王秀剛，高梅梅，耿春梅，袁桂艷，王本杰，郭瑞臣#

(1.山東省青州榮軍醫(yī)院藥劑科，山東 青州 262500； 2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床藥理研究所，山東 濟(jì)南 250012)

高效液相色譜法測定人血漿和胸水中洛鉑的質(zhì)量濃度

王秀剛1*，高梅梅2，耿春梅2，袁桂艷2，王本杰2，郭瑞臣2#

(1.山東省青州榮軍醫(yī)院藥劑科，山東 青州 262500； 2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床藥理研究所，山東 濟(jì)南 250012)

目的：建立同時(shí)測定人血漿、胸水中洛鉑質(zhì)量濃度的高效液相色譜法，并應(yīng)用于肺癌患者，為臨床治療藥物監(jiān)測提供依據(jù)。方法：人血漿、胸水樣品離心后，經(jīng)乙腈蛋白沉淀，色譜柱為Inertsil-ODS-SP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為pH=6.5的磷酸鹽緩沖液-乙腈(含0.03%三乙胺)(V∶V=96∶4)，流速為1.0 ml/min，于215 nm波長處進(jìn)行檢測。結(jié)果：胸水中洛鉑質(zhì)量濃度在0.1～80.0 μg/ml、血漿中洛鉑質(zhì)量濃度在0.1～50.0 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，洛鉑在胸水、血漿中最低定量限和檢測限分別為0.1、0.5 μg/ml。結(jié)論：本研究建立了快速測定人胸水、血漿中洛鉑濃度的高效液相色譜法，該方法靈敏、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、選擇性好、準(zhǔn)確度高，可用于準(zhǔn)確測定人胸水、血漿中洛鉑的含量，并用于治療藥物監(jiān)測，有利于對患者進(jìn)行個(gè)體化治療。

洛鉑； 治療藥物監(jiān)測； 高效液相色譜法； 非對映異構(gòu)體； 肺癌

洛鉑即1，2-二氨基-環(huán)丁烷-乳酸合鉑，是第3代鉑類抗腫瘤藥，其2種非對映異構(gòu)體以約1∶1的比例同時(shí)存在，結(jié)構(gòu)式見圖1[1-2]。研究結(jié)果表明，與其他鉑類抗腫瘤藥比較，洛鉑具有多項(xiàng)優(yōu)勢，如胃腸道不良反應(yīng)小、水溶液性質(zhì)穩(wěn)定等[3-4]。洛鉑與順鉑的作用機(jī)制相似，但毒副作用少，與其他鉑類藥物無交叉耐藥性，且對順鉑耐藥的腫瘤也有效，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[5]。臨床上，患者應(yīng)用注射用洛鉑后的體內(nèi)藥物濃度個(gè)體差異較大，因此，需要對其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測。但是，目前關(guān)于對體內(nèi)尤其是胸水中洛鉑的質(zhì)量濃度進(jìn)行治療藥物監(jiān)測的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)建立了快速、準(zhǔn)確、靈敏地測定人血漿和胸水中洛鉑濃度的方法，并成功用于肺癌患者應(yīng)用注射用洛鉑后的洛鉑濃度監(jiān)測。

圖1 洛鉑的2種非對映異構(gòu)體結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structures of two diastereoisomers of lobaplatin

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，Agilent G1313A型自動進(jìn)樣器、G1314A型紫外檢測器、LC系統(tǒng)化學(xué)工作站(美國安捷倫儀器公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；ABOTT高速離心機(jī)(美國雅培公司)；PK514BP型超聲清洗器(德國BANDELIN公司)；梅特勒-托利多AL-104型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；梅特勒-托利多AX-205 Delta Range電子天平(瑞士梅特勒公司)；SBHW-Ⅳ型電熱恒溫水溫箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 藥品與試劑

注射用洛鉑(海南長安國際制藥有限公司，批號：20150401，規(guī)格：50 mg/支)；乙腈(色譜純，美國J.T.Baker公司，批號：0000096305)；磷酸二氫鉀(分析純，山東省化工研究院，批號：20110224)；氫氧化鈉(分析純，山東省化工研究院，批號：20150307)；哇哈哈飲用純凈水(杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司，批號：20160103)；空白血漿購自山東省血液中心，空白胸水由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院呼吸科提供。參與研究的11例肺癌患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會討論通過。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取洛鉑標(biāo)準(zhǔn)品，用純凈水配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于棕色瓶中。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液于棕色容量瓶中，用純凈水定容，分別配制成不同質(zhì)量濃度(5、10、50、100、200、300、400、500、800 μg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將以上各溶液至于4 ℃冰箱冷藏保存，每3 d新配制1次。

