劉懷翔， 陳金來(lái)， 路 蔚

胱硫醚β合酶基因突變?cè)谀X梗死患者輕度血管性認(rèn)知功能障礙中的相關(guān)性研究

劉懷翔1， 陳金來(lái)2， 路 蔚1

目的 研究同型半胱氨酸(homocystine,Hcy)代謝基因胱硫醚β合酶(cystathionine βsynthase,CBS )基因T833C突變?cè)诩毙阅X梗死后輕度血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitve impairment,VCI)中的價(jià)值研究。方法 采用擴(kuò)增阻滯突變體系法檢測(cè)CBS T833C基因型，對(duì)急性腦梗死分別行入院時(shí)、14 d、30 d和90 d時(shí)蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)和簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)評(píng)分。結(jié)果 Logistic回歸分析顯示Hcy可能是輕度VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR為1.274；95%CI1.027～1.264，P=0.018)；空腹高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)組 14 d、30 d和90 dMMSE和MoCA評(píng)分分別低于Hcy水平正常組(P<0.01或0.05)；各基因型入院時(shí)MMSE和MoCA評(píng)分無(wú)差別(P>0.05)，而入院14 d時(shí)，C/C型MMSE和MoCA評(píng)分低于T/T型(P<0.05)，隨訪30 d和90 d時(shí)， C/C型MMSE和MoCA評(píng)分趨勢(shì)是低于C/T和T/T型(P<0.01或0.05)，C/T型低于T/T型(P<0.01或0.05)。結(jié)論 CBS T833C基因突變可能是引起Hhcy，間接促進(jìn)了腦梗死患者VCI事件的出現(xiàn)，可能是VCI的遺傳易感因素。

腦梗死； 胱硫醚β合酶； 同型半胱氨酸； 認(rèn)知功能障礙

研究結(jié)果顯示，急性腦梗死后輕度VCI的危險(xiǎn)因素與傳統(tǒng)的卒中危險(xiǎn)因素相同，目前對(duì)VCI尚無(wú)特殊處理手段，控制卒中的危險(xiǎn)因素對(duì)預(yù)防VCI可能有效，尤其是老年患者，血管性疾病是認(rèn)知功能減退的重要原因[1,2]。目前已證實(shí)Hhcy是缺血性血管病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，而且亦是VCI的危險(xiǎn)因素之一[3,4]，而Hcy代謝的關(guān)鍵酶CBS基因突變，可造成Hcy水平異常升高。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年6月-2016年5月住院的動(dòng)脈硬化性急性腦梗死患者180例(急性發(fā)病3 d內(nèi))，均經(jīng)頭部MRI和MRA、CTA或DSA顯示出急性病灶或閉塞血管。年齡60～80歲，平均(65.54±7.18)歲，男性123例，女性57例，分別予以入院時(shí)、14 d、30 d(±3 d)和90 d(±3 d)行MoCA和MMSE評(píng)分，且所有入選病例MMSE和MoCA均為正?；蜉p度VCI患者。除外甲狀腺疾病、房顫、嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能障礙、血液系統(tǒng)疾病和服用卡馬西平、葉酸及B族維生素制劑病史患者，其它疾病造成的認(rèn)知功能損害(如阿爾茨海默病、額顳葉癡呆、路易體癡呆、帕金森病、亨廷頓病、焦慮抑郁癥)。發(fā)現(xiàn)高Hcy血癥患者后，均給予葉酸5 mg/d，甲鈷胺1500 μg/d，同時(shí)輕度VCI患者均給予多奈哌齊5 mg/d。所有入選患者均于急性發(fā)病3 d內(nèi)，分別予入院時(shí)、14 d、30 d和90 d(門診復(fù)查或家訪時(shí))時(shí)行MoCA和MMSE評(píng)分。

1.2 方法

1.2.1 Hcy水平及生化指標(biāo) Hcy水平及生化指標(biāo)測(cè)定由BS-2000M全自動(dòng)生化分析儀完成，Hcy水平參考值范圍5.46～16.2 μmoml/L。

1.2.2 MMSE 測(cè)試 根據(jù)文化程度，MMSE 分值：文盲≤19分，小學(xué)≤22分，初中及以上≤26分為認(rèn)知障礙；文盲17～9分，小學(xué)20～22 分，初中及以上24～26分為輕度認(rèn)知功能障礙；MoCA 測(cè)試：評(píng)分≥26分為沒(méi)有認(rèn)知功能障礙，在21～26為輕度認(rèn)知功能障礙，<21 分為癡呆，對(duì)受教育年限在12 y及以下的被測(cè)試者加1分，最高分為30分。

1.2.3 CBS基因多態(tài)性分析 受試者(均于發(fā)病3 d內(nèi))當(dāng)日晨，均空腹抽取靜脈血2 ml，以2%的EDTA抗凝，-70 ℃保存待檢測(cè)。采用擴(kuò)增阻滯突變體系法檢測(cè)CBS基因型。用TKM法提取基因組DNA。CBS擴(kuò)增引物序列參考文獻(xiàn)[5]，擴(kuò)增CBS基因的反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增片段大小為870 bp,分為純和突變型C/C、雜和型C/T及野生型T/T，結(jié)果(見圖1)。

