陳嬌嬌，周 彤

(天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387)

高效液相法測(cè)定黃柏中小檗堿的含量

陳嬌嬌，周 彤

(天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387)

建立了黃柏中小檗堿含量測(cè)定方法。采用高效液相色譜的方法測(cè)定黃柏中小檗堿的含量。色譜條件：Inertisl? ODS-3色譜柱(250mm×4.60mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈：0.10%磷酸=1:1，流速為0.80mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm，柱溫為30℃；小檗堿的線性范圍為1.06μg～11.60μg，其線性曲線為S=4.99×106Q+7.99×105(R2=0.9999)，平均加樣回收率為98.77%，RSD值為3.87%。該含量方法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可重復(fù)的特點(diǎn)。

黃柏 小檗堿 HPLC 含量測(cè)定

0 引言

黃柏又被稱為檗木、檗皮、黃檗，其化學(xué)成分種類繁多，最早在20世紀(jì)20年代中期日本學(xué)者村山義溫等從產(chǎn)自日本的黃檗中得到小檗堿以及少量巴馬亭[1]。黃柏中主要含有生物堿類化合物、檸檬苷素類化合物、甾醇類化合物、酯類化合物、黃酮類化合物、萜類化合物等[2-3]。

黃柏的主要有效成分為小檗堿，它屬于生物堿類化合物，具有抗菌[4]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]、免疫抑制[4]等藥理作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，王進(jìn)等[5]利用薄層色譜法對(duì)小檗堿的含量進(jìn)行測(cè)定，但是，在實(shí)驗(yàn)過程中，所用展開劑多為易揮發(fā)溶劑，并且測(cè)定時(shí)點(diǎn)樣量的差異等問題都會(huì)使該方法的準(zhǔn)確度降低。龍小華等[6]利用比色法測(cè)定復(fù)方苦參洗劑中小檗堿的含量，但是比色法適用于測(cè)定某一類化合物的含量，對(duì)于某一確定物質(zhì)的含量測(cè)定的準(zhǔn)確度不是很高。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)在多用HPLC法測(cè)定其含量，它具有分離效果好、準(zhǔn)確性高、可重復(fù)的特點(diǎn)[7]。

本課題采用HPLC的方法，建立了黃柏中小檗堿的含量測(cè)定方法，為以后黃柏的質(zhì)量控制提供了一種參考方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

儀器：TD-5102B電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；FA電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，天津星科儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ-3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；e2695液相色譜儀，沃特世科技有限公司。

材料：鹽酸小檗堿，成都普思生物科技有限公司；黃柏，購(gòu)自藥店；乙腈(色譜純)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 黃柏有效成分的提取

稱取黃柏粗粉5g，加入70%乙醇50mL，提取1h，提取3次，過濾，收集濾液，旋蒸，稱重，收集黃柏提取物。

1.3 黃柏有效成分含量測(cè)定方法的建立[8-11]

1.3.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱定5.30mg鹽酸小檗堿對(duì)照品置于10mL容量瓶中，用甲醇定容到10mL，搖勻，得0.53mg/mL對(duì)照品溶液，用0.22μm的膜過濾，濾液作為對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制

稱取黃柏提取物約0.25g，其質(zhì)量精確到小數(shù)點(diǎn)后第三位，置于10mL容量瓶中，加適量甲醇：鹽酸(0.60mol/L)=100:1溶液，超聲溶解30min，冷卻，用甲醇鹽酸液定容至刻度，搖勻，用0.22μm的膜過濾，濾液作為供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Inertisl? ODS-3柱(4.60mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈：0.10%磷酸溶液(每100mL0.10%磷酸溶液中加入0.10g十二烷基磺酸鈉)=1:1；柱溫：30℃；流速：0.80mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)：265nm；進(jìn)樣量：5μL。

1.3.4 線性關(guān)系

移取已經(jīng)配制好的0.53mg/mL對(duì)照品溶液1mL，分別吸取2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL注入液相色譜中，測(cè)定色譜峰面積，求算線性回歸方程。

1.3.5 精密度

分別吸取5μL的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，計(jì)算其RSD值。

1.3.6 重復(fù)性

精密稱取同一批樣品6份，按供試品溶液的處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，依法測(cè)定，計(jì)算其RSD值。

1.3.7 穩(wěn)定性

精密吸取樣品溶液5μL，于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分別進(jìn)樣，依法測(cè)定，計(jì)算其RSD值。

1.3.8 加樣回收率

精密稱取已知樣品含量的樣品6份，分別加入一定量的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，按供試品溶液處理上述樣品，測(cè)定，并根據(jù)樣品含量及鹽酸小檗堿對(duì)照品加入量，計(jì)算回收率及其RSD值。

1.3.9 樣品測(cè)定

精密稱取黃柏樣品0.05g，依照供試品溶液的處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，平行試驗(yàn)3次，并依法測(cè)定其含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)照品與樣品液相色譜圖

圖1分別為小檗堿和黃柏提取物的的高效液相色譜圖，從圖中我們可以看出小檗堿在9min時(shí)出現(xiàn)色譜峰，同時(shí)，我們也可以看到黃柏提取物樣品在9min時(shí)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的色譜峰，并且與其他組分分離良好。

圖1 小檗堿和黃柏提取物的液相色譜圖

2.2 小檗堿線性關(guān)系曲線

上述不同進(jìn)樣量的對(duì)照品線性關(guān)系如圖2所示，其線性方程為S=4.99×106Q+7.99×105，R2=0.9999，說明其線性關(guān)系良好。

圖2 小檗堿線性關(guān)系

2.3 小檗堿精密度

用濃度為0.53mg/mL對(duì)照品溶液連續(xù)六次進(jìn)樣依法測(cè)定，其峰面積如表1所示，其RSD值為0.20%<5%，說明此方法的精密度良好。

