張麗秀，李巖，李橙，石維，趙歐亞，李成，陳苗苗，王小敏，2，楊志新,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，河北 保定071000；2.河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室，河北 保定071000；3.河北省環(huán)境科學研究院，河北 石家莊050000；4.河北農(nóng)業(yè)大學科學技術研究院，河北 保定 071000)

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牧草和污泥微生物對污泥PAHs修復的貢獻分析研究

張麗秀1，李巖1，李橙3，石維1，趙歐亞1，李成4，陳苗苗4，王小敏1，2，楊志新1,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，河北 保定071000；2.河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室，河北 保定071000；3.河北省環(huán)境科學研究院，河北 石家莊050000；4.河北農(nóng)業(yè)大學科學技術研究院，河北 保定 071000)

本研究以紫花苜蓿和無芒雀麥兩種牧草為研究對象，通過盆栽試驗，開展了牧草和污泥微生物對污泥多環(huán)芳烴(PAHs)修復的貢獻分析研究。結(jié)果表明，污泥盆栽5個月后，與滅菌污泥相比較，不種植牧草處理的污泥微生物對污泥PAHs的去除率達20.52%，且對不同環(huán)數(shù)的去除率表現(xiàn)為6環(huán)≈4環(huán)≈3環(huán)>5環(huán)≈2環(huán)。牧草-污泥微生物聯(lián)合作用對16種PAHs總量的去除率可達83.74%(苜蓿)和78.73%(雀麥)，比污泥微生物單一作用平均提高了2.96倍，且對6環(huán)PAHs的去除效果表現(xiàn)最突出?？鄢勰辔⑸飳AHs的去除率后，苜蓿和無芒雀麥對污泥PAHs的去除率分別為63.22%、58.21%，比牧草-污泥微生物聯(lián)合作用平均降低了33.90%，對不同環(huán)數(shù)的去除率表現(xiàn)為5環(huán)PAHs效果最明顯。進一步分析牧草和污泥微生物對PAHs修復的貢獻可知，牧草因直接吸收去除PAHs的貢獻率平均為1.35%，污泥微生物單一作用的貢獻率為24.67%，其他可能因牧草-污泥微生物的交互作用、牧草的蒸騰作用及根系分泌物的作用等共同去除的貢獻率為79.46%。同時，污泥堿性磷酸酶活性大小順序呈現(xiàn)出了未滅菌污泥+苜蓿處理(J+M)≈未滅菌污泥+雀麥處理(J+W)>未滅菌污泥處理(J)>滅菌污泥處理(CK)(P<0.05)的結(jié)論，與PAHs降解規(guī)律表現(xiàn)一致。綜上，在牧草和污泥微生物聯(lián)合修復污泥PAHs的過程中，除了污泥微生物和牧草的單一作用外，牧草-污泥微生物的交互作用、蒸騰等共同作用對去除的貢獻占據(jù)了較大優(yōu)勢。

污泥；牧草；污泥微生物；PAHs；貢獻率

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類普遍存在于環(huán)境中的、由兩個或兩個以上芳香環(huán)稠合在一起的持久性有機污染物[1]。它具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變的“三致”作用[2]，被美國環(huán)保署(United States Environmental Protection Agency, USEPA)列為優(yōu)先控制污染物。多環(huán)芳烴是城市污泥中常見的一類有機污染物，PAHs含量較高的城市污泥若利用在農(nóng)業(yè)上可能會導致土壤和作物的污染[3]，并通過生物富集進入食物鏈，最終危及人類健康[4]。He等[5]的研究表明，隨著污泥量的增多，土壤中多環(huán)芳烴的含量也增多，并能通過作物吸收進入麥粒中，進而威脅人類健康。

