涂明月，李杰，何亞麗，李醒，李俊，袁曉君*

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市能源作物育種及應(yīng)用重點實驗室，上海200444；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240)

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利用RAPD標(biāo)記鑒定草地早熟禾種質(zhì)資源的遺傳多樣性

涂明月1，李杰1，何亞麗2，李醒1，李俊2，袁曉君1*

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市能源作物育種及應(yīng)用重點實驗室，上海200444；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240)

草地早熟禾是一種重要的冷季型草坪草，廣泛種植于溫帶地區(qū)，且擁有眾多的商品品種和豐富的野生資源。本研究收集了國內(nèi)外72份草地早熟禾材料，對它們苗期的株高、葉寬、葉色及分蘗情況進行了考察，結(jié)果顯示材料間的表型差異顯著。此外，又在材料間進行了RAPD擴增產(chǎn)物的多態(tài)性鑒定，20條引物共擴增出115條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達91%。UPGMA聚類顯示，材料被聚成兩大類：一類為4個國內(nèi)品種/系(“滬夜”、“滬青”、“滬禾2號”和“雜禾”)，另一大類為剩余的所有材料。當(dāng)遺傳相似系數(shù)增大后，后一大類分成3組，組Ⅰ以國外引進品種為主，組Ⅱ和組Ⅲ則集中了更多的野生材料。RAPD聚類分析結(jié)果與材料背景來源之間存在一定程度的相關(guān)，但與苗期表型性狀沒有相關(guān)性。

草地早熟禾；RAPD；遺傳多樣性；聚類分析

草地早熟禾(Poapratensis)是一種廣受歡迎的草坪草品種，廣泛分布于溫帶地區(qū)，在美國北部、歐洲以及我國北部等地區(qū)都有大面積的種植。草地早熟禾具有出色的分蘗能力，其草質(zhì)柔軟，且擁有耐寒、耐踐踏等特點，因此十分適合作為草坪種植。近年來，我國每年草坪草種的引種數(shù)量成倍增長[1]，草地早熟禾品種幾乎全部是從歐美國家引進。目前，國內(nèi)育種者們也正陸續(xù)培育出一些品質(zhì)優(yōu)秀的草地早熟禾品種，如大青山[2]、滬禾[3]、滬夜、滬青[4]、青海草地早熟禾[5]等。

隨著越來越多種類和數(shù)量的分子標(biāo)記被開發(fā)，分子標(biāo)記技術(shù)在各種作物的分子遺傳圖譜構(gòu)建，品種鑒定與純度分析，重要經(jīng)濟性狀相關(guān)基因定位，以及種質(zhì)資源多樣性分析等領(lǐng)域的研究中應(yīng)用已十分廣泛。它在草坪草種質(zhì)資源的多樣性研究中也日益發(fā)揮越來越大的作用。以RAPD(random amplified polymorphic DNA)分子標(biāo)記在草地早熟禾中的應(yīng)用為例，國內(nèi)田志宏等[6]曾利用17個RAPD引物對12份草地早熟禾品種進行了遺傳多樣性分析，將它們分成了5個類群；寧婷婷等[7]選用28個RAPD引物對15個草地早熟禾品種和1個加拿大早熟禾品種進行了分析，發(fā)現(xiàn)加拿大早熟禾的一個品種與其他草地早熟禾品種的相似性較低，單成一支；高麗娜等[8]利用69個RAPD標(biāo)記對32份草地早熟禾品種也進行了遺傳譜帶的分析，聚類出5個類群；在國外，早在2001年Huff[9]就曾利用RAPD標(biāo)記對草地早熟禾進行了研究；Johnson等[10]選取6條RAPD引物對228個草地早熟禾材料進行了聚類分析；Curley等[11]利用RAPD比較了123份草地早熟禾商業(yè)品種、種間雜交種和引種之間的遺傳關(guān)系；Fard等[12]利用篩選出的17條RAPD引物對包括16份草地早熟禾在內(nèi)的19份材料進行了多態(tài)性分析；Szenejko等[13]用18條RAPD引物對12個生態(tài)型，4個栽培品種和2個選育草地早熟禾材料進行了聚類分析。