表1 小檗堿的精密度

2.4 小檗堿穩(wěn)定性

用一定濃度的樣品溶液在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分別依法測(cè)定，其峰面積如表2所示，其RSD值為0.14%<5%，說明其穩(wěn)定性良好。

2.5 小檗堿重復(fù)性

取6份同一批樣品約0.05g，依法進(jìn)行測(cè)定，其峰面積如表3所示，其RSD值為1.80%<5%，說明方法的重復(fù)性良好。

表3 鹽酸小檗堿的重復(fù)性

2.6 小檗堿加樣回收率

取同一批樣品約0.05g，加入一定量的鹽酸小檗堿(0.27mg)，測(cè)定其加樣回收率，其平均加樣回收率如表4所示，其RSD值為3.87%<5%，結(jié)果表明該方法具有較好的回收率。

表4 鹽酸小檗堿的加樣回收率

2.7 黃柏提取物含量測(cè)定

對(duì)上述黃柏樣品進(jìn)行含量測(cè)定，根據(jù)測(cè)定出的峰面積計(jì)算小檗堿的含量，其計(jì)算結(jié)果如表5所示，其3批樣品的RSD值為4.90%，同時(shí)，這也說明了本實(shí)驗(yàn)選取的提取工藝具有較好的穩(wěn)定性。

表5 黃柏的含量測(cè)定

3 結(jié)論

(1)建立了黃柏中小檗堿的含量測(cè)定方法，其線性方程為S=4.99×106Q+7.99×105，R2=0.9999；用濃度為0.53mg/mL對(duì)照品溶液連續(xù)六次進(jìn)樣依法測(cè)定，其RSD值為0.20%，說明此方法的精密度良好；用一定濃度的樣品溶液在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分別依法測(cè)定，其RSD值為0.14%，說明鹽酸小檗堿在12h內(nèi)的穩(wěn)定性良好；取6份同一批樣品約0.05g，依法進(jìn)行測(cè)定，其RSD值為1.80%<5%，說明方法的重復(fù)性良好；取同一批樣品約0.05g，加入一定量的鹽酸小檗堿(0.27mg)，測(cè)定其加樣回收率，平均加樣回收率為98.77%，其RSD值為3.87%，結(jié)果表明該方法具有較好的回收率。綜上所述，說明該含量測(cè)定方法具有可靠性和可重復(fù)性，其穩(wěn)定性較高。

(2)我們?cè)诮ⅫS柏中小檗堿含量測(cè)定方法的同時(shí)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)選取的黃柏提取工藝的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，經(jīng)過計(jì)算本實(shí)驗(yàn)得到的黃柏提取物中小檗堿的含量約為3.84%，其RSD值為4.90%，這表明該提取方法具有較好的穩(wěn)定性。

[1] 劉壽山. 中藥研究文獻(xiàn)摘要[M]. 北京：科學(xué)出版社，1963：608-614.

[2] 鄭虎占，董澤宏，祭靖. 中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用[M]. 北京：學(xué)苑出版社，1997：40-43.

[3] 李丹丹，江培，楊書美，等. 黃柏的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2014，27(3)：601-605.

[4] 陳陽(yáng)峰，鐘曉紅. 黃柏的藥理作用及其活性成分提取[J]. 作物研究，2015(5)：564-568.

[5] 王進(jìn)，佟智. 薄層色譜法測(cè)定香連丸中鹽酸小檗堿含量研究[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(1)：28-29.

[6] 龍小華，厲輝，黃嶸. 三元絡(luò)合物比色法測(cè)定復(fù)方苦參洗劑中小檗堿的含量[J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志，2004，22(5)：294-296.

[7] 呂長(zhǎng)淮. 鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法概述[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7(33)：141-142.

[8] 薩仁高娃，吳雙英，白玉霞. RP-HPLC法測(cè)定蒙藥黃柏-8味散中小檗堿的含量[J]. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2012(10)：60-61.

[9] 孫奇，劉芳. HPLC法測(cè)定九圣散中小檗堿的含量[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11(19)：484-485..

[10]孔華麗，劉暢，曹文斌. 高效液相法測(cè)定知柏前列復(fù)膠囊中小檗堿的含量[J]. 武警醫(yī)學(xué)，2009，20(12)：1120-1121.

[11]Chen J, Wang F, Liu J, et al. Analysis of alkaloids in Coptis chinensis Franch by accelerated solvent extraction combined with ultra performance liquid chromatographic analysis with photodiode array and tandem mass spectrometry detections[J]. Analytica Chimica Acta，2008，613(2)：184-195.

Determination of Berberine Content in Cortex Phellodendri by High Performance Liquid Chromatography

CHENJiao-jiao,ZHOUTong

(School of Environmental and Chemical Engineering, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387)

In order to establish a method to determine berberine content in cortex phellodendri, high performance liquid chromatography (HPLC) was adopted to determine the berberine content in cortex phellodendri. The chromatographic conditions were listed as followed: Inertisl? ODS-3 column (250mm×4.60mm, 5μm), the mobile phase acetonitrile: 0.10% phosphoric=1:1, flow rate 0.80mL/min, detection wave length 265nm for berberline and column temperature 30℃. The results showed that the linear range of berberline was 1.16μg～11.60μg and the linear curve was S=4.99×106Q+7.99×105(R2=0.9999). The average recovery rate of the method was 98.77%, RSD was 3.87%. The conclusion was that this method was simple, stable and repeatable.

cortex phellodendri berberine HPLC content determination

2017-01-21

陳嬌嬌(1977-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。

R917

A

1008-5580(2017)03-0151-04