和pAkt的表達

3 討 論

EPO是一種主要由胎兒的肝臟和成年人的腎臟合成和分泌的酸性糖蛋白，除了能夠刺激骨髓中紅系祖細胞的增殖與分化具有造血活性外，還在多種細胞因子聯(lián)合作用下，通過促進血管生長、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡、抗興奮性氨基酸毒性、調(diào)節(jié)NO的合成、提高神經(jīng)突觸傳遞、抗氧化損傷、調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖與分化等途徑在缺血/缺氧性腦損傷時發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)活性及重要的保護作用[4～12]。然而EPO本身的促紅細胞生成、促血栓形成等副作用極大地限制了其臨床應(yīng)用推廣[13]。CEPO是EPO的氨甲?；苌?，CEPO不具促紅細胞特性，但它仍具有細胞保護作用，而且其藥代動力學(xué)特征與EPO保持相似[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，EPO及CEPO干預(yù)組動物腦缺血后神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定均較缺血組有顯著改善，進一步證實了二者對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用，且EPO與CEPO組間并無差別，提示缺血性腦損傷后CEPO發(fā)揮保護作用的效能與EPO基本相同。

EPO可通過激活JAK2(Janus-tyrosine kinase-2)，進而調(diào)控其下游的信號傳導(dǎo)途徑，包括Ras-分裂素活性蛋白激酶 (Ras-mitogerr-activated-protein-kinase,Ras-MAPK)，磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoatidyli-nositol-3-kinase，PI3-K)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-5(signal transducers and activators of transcription-5，STAT5)發(fā)揮神經(jīng)保護作用?，F(xiàn)已證實，CEPO通過結(jié)合非經(jīng)典型EPO受體EPOR (erythropoietin receptor)-βcR起作用，不能與經(jīng)典型EPO受體(EPOR)2結(jié)合，因此CEPO誘導(dǎo)的組織保護作用的分子機制可能與EPO存在差異。已有學(xué)者報道CEPO不能有效地觸發(fā)JAK2/STAT5的磷酸化[15]。Akt，即絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonne kinase,Akt)，是PI3-K直接的下游作用靶點，其磷酸化即pAkt水平是PI3-K/Akt途徑活化的標志。CEPO是否能有效地激活PI3-K/Akt信號通路從而發(fā)揮腦保護作用尚不清楚。PI3-K/Akt信號通路是一條重要的抗凋亡/促增殖信號途徑。多種神經(jīng)營養(yǎng)因子通過激活PI3-K/Akt信號通路抑制細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用[16,17]。LY294002是靶向PI3-K的催化亞基p110的高度選擇性、競爭性抑制劑，可以使PI3-K/Akt通路處于失活狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)性腦缺血24 h，EPO和CEPO均可有效促進Akt的磷酸化，pAkt蛋白表達上調(diào)；而LY294002不僅加重了神經(jīng)功能缺損、增大了梗死體積、抑制了缺血組pAkt的表達，同時阻斷了CEPO對Akt磷酸化的誘導(dǎo)效應(yīng)，使得CEPO對PI3-K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活力明顯下降，提示LY294002亦能削弱CEPO通過PI3-K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)的缺血后腦保護效應(yīng)，因此PI3-K/Akt通路的激活可能是CEPO發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一。開發(fā)無造血功能但具有確切的組織保護功效的EPO衍生物，為探索腦缺血后神經(jīng)保護藥物的研究提供了新的思路和方法，而新型EPO衍生物腦保護作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的闡明將為其深入研究和臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。

[1]Dumont F,Bischoff P.Non-Erythropoietic tissue-protective peptides derived from erythropoietin:W02009094172[J].Expert Opin Ther Pat,2010,20(5):715-723.

[2]Millet A,Bouzat P,Trouve-Buisson T,et al.Erythropoietin and its derivates modulate mitochondrial dysfunction after diffuse traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2016,33(17):1625-1633.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Li X,Bai ZY,Zhang FY,et al.Neuroprotection of herbs promoting EPO on cerebral ischemia[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2015,40(12):2265-2271.