2 結(jié) 果

2.1 空腹Hhcy組和Hcy水平正常組一般資料和臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比 空腹Hhcy組患者中合并高血壓、冠心病、飲酒危險(xiǎn)因素所占的比例均高于Hcy水平正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P<0.05)，Hhcy組LDL水平高于Hcy水平正常組(P<0.05)，結(jié)果(見表1)。

2.2 空腹Hhcy組和Hcy水平正常組不同時(shí)間MMSE和MoCA評(píng)分比較 空腹Hhcy組14 d、30 d和90 d MMSE和MoCA評(píng)分分別低于Hcy水平正常組(P<0.01或0.05)，入院時(shí)兩組MMSE和MoCA評(píng)分比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果(見表2)。

2.3 各血管病危險(xiǎn)因素與VCI的關(guān)系 以0.05、0.10分別作為入選和剔除自變量的顯著性水平，將年齡、性別構(gòu)成、高血壓、冠心病和糖尿病患病率、吸煙率、飲酒率、CBS基因型、TC、TG、Glu、LDL、HDL、BMI、Hcy水平按其作用大小依次引入回歸方程。 結(jié)果最終選入回歸模型的有糖尿病、高血壓、LDL、HDL、TC、Hcy，其P值分別為0.025、0.008、0.034、0.003、0.029和0.018，結(jié)果(見表3)。

2.4 CBS不同基因型Hcy水平及各觀察點(diǎn)MoCA和MMSE評(píng)分比較 C/C型Hcy水平高于C/T和T/T型(P<0.01)，C/T型高于T/T型(P<0.01)；各基因型入院時(shí)MMSE和MoCA評(píng)分無(wú)差別(P>0.05)，而入院14 d時(shí)，C/C型MMSE和MoCA評(píng)分低于T/T型(P<0.05)，隨訪30 d和90 d時(shí)， C/C型MMSE和MoCA評(píng)分趨勢(shì)是低于C/T和T/T型(P<0.01或0.05)，C/T型低于T/T型(P<0.01或0.05)，結(jié)果(見表4)。

表1 空腹高Hcy血癥組和Hcy水平正常組一般資料和臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比[%(例)， ±s]

Hhcy組和正常組比較*P<0.05

表2 空腹Hhcy組和Hcy水平正常組不同時(shí)間MMSE和MoCA評(píng)分的比較

正常組和Hhcy組比較*P<0.05，**P<0.01

表3 VCI各血管病危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

*P<0.05，**P<0.01

表4 CBS不同基因型Hcy水平及各觀察點(diǎn)MoCA和MMSE評(píng)分比較(例，

①為C/C基因型；②為C/T基因型；③為T/T基因型，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

在我們國(guó)家，血管性癡呆是僅次于Alzheimer病引起癡呆的第二位常見病因，輕度認(rèn)知功能障礙是癡呆的高危人群，是其前期表現(xiàn)和預(yù)防癡呆的關(guān)鍵階段。近年來(lái)有研究報(bào)道，Hhcy是血栓性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3,4,6]。

本研究Logistic回歸分析顯示除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素高血壓、糖尿病、TC以外，Hhcy是腦梗死患者輕度VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與前述觀點(diǎn)基本一致，而CBS T833C基因突變并未進(jìn)入回歸模型，顯示其并非輕度VCI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，結(jié)合國(guó)外Sungeun Kim等[7]研究，分析其原因可能為CBS基因突變對(duì)腦梗死患者輕度VCI產(chǎn)生影響是通過(guò)改變血漿Hcy水平實(shí)現(xiàn)的，但同時(shí)血漿Hcy水平還受到MTHFR基因型、蛋氨酸合成酶基因型以及血漿維生素水平等多重因素影響，故而CBS T833C基因突變?cè)诒狙芯縇ogistic回歸分析中成為“干擾因素”被剔除，如對(duì)影響血漿Hcy水平的所有因素均進(jìn)行測(cè)定和分析，CBS T833C基因突變可能就會(huì)進(jìn)入Logistic回歸模型而成為獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 CBS是體內(nèi)Hcy分解代謝的關(guān)鍵酶，其有多個(gè)突變位點(diǎn)，T833C位點(diǎn)突變是其最常見突變位點(diǎn)[8]，使其編碼的異亮氨酸代替蘇氨酸，引起CBS結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象變化，從而影響酶的活性，進(jìn)而影響體內(nèi)Hcy的代謝，導(dǎo)致Hhcy的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死患者C/C型Hcy水平高于C/T和T/T型(P<0.01)，C/T型高于T/T型(P<0.01)，證實(shí)CBS基因是腦梗死患者Hcy水平異常增高的關(guān)鍵代謝基因，同樣的研究結(jié)論多有報(bào)道[9～11]。