此外，研究者們還利用了其他各類分子標(biāo)記對草地早熟禾及其他早熟禾屬植物進行了諸多研究，比如Rajasekar等[14]用15個RAPD 引物分析了27個粗莖早熟禾(Poatrivialis)品種的遺傳關(guān)系。郭郁頻等[15]利用ISSR(inter-simple sequence repeat)引物對34份早熟禾材料進行了遺傳多樣性分析。Goldman[16-17]也用ISSR標(biāo)記在各早熟禾屬材料中進行多態(tài)性篩選，并以此來鑒定種間雜交種。Arslan等[18]用ISSR標(biāo)記研究了3個窄葉早熟禾(Poaangustifolia)和11個粗莖早熟禾材料間的遺傳多樣性。Honig等[19-20]開發(fā)了88個草地早熟禾的SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記，并利用其中的25個標(biāo)記在247份草地早熟禾材料中進行了多態(tài)性的篩選及聚類。最近，趙閆閆等[21]也開發(fā)并利用SSR標(biāo)記，對18個早熟禾材料進行了多態(tài)性篩選及指紋圖譜構(gòu)建。

本實驗收集了72份國內(nèi)外的草地早熟禾材料，除了國外引進品種和國內(nèi)選育品種/系外，還包括了眾多的國內(nèi)外野生材料。本研究試圖對它們進行一個較為全面的種質(zhì)資源背景梳理，除了對苗期重要性狀進行考察之外，還利用前期篩選獲得的RAPD分子標(biāo)記對這些材料進行了遺傳多樣性的鑒定。本研究結(jié)果將為草地早熟禾種質(zhì)資源評價及后續(xù)的育種研究提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 材料收集與種植

本實驗共收集了國內(nèi)外72份草地早熟禾材料，包括國外引進品種48份，國外野生材料10份，國內(nèi)選育品種/系5份，以及吉林、甘肅、四川、貴州等地的野生材料9份(表1)。其中45份材料(Z27，Z43～Z71)由國家草種質(zhì)資源中期庫提供。2015年10月12日將收集的種子進行播種，每個材料約100粒，撒播于10 cm×10 cm×10 cm的塑料盆中，于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院農(nóng)場溫室中發(fā)芽、培養(yǎng)。2015年11月21日，從每個材料中隨機選取36株健康幼苗移栽到穴盤中，每穴一株。采用完全隨機區(qū)組實驗設(shè)計，共設(shè)6個區(qū)組，每個區(qū)組包括72個材料，每個材料種植一排(6株)。移栽后的植株繼續(xù)置于溫室中培養(yǎng)。隔天澆水1次，每月施Hoagland營養(yǎng)液1次，澆透。溫室內(nèi)氣溫在15～30 ℃，濕度40%～80%，自然光照。

1.2 苗期表型鑒定

在幼苗單株移栽當(dāng)日(移栽前)，測量各個材料植株的株高(發(fā)苗后未經(jīng)修剪)，隨機選取有代表性的5株健康幼苗進行測量。2016年3月14日，對移栽單株進行葉寬和分蘗數(shù)考察，每個材料在每個區(qū)組6株中選有代表性的一株測量其葉寬并數(shù)分蘗數(shù)，6個區(qū)組即6次重復(fù)。同時，根據(jù)每個區(qū)組中同一材料6株的整體顏色表現(xiàn)進行葉色評價，分為綠色，亮綠色。如果該材料在6個區(qū)組中至少有5個區(qū)組顏色表現(xiàn)一致，即根據(jù)絕大多數(shù)表現(xiàn)將之記為綠色或者亮綠色，其余情況記為綠色/亮綠色。

由于一些野生材料和混合群體材料的某些表型出現(xiàn)了單株間的分離，所以在統(tǒng)計分析葉寬時，去除了Z27，Z42，Z60和Z65的數(shù)據(jù)；統(tǒng)計分蘗時，去除了Z27和Z65的數(shù)據(jù)。此外，因為材料Z72沒有與其他材料同期播種，所以沒有與其他材料一起進行株高、分蘗和葉寬的考察。