2.2 樣本的采集、保存

空白血漿購自山東省血液中心；肺癌患者來源于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院呼吸內(nèi)科，采集血樣前采取胸腔給藥途徑，將注射用洛鉑30 mg以注射用水5 ml溶解，加入5%葡萄糖溶液500 ml中。分別采集給藥前及給藥2、17 h后患者的胸水和全血樣本，在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min處理，于-80 ℃保存?zhèn)錅y。

2.3 樣本的處理、測定

色譜條件：色譜柱為Inertsil-ODS-SP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為pH=6.5的磷酸鹽緩沖液-乙腈(含0.03%三乙胺)(V∶V=96∶4)，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl，檢測波長為215 nm，柱溫為室溫(25 ℃)。取血漿/胸水樣品200 μl，加入乙腈600 μl，渦旋，混勻3 min；在10 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，37 ℃水浴下以N2恒速吹干；給予純凈水100 μl復(fù)溶，渦旋，混勻1 min，在10 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液20 μl進(jìn)樣分析；整個(gè)操作過程注意避光[6]。

2.4 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

洛鉑的2種非對映異構(gòu)體色譜圖見圖2。血漿和胸水中的雜質(zhì)不影響洛鉑測定，2種非對映異構(gòu)體L-D1和L-D2的保留時(shí)間分別為22.550和23.906 min。

A.25 μg/ml的洛鉑標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.空白胸水；C.空白血漿；D.50 μg/ml的洛鉑胸水樣本；E.40 μg/ml的洛鉑血漿樣本A. 25 μg/ml lobaplatin standard solution；B.blank hydrothorax；C.blank plasma；D.50 μg/ml lobaplatin blank hydrothorax spiked；E.40 μg/ml lobaplatin blank plasma spiked圖2 洛鉑2種非對映異構(gòu)體的色譜圖Fig 2 Typical chromatograms of two diastereoisomers of lobaplatin

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、最低定量限及檢測限

精密吸取不同質(zhì)量濃度(5、10、50、100、200、300、500 μg/ml)洛鉑儲備液20 μl，分別加入至180 μl空白血漿中，配成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0 μg/ml的血漿溶液[7]；同法配成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、40.0、80.0 μg/ml的胸水溶液，經(jīng)乙腈蛋白沉淀后進(jìn)樣測定。洛鉑質(zhì)量濃度(X)與峰面積(Y)以外標(biāo)法定量回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、最低定量限及檢測限見表1。

2.6 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果

取空白血漿和胸水，配制不同質(zhì)量濃度的洛鉑溶液，設(shè)定低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本，經(jīng)蛋白沉淀處理后進(jìn)樣測定，根據(jù)測定質(zhì)量濃度與實(shí)際加入質(zhì)量濃度計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表2。

表1 胸水和血漿中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的線性、最低定量限、檢測限Tab 1 Linearity, LOQ and LOD of two diastereoisomers of lobaplatin in human hydrothorax and plasma

表2 胸水和血漿中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的提取回收率(n=5)Tab 2 Recovery of two diastereoisomers of lobaplatin in human hydrothorax and plasma(n=5)

2.7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)定低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，重復(fù)制備測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；然后每日制備并測定1次，連續(xù)3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表3。

表3 胸水和血漿中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的精密度、準(zhǔn)確性(n=5)Tab 3 Intra-day and inter-day precision and accuracy for determination of two diastereoisomers of lobaplatin in human hydrothorax and plasma(n=5)

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

分別配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿、胸水溶液，分別于室溫(25 ℃)放置7、14 h，-20 ℃冰箱放置2、7、14、30 d，凍融2次等避光保存，經(jīng)蛋白沉淀提取，每個(gè)質(zhì)量濃度平行衍生化5次，分別測定。結(jié)果顯示，上述穩(wěn)定性試驗(yàn)條件下，血漿、胸水中洛鉑穩(wěn)定，可以滿足實(shí)際需要。

2.9 肺癌患者血漿和胸水中洛鉑含量的測定

11例肺癌患者中，男性8例，女性3例；年齡33～72歲，平均(58.00±12.28)歲。按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，給藥2 h后某肺癌患者血漿、胸水中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的色譜圖見圖3，給藥2、17 h后11例肺癌患者胸水、血漿中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的質(zhì)量濃度測定結(jié)果見表4。