本研究通過(guò)對(duì)空腹Hhcy組和Hcy水平正常組腦梗死患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，空腹Hhcy組14 d、30 d和90 d MMSE和MoCA評(píng)分分別低于Hcy水平正常組(P<0.01或0.05)，而入院時(shí)兩組MMSE和MoCA評(píng)分比較均無(wú)差別(P>0.05)，隨著觀察時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，MMSE和MoCA評(píng)分值逐漸增加的趨勢(shì)，可能與病情恢復(fù)、藥物干預(yù)及補(bǔ)充葉酸和甲鈷胺等有關(guān)，除兩組入院時(shí)評(píng)分無(wú)差別外，其它各觀察點(diǎn)均低于Hcy水平正常組，可能說(shuō)明Hhcy通過(guò)一系列的損害機(jī)制，造成患者認(rèn)知功能的下降，同時(shí)延遲認(rèn)知功能恢復(fù)。Morris MS[12 ]研究同樣發(fā)現(xiàn)，Hcy水平升高與MMSE評(píng)分下降相關(guān)，隨著對(duì)觀察對(duì)象隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，這種趨勢(shì)愈加明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MMSE評(píng)分下降與葉酸和甲鈷胺水平下降相關(guān)。同樣Nilsson K,等[13]研究發(fā)現(xiàn)升高的Hcy可能是血管性癡呆的標(biāo)記物。國(guó)外多數(shù)研究表明[8,14,15]，Hhcy引起VCI的可能作用機(jī)制為：(1)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞;(2)影響血管平滑肌細(xì)胞的遷移及增殖;(3)干擾抗凝和纖溶系統(tǒng);(4)影響脂質(zhì)代謝紊亂從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化;(5)促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡;(6)有神經(jīng)興奮的毒性作用，使得β淀粉樣蛋白毒性增強(qiáng);(7)影響神經(jīng)傳導(dǎo)功能。

本研究對(duì)180例腦梗死患者CBS T833C基因多態(tài)性隨訪中發(fā)現(xiàn)，各基因型入院時(shí)MMSE和MoCA評(píng)分無(wú)差別(P>0.05)，而入院14 d時(shí)，C/C型MMSE和MoCA評(píng)分低于T/T型(P<0.05)，在隨訪30 d和90 d時(shí)，C/C型MMSE和MoCA評(píng)分趨勢(shì)是低于C/T和T/T型(P<0.01或0.05)，C/T型低于T/T型(P<0.01或0.05)，說(shuō)明CBS T833C基因突變對(duì)腦梗死患者VCI產(chǎn)生影響，而C/C和C/T型對(duì)認(rèn)知功能障礙的恢復(fù)有著不利的影響。總之，CBS T833C基因突變可導(dǎo)致Hhcy的發(fā)生，進(jìn)而間接促進(jìn)了腦梗死患者VCI事件的出現(xiàn)，可能是VCI的遺傳易感因素，在癡呆預(yù)防工作中，特別是缺少傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的患者，行CBS T833C基因檢測(cè)是必要的，雖然目前遺傳因素仍不能干預(yù)，但及早發(fā)現(xiàn)Hcy水平異常升高對(duì)VCI的預(yù)防有著積極預(yù)測(cè)價(jià)值，并進(jìn)行針對(duì)性的干預(yù)。

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The correlation research of cystathionine βsynthase gene mutation on mild vascular cognitve impairment with cerebral infarction

LIUHuaixiang,CHENJinlai,LUWei.

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211,China)

Objective To study the value of the homocystine metabolic gene T833C polymorphism of cystathionine βsynthase (CBS) in the mild vascular cognitve impairment (VCI) after acute cerebral infarction.Methods CBS T833C genetyp was analyzed by PCR-ARMS technologies.Acute cerebral infarction were separately on admission,14 days,30 days and 90 days with Montreal Cognitive Assessment scale(MoCA) and Mini-getting the State Examination (MMSE) score.Results Logistic regression analysis showed that Hcy may be independent risk factors for mild VCI(OR=1.274;95%CI1.027～1.264;P=0.018).The comparison of 14 days,30 days,90 days MMSE and MoCA scores with fasting plasma hyperhomocysteinemia patients were respectively lower than that of normal Hcy levelgroup (P<0.01 orP<0.05).Comparing different genotype scores,there were not difference on admission(P>0.05),C/C genotype MMSE and MoCA scores were respectively below T/T genotype on hospital 14 days(P<0.05),follow-up 30 and 90 days,C/C genotype scores trend of MMSE and MoCA were below C/T and T/T genotypes(P<0.01 orP<0.05),C/T genotype score was lower than T/T genotype (P<0.01 orP<0.15).Conclusions CBS T833C gene mutations can lead to hyperhomocysteinemia,indirectly promote the emergence of VCI events with cerebral infarction patients,may be a genetic susceptibility factor of VCI.

Cerebral infarction; Cystathionine βsynthase; Homocystine; Vascular cognitve impairment

1003-2754(2017)06-0519-04

2017-02-24；

2017-05-25

天津市衛(wèi)計(jì)委科技基金(2015KZ095)

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211) 通迅作者：劉懷翔，E-mail：liuhuaixiang2002@sina.com

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