1.3 DNA的提取及RAPD多態(tài)性篩選

每個供試材料隨機取10個單株，等量混合新鮮葉片，液氮冷凍，采用改良CTAB法提取基因組DNA[22]。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組DNA進行檢測，并稀釋至40 ng/μL作為工作液，母液-20 ℃保存?zhèn)溆谩１緦嶒炇仪捌谠?個草地早熟禾材料進行過400條RAPD引物多態(tài)性的篩選，從中選取可穩(wěn)定擴增出多態(tài)性條帶的24條引物供本實驗使用。RAPD引物序列參照加拿大大不列顛哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia)公布的“NAPS Unit Standard Primers”序列。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為10 μL：Taq DNA 聚合酶(3 U)0.08 μL，10×Buffer (Mg2+Plus) 1 μL，dNTP Mixture (25 mmol/L) 0.1 μL，引物(2 mmol/L)0.5 μL，模板DNA(40 ng)0.6 μL，ddH2O 7.72 μL；擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s；37 ℃引物退火35 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)40次；再72 ℃延伸8 min。用1.5%瓊脂糖對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，120 V電壓，約40 min。在紫外成像系統(tǒng)下掃描觀察并拍照。每個PCR反應(yīng)至少重復(fù)兩次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Microsoft Office Excel 2007對株高、葉寬、分蘗數(shù)的數(shù)據(jù)進行方差分析、顯著性檢驗等統(tǒng)計分析，并繪制柱形圖。選取在各個材料中能穩(wěn)定清晰擴增的多態(tài)性位點進行統(tǒng)計，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為999，用Excel形成0/1矩陣。利用NTSYS(Version 2.10e)軟件計算品種間的遺傳相似系數(shù)，再用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)進行聚類分析，并生成樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

根據(jù)對苗期株高的分析發(fā)現(xiàn)，不同材料40 d左右發(fā)芽苗的株高呈現(xiàn)顯著差異(圖1)，從3.5 cm到11.0 cm不等。其中Z58，Z70，Z46，Z51，Z52和Z64的株高均超過10 cm，而Z59，Z47，Z28，Z24，Z60和Z29的株高則最矮，均不足4 cm。各材料的株高呈現(xiàn)正態(tài)分布，近70%的材料集中在6.5～10.0 cm。根據(jù)對苗期葉寬的分析發(fā)現(xiàn)，不同材料葉寬也呈現(xiàn)顯著差異(圖2)，從1.78 mm到3.15 mm不等。其中Z22，Z34，Z52最寬，超過3 mm，而Z28，Z26，Z29則顯著較窄，不足2 mm。

對單株移栽4個月左右的幼苗進行分蘗數(shù)分析，除了Z60之外，其他材料均有分蘗發(fā)生，80%的材料有3～5個分蘗(圖3)。不同材料的分蘗數(shù)也呈現(xiàn)顯著差異，Z49和Z56最多，超過6個，而Z45,Z67,Z47和Z14的分蘗數(shù)較少，不足3個。另根據(jù)苗期考察發(fā)現(xiàn)，供試材料葉片顏色大致分為兩大類，綠色和亮綠色，還有一些介于兩者之間(表1)。

2.2 RAPD多態(tài)性擴增與聚類分析

利用24條RAPD隨機引物對72個草地早熟禾材料進行多態(tài)性擴增(圖4)，最終選取20條(S3，S18，S30，S32，S49，S82，S85，S92，S135，S146，S188，S229，S246，S254，S257，S285，S329，S341，S352和S400)能擴增出穩(wěn)定清晰多態(tài)性條帶的引物用于聚類分析。20條RAPD引物在72個品種中共擴增出126條條帶，平均每條引物擴增6.3條，其中多態(tài)性條帶115條。

圖1 各材料苗期株高差異性比較Fig.1 Comparison of plant height at seedling stage

圖3 各材料苗期分蘗數(shù)差異性比較Fig.3 Comparison of tillers number per plant at seeding stage

利用擴增效果最佳的41條多態(tài)性條帶對72個材料進行UPGMA聚類分析(圖5)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.52時，材料被分為兩大類：一大類僅包含4個材料，均是上海交通大學(xué)選育的材料，分別是“滬禾2號”(Z26)，“滬青”(Z28)、“滬夜”(Z29)和“雜禾”(Z42)；另一大類包括了余下的68個材料。當(dāng)相似系數(shù)增大到0.67時，該大類群又分成了3組：組Ⅰ包括43個材料，除3個為國內(nèi)野生材料(Z72，Z27，Z61)外，其余均為國外引進品種(占比93.0%)；組Ⅱ包括17個材料，由11個野生材料(3個國內(nèi)，8個國外；占比64.7%)和6個國外引進品種構(gòu)成；組Ⅲ包括8個材料，由1個國內(nèi)選育品種，2個國外引進品種和5個野生材料(2個國內(nèi)，3個國外；占比62.5%)構(gòu)成。

圖4 RAPD32在不同草地早熟禾材料中的擴增帶型Fig.4 Amplification bands of different Kentucky bluegrass materials generated by RAPD32

圖5 72個草地早熟禾材料的RAPD聚類分析Fig.5 UPGMA cluster analysis based on RAPDs of 72 Kentucky bluegrass materials *：國外引進品種Imported varieties；**：國內(nèi)選育品種Domestic varieties；***：國外野生材料Wild materials abroad；****：國內(nèi)野生材料Domestic wild materials.