[5]Nguyen AQ,Cherry BH,Scott GF,et al.Erythropoietin:powerful protection of ischemic and post-ischemic brain[J].Exp Biol Med (Maywood),2014,239(11):1461-1475.

[6]Xiong Y,Mahmood A,Meng Y,et al.Delayed administration of erythropoietin reducing hippocampal cellloss,enhancing angiogenesis and neurogenesis,and improving functionaloutcome following traumatic brain injury in rats:comparison of treatment with single and triple dose[J].J Neurosurg,2010,113:598-608.

[7]Li Y,Ogle ME,Wallace GC,et al.Erythropoietin attenuates intracerebral hemorrhage by diminishing matrix metalloproteinases and maintaining blood-brain barrier integrity in mice[J].Acta Neurochir Suppl,2008,105:105-112.

[8]Baines CP.The cardiac mitochondrion:nexus of stress[J].Annu Rev Physiol,2010,72:61-80.

[9]Sifringer M,Brait D,Weichelt U,et al.Erythropoietin attenuates hyperoxia-induced oxidative stress in the developing rat brain[J].Brain Behav Immun,2010,24:792-799.

[10]Zhang GL,Wang W,Kang YX,et al.Chronic testosterone propionate supplement activated the Nrf2-ARE pathway in the brain and ameliorated the behaviors of age rats[J].Behav Brain Res,2013,252:388-395.

[11]Kamal A,Al Shaibani T,Ramakers G.Erythropoietin decreases the excitatory neurotransmitter release probability and enhances synaptic plasticity in mice hippocampal slices[J].Brain Res,2011,1410:33-37.

[12]Jin R,Song Z,Yu S,et al.Phosphatidylinositol-3-kinase gamma plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke[J].Stroke,2011,42:2033-2044.

[13]Souvenir R,Doycheva D,Zhang JH,et al.Erythropoietin in stroke therapy: friend or foe[J].Curr Med Chem,2015,22(10):1205-1213.

[14]Liu W,Shen Y,Plane JM,et al.Neuroprotective potential of erythropoietin and its derivative carbamylated erythropoietin in periventricular leukomalacia[J].Exp Neurol,2011,230(2):227- 239.

[15]Ehrenreich H.A boost for translational neuroscience[J].Science,2004,305:184-185.

[16]Nayak GH,Prentice HM,Milton SL.Neuroprotective signaling pathways are modulated by adenosine in the anoxia tolerant turtle[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011,31(2):467-475.

[17]王長明,蔣國紅,徐 平,等.MicRNA-124可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)缺血腦組織細胞凋亡[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2016,33(2):146-149.

Carbamylated erythropoietin via PI3-K/Akt signaling pathway reduces cerebral ischemic injury

ZHANGBei,WANGLin,BAIYulan,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China)

Objective To study the neuroprotective effect of carbamylated erythropoietin (CEPO) on cerebral ischemic injury and its possible mechanism.Methods Sixty healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups (n=10 each):sham operation group,ischemia group,EPO group,CEPO group,LY group and CEPO+LY group.Focal cerebral ischemia model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established in rats using the suture method.Neurological function and the volume of cerebral infarction were evaluated on the expected time points.The changes in activity of PI3-K/Akt pathway were determined by Western blot.Results In both EPO group and CEPO group,the protein levels of phosphorylated Akt (pAkt) were increased markedly with less volume of cerebral infarction and better neurological function,and there was no significant difference between the two groups.However,the neuroprotection of CEPO and its induction of Akt phosphorylation were partially abolished by LY294002,which was the inhibitor of PI3-K.Conclusion The neuroprotective effect of CEPO is equivalent to EPO after cerebral ischemia,which may be related to the activation of PI3-K/Akt signaling pathway.

PI3-K/Akt; Erythropoietin; Carbamylated erythropoietin; Cerebral ischemia

1003-2754(2017)06-0488-03

2016-12-23；

2017-03-29

陜西省自然科學(xué)基金資助項目(No.2010JM4054)；陜西省教育廳科研基金資助項目(No.14JK1629)；陜西省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(No.2010H27)；陜西省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項目資助

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710077)

李亞軍，E-mail：liyajun9@hotmail.com

R743.3

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