然而長期以來，我國對PAHs的報道主要側(cè)重于土壤，關于污泥樣品中PAHs的修復研究相對較少[6]，主要集中在城市污泥多環(huán)芳烴的分布特征及其含量方面研究[7-9]，或是青睞于污泥堆肥過程中多環(huán)芳烴的降解轉(zhuǎn)化研究[10-11]。許多學者以多環(huán)芳烴污染土壤為介質(zhì)利用牧草修復的研究較多，并表明修復效果明顯[12-13]。前期本課題組以多環(huán)芳烴污染污泥為介質(zhì)利用紫花苜蓿(Medicagosativa) 和無芒雀麥(Bromusinermis)進行修復也同樣取得了較為理想的結(jié)果[14-15]，PAHs總量修復效率為77.2%～85.0%。但在前期的修復效果研究中，基本是在未滅菌的污泥環(huán)境條件下進行的，研究結(jié)果尚不能判斷牧草、微生物或者兩者的共同作用對如此高的修復效率到底有多大貢獻，為了進一步探明污泥微生物及牧草對PAHs降解率的貢獻，本研究選擇紫花苜蓿和無芒雀麥兩種牧草，通過室內(nèi)盆栽試驗，開展牧草和污泥微生物對污泥多環(huán)芳烴的修復效果及貢獻分析，為探討污泥多環(huán)芳烴的修復提供理論依據(jù)和技術支持，也為污泥農(nóng)用資源化提供安全保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗污泥：取自保定市污水處理廠，陰干，平衡一周，過3 mm篩，待用。其基礎化學性質(zhì)如下：pH 7.36，有機質(zhì)含量51.30 g/kg，全氮含量23.47 g/kg，速效磷含量0.699 g/kg，速效鉀含量3.863 g/kg。其中，污泥16種PAHs含量為4.388 mg/kg。

試驗牧草：紫花苜蓿和無芒雀麥種子購于北京正道生態(tài)科技有限公司，為國產(chǎn)雜交品種。

試驗盆缽：型號為15 cm×10 cm×12 cm(盆口直徑×盆底直徑×盆高)。

1.2 試驗方案

盆栽試驗于河北農(nóng)業(yè)大學光照室進行(試驗布置時間2014年5月，收獲時間2014年10月)，試驗處理詳見表1，共4個處理，每個處理3個重復，共12盆。每盆裝入1.5 kg污泥，種子經(jīng)催芽后定量播于盆缽中，出芽15 d，每盆留苗10株。土壤水分維持在田間持水量的60%，溫室內(nèi)的溫度日間為20～23 ℃，夜間為17～18 ℃，光照強度為400～7300 lx。每2 d隨機交換盆缽在溫室中的位置以保證光照一致。

1.3 樣品采集與制備

牧草樣品：試驗盆栽種植5個月后，收獲牧草，并清洗干凈，拭干后稱重，放入密封袋中冷藏待測。

表1 污泥盆栽試驗方案Table 1 Pot experiment design scheme

污泥樣品：牧草收獲后，將盆缽中污泥混合均勻，過1 mm篩，通過四分法取樣，一部分污泥樣品于蔭涼處自然風干，測定酶活性指標；另一部分污泥樣品冷凍，測定16種多環(huán)芳烴含量。

1.4 測定指標及方法

污泥基本理化性質(zhì)：pH、有機質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀，均采用土壤農(nóng)化常規(guī)分析法[16]。

16種PAHs測定：污泥樣品采用索氏提取[17]，經(jīng)凈化、濃縮、定容，最后用GC-MS測定；植株樣品經(jīng)超聲萃取[14]，硅膠柱凈化，濃縮等，最后用GC-MS測定[18]。

酶活性測定[19-20]：多酚氧化酶活性測定采用紫色沒食子素比色法，其活性以2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的mg數(shù)表示；脲酶活性采用靛酚藍比色法，其活性以24 h后1 g土壤中NH4+-N的mg數(shù)表示；堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法，其活性以24 h后1 g土壤中釋放出酚的mg數(shù)表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

污泥中PAHs的去除率(Rs)=(C0-Ct)/C0×100%

(1)