3 討論

3.1 RAPD在草坪草中的擴增效果

在眾多種類的分子標(biāo)記中，RAPD技術(shù)出現(xiàn)較早，由于其操作簡便被大家廣泛采用。但由于其引物較短，較固定標(biāo)記而言穩(wěn)定性欠佳，所以利用時必須要經(jīng)過多輪的重復(fù)驗證，以確保其準確性。本實驗利用反復(fù)篩選獲得的RAPD引物對材料進行了多態(tài)性條帶的擴增，多態(tài)性比率達到91%，此結(jié)果與國內(nèi)外同類研究報道[7-8, 10, 12-14, 18]一致，RAPD在草地早熟禾和早熟禾屬植物中普遍具有很高的多態(tài)性。同時，RAPD在其他草坪草的研究中也取得了良好的擴增效果，多態(tài)性比率高。田志宏等[23]用 12個RAPD引物對從國外引進的 15 個高羊茅(Festucaarundinacea)品種進行研究，多態(tài)性帶比率69.41%；李惠英等[24]利用20條RAPD引物對26份高羊茅材料進行分析，多態(tài)性條帶比率達98.88%。趙念席等[25]利用16個RAPD引物對5個大針茅(Stipagrandis)種群90個個體進行擴增，多態(tài)性條比率100%。韓冰等[26]對7個不同地理分布的克氏針茅(Stipakrylovii)種群進行RAPD分析，擴增條帶多態(tài)率99.22%。梁慧敏[27]利用20個RAPD對28個狗牙根(Cynodondactylon)居群進行多態(tài)性分析，多態(tài)性比率96.32%。在22個RAPD標(biāo)記對16份旋花科草坪草馬蹄金(Dichondrarepens)的研究[28]中，也同樣獲得了91.45%的高多態(tài)性比率。由此可見，RAPD分子標(biāo)記在不同草中均能獲得很高的多態(tài)性比率，它是理想的多態(tài)性篩選、種質(zhì)資源鑒定的分子標(biāo)記類型。

3.2 分子標(biāo)記聚類與材料背景來源

本研究聚類分析結(jié)果顯示，4個上海交通大學(xué)自育品種/系聚在一起，構(gòu)成一大類。其中“滬青”和“滬夜”是兩個越夏性強的材料，分別選育自“Evergreen”和“Midnight”兩個國外品種[4]，“滬禾2號”是它們的混合群體，“雜禾”則是多個草地早熟禾品種的混合群體，主體也是“滬青”和“滬夜”，因此它們被聚類在一起，完全符合實際的材料背景情況。與它們遺傳關(guān)系較遠的另一大類，在提高遺傳相似系數(shù)后又被分成3組。有意思的是，組Ⅰ基本由國外引進品種構(gòu)成，組Ⅱ和組Ⅲ則更多的集中了野生材料，這說明材料來源與RAPD聚類結(jié)果存在一定的相關(guān)性。趙桂琴等[29]曾利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對早熟禾屬6種共31份種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析，也同樣發(fā)現(xiàn)來自同一地區(qū)或來源相同的材料大部分聚到一起。Farsani等[30]和Li等[31]利用ISSR標(biāo)記分別對來源于伊朗和中國各地的狗牙根材料進行了種質(zhì)資源的鑒定，他們都發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與地域來源存在一定程度的相關(guān)性。Babu等[32]在利用RAPD 和 ISSR分子標(biāo)記對象草(Pennisetumpurpureum)的研究中也發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與地域分布也存在相關(guān)。本實驗結(jié)果與這些草中的研究結(jié)果相仿，說明利用分子標(biāo)記對草坪草種質(zhì)資源進行的聚類對了解它們的背景來源具有一定的參考價值。

3.3 苗期表型性狀與分子標(biāo)記聚類

綜合株高、葉寬、葉色和分蘗數(shù)的考察結(jié)果，本實驗搜集的材料間呈現(xiàn)出明顯的表型差異，比如有些葉寬多分蘗(Z08、Z56、Z57)，有些葉窄植株矮(Z24、Z28、Z29)，有些分蘗少植株矮(Z47、Z59、Z60)，有些則分蘗少植株高(Z64和Z67)……整體而言，國外引進品種多為葉片綠色、葉寬的類型，而野生材料則以葉窄、株型高的居多?？梢愿鶕?jù)這些特征來初步認識區(qū)分一些表型差異較大的材料，當(dāng)然僅憑這些還很難區(qū)分那些表型相似的材料。