F.胸水；G.血漿F.hydrothorax；G.plasma圖3 肺癌患者血漿、胸水中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的色譜圖Fig 3 Typical chromatograms of two diastereoisomers of lobaplatin in lung cancer patients

樣本給藥2h后給藥17h后L?D1質(zhì)量濃度L?D2質(zhì)量濃度L?D1質(zhì)量濃度L?D2質(zhì)量濃度胸水6107±18876226±1724418±222344±107血漿548±184687±509367±249335±170

3 討論

目前，已有洛鉑體內(nèi)濃度[6]、污染環(huán)境(水)[7]測定，以及非對映異構(gòu)體[8]測定的文獻(xiàn)報(bào)道，但未見同時(shí)測定洛鉑2種非對映異構(gòu)體的報(bào)道，亦未見用于胸水中洛鉑質(zhì)量濃度監(jiān)測的研究，臨床缺乏具有實(shí)際指導(dǎo)意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究建立了能夠同時(shí)測定人血漿和胸水中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的高效液相色譜法，該方法快速、穩(wěn)定、高效、準(zhǔn)確。血漿和胸水的處理采用沉淀蛋白法，以乙腈為蛋白沉淀劑，既經(jīng)濟(jì)、方便、血漿中雜質(zhì)無干擾，又符合測定要求。

由于洛鉑2種非對映異構(gòu)體的分離受流動相pH的影響較大，本研究通過比較磷酸鹽緩沖液與乙腈不同配比以及磷酸鹽緩沖液不同pH對洛鉑2種非對映異構(gòu)體保留時(shí)間、峰形、血漿和胸水中其他雜質(zhì)有無干擾等，確定流動相最佳配比和磷酸鹽緩沖液的pH。該方法條件下，洛鉑2種非對映異構(gòu)體分離良好，保留時(shí)間適中，血漿和胸水中其他雜質(zhì)無干擾。

本方法色譜條件下，可同時(shí)測定血漿和胸水中洛鉑2種非對映異構(gòu)體的質(zhì)量濃度，操作簡單、專屬性好、靈敏度高，適用于常規(guī)治療藥物監(jiān)測，利于患者進(jìn)行個(gè)體化治療。

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Mass Concentration of Lobaplatin in Human Plasma and Hydrothorax by HPLC

WANG Xiugang1，GAO Meimei2，GENG Chunmei2，YUAN Guiyan2，WANG Benjie2, GUO Ruichen2

(1.Dept.of Pharmacy, Qingzhou Rongjun Hospital of Shandong Province，Shandong Qingzhou 262500, China; 2.Institute of Clinical Pharmacology, Qilu Hospital of Shandong University,Shandong Jinan 250012, China)

OBJECTIVE：To establish the method for mass concentration of lobaplatin in human plasma and hydrothorax by HPLC. The method was used for patients with lung cancer, and could provide basis for the clinical therapeutic drug monitoring(TDM). METHODS: Human plasma and hydrothorax samples were centrifuged and extracted with acetonitrile. The Inertsil-ODS-SP column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was used, the mobile phase were consisted of phosphate buffer (pH=6.5) and acetonitrile (containing 0.03% triethylamine)(V∶V=96∶4) and flushed at a flow rate of 1.0 ml/min，the wavelength was 215 nm. RESULTS: The calibration curves were linear over a concentration range of 0.1 μg/ml-80.0 μg/ml in the hydrothorax and 0.1 μg/ml-50.0 μg/ml in the plasma respectively. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) was 0.1 μg/ml and 0.5 μg/ml in hydrothorax and plasma. CONCLUSIONS: A rapid HPLC method to detect the concentration of lobaplatin in human plasma and hydrothorax was established. The method is sensitive, stable with good reproducibility, selectivity and high accuracy, and could be successfully used for the determination of lobaplatin concentration in human plasma and hydrothorax so as to conduct the therapeutic drug monitoring and provide individualized therapy for lung cancer patients.

Lobaplatin; Therapeutic drug monitoring; HPLC; Diastereoisomer; Lung cancer

R927.2

A

1672-2124(2017)05-0597-04

2017-03-13)

*副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：wangxiugang123@126.com

#通信作者：主任藥師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：臨床藥學(xué)和臨床藥理學(xué)。E-mail：grc7636@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.05.008