將本實驗中涉及的苗期表型性狀與分子標(biāo)記聚類結(jié)果進行比對，兩者無明顯相關(guān)。就葉色看，引進品種/系幾乎都呈綠色或者深綠色，可能是由于國外選育品種時偏愛葉色較深材料所致，而本實驗中涉及的幾個國內(nèi)選育品種/系則無明顯的顏色偏好。梁慧敏[27]曾對狗牙根進行了RAPD聚類分析，發(fā)現(xiàn)各類群中材料在外部形態(tài)上具有一定的相似性。而寧婷婷等[7]研究認為，早熟禾品種間的RAPD聚類關(guān)系與表型特征呈現(xiàn)不完全相關(guān)性。同樣，Roldán-Ruiz等[33]認為多年生黑麥草(Loliumperenne)的形態(tài)特征和分子標(biāo)記之間并不一致。由此可見，表型性狀和分子標(biāo)記聚類結(jié)果常常很難一致。在品種選育時往往會集中在少數(shù)一些重要農(nóng)藝性狀的改良上，而這些性狀往往也正是種質(zhì)資源鑒定時考察的表型特征，因此一些表型相似的材料很可能遺傳背景卻大相徑庭。而且，作物表型性狀的數(shù)量十分有限，所涉及的基因位點極少，因此它們很難反映材料的整體遺傳背景；而分子標(biāo)記的數(shù)量是無限的，特別是將不同類型分子標(biāo)記聯(lián)合使用時，可更準確地反映出材料間的遺傳背景差異。

4 結(jié)論

本研究廣泛搜集了目前國內(nèi)外常見的72份草地早熟禾品種及野生材料，進行了一些重要苗期表型性狀的考察，并利用RAPD分子標(biāo)記對它們進行了聚類分析。主要結(jié)論如下：

1) 本實驗搜集的草地早熟禾材料苗期表型性狀差異明顯，葉色主要為亮綠色和綠色兩類，材料間株高、葉寬、分蘗能力差異顯著。

2) RAPD引物擴增片段在草地早熟禾中表現(xiàn)出很高的多態(tài)性，因此它是篩選多態(tài)性的理想分子標(biāo)記類型。

3) 分子標(biāo)記聚類結(jié)果與材料背景來源具有一定的相關(guān)性，而與苗期表型性狀無相關(guān)性。

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Genetic diversity analysis of Kentucky Bluegrass cultivars by RAPDs

TU Ming-Yue1, LI Jie1, HE Ya-Li2, LI Xing1, LI Jun2, YUAN Xiao-Jun1*

1.SchoolofLifeScience,ShanghaiKeyLaboratoryofBio-EnergyCrops,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China；2.SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China

There are many commercial cultivars and wild germplasms of Kentucky bluegrass (Poapratensis), an important cool-season turfgrass widely cultivated in temperate regions worldwide. In this study, 72 Kentucky bluegrass materials from China and elsewhere were collected and evaluated at the seedling stage by recording plant height, number of tillers, leaf width, and leaf color. All these traits differed significantly among the germplasms. Polymorphic bands were amplified from these germplasms by using random amplified polymorphic DNA (RAPD) primers. A total of 115 polymorphic bands (91%) was generated using 20 RAPD primers. The dendrogram grouped these germplasms into two main clusters. The first cluster contained four domestic varieties (‘KBG04’, ‘KBG03’, ‘Huhe 2’, and ‘Zahe’), while the second cluster contained the other varieties. The second group had a higher genetic similarity coefficient, and was divided into three subgroups: GroupⅠ consisting mainly of imported varieties, and Group Ⅱ and Group Ⅲ with mainly wild germplasms. The clustering analysis based on the RAPDs data was partly consistent with the source of the materials, but there was no correlation with seedling phenotypic traits.

Kentucky bluegrass; RAPD (random amplified polymorphic DNA); genetic diversity; clustering analysis

10.11686/cyxb2016374

2016-10-09；改回日期：2016-12-05

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31502002)和滬農(nóng)科攻字(2013)第1-1號資助。

涂明月(1992-)，女，安徽淮南人，在讀碩士。E-mail：m18817510336@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail：yuanxjforever@163.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

涂明月, 李杰, 何亞麗, 李醒, 李俊, 袁曉君. 利用RAPD標(biāo)記鑒定草地早熟禾種質(zhì)資源的遺傳多樣性. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(7): 71-81.

TU Ming-Yue, LI Jie, HE Ya-Li, LI Xing, LI Jun, YUAN Xiao-Jun. Genetic diversity analysis of Kentucky Bluegrass cultivars by RAPDs. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 71-81.