式中：C0為滅菌污泥中PAHs的含量，Ct為不同處理污泥中PAHs的殘留含量。

牧草吸收PAHs的貢獻率=牧草吸收PAHs總量(kg/盆)/污泥PAHs去除總量(kg/盆)×100%

(2)

污泥微生物去除PAHs的貢獻率=污泥微生物去除PAHs總量(kg/盆)/

污泥PAHs去除總量(kg/盆)×100%

(3)

采用Excel和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牧草—污泥微生物聯(lián)合作用對污泥PAHs的修復效果分析

牧草-微生物對污泥中PAHs總量及不同環(huán)數(shù)的去除率如圖1和圖2所示。由圖1可以看出，苜蓿-微生物聯(lián)合作用對污泥中PAHs總量的去除率高達83.74%。從兩者聯(lián)合作用對不同環(huán)數(shù)PAHs的降解效果來看，其去除率表現(xiàn)為：6環(huán)>4環(huán)>3環(huán)≈5環(huán)>2環(huán)，6環(huán)最高可達90.40%，顯著高于其他環(huán)數(shù)的去除率。

由圖2可以看出，無芒雀麥-微生物聯(lián)合作用對污泥PAHs總量的去除率高達78.73%。從兩者聯(lián)合作用對不同環(huán)數(shù)PAHs的降解效果來看，對6環(huán)PAHs的降解效果表現(xiàn)最為突出，高達84.69%，分別比2環(huán)、3環(huán)、4環(huán)、5環(huán)PAHs提高了70.11%、7.61%、5.25%和16.33%。

2.2 污泥微生物單一作用對污泥PAHs的修復效果及貢獻分析

2.2.1 污泥微生物單一作用對污泥PAHs修復效果分析 未滅菌污泥處理5個月后，以滅菌污泥為對照，計算了污泥微生物對PAHs總量及不同環(huán)數(shù)的去除率，如圖3所示。由圖3可知，J處理對盆栽污泥PAHs總量有一定的降解效果，其去除率為20.52%，說明了污泥中有降解PAHs的功能菌存在。

圖1 苜蓿-微生物聯(lián)合對污泥PAHs總量及 不同環(huán)數(shù)的去除率Fig.1 The removal rate of total PAHs and different rings PAHs by alfalfa-sludge microbial in contaminated sludge

圖2 雀麥-微生物聯(lián)合對污泥PAHs總量及 不同環(huán)數(shù)的去除率Fig.2 The removal rate of total PAHs and different rings PAHs by smooth brome-sludge microbial in contaminated sludge

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。 Data are expressed as mean±SD in the graphs, different letters show that differences are significant atP<0.05. The same below.

對于不同環(huán)數(shù)PAHs來說， 污泥微生物對3環(huán)、4環(huán)、5環(huán)、6環(huán)多環(huán)芳烴均有不同程度的降解作用。經(jīng)檢驗，3環(huán)、4環(huán)、6環(huán)多環(huán)芳烴的去除率顯著高于2環(huán)和5環(huán)多環(huán)芳烴，6環(huán)表現(xiàn)最高，達28.82%，但污泥微生物對3環(huán)、4環(huán)、6環(huán)多環(huán)芳烴的去除率之間差異不顯著，其去除率順序為6環(huán)≈4環(huán)≈3環(huán)>5環(huán)≈2環(huán)。

圖3 污泥微生物對污泥PAHs總量及不同環(huán)數(shù)的去除率Fig.3 The removal rate of total PAHs and different rings PAHs by sludge microbial in contaminated sludge

2.2.2 污泥微生物單一作用對污泥PAHs修復的貢獻分析 以牧草-微生物聯(lián)合作用去除污泥PAHs為基礎，利用式3計算了污泥微生物對污泥PAHs修復的貢獻率。結(jié)果表明，種植苜蓿處理(J+M)下，污泥微生物單一作用的貢獻率為24.51%；種植雀麥處理(J+W)下，污泥微生物單一作用的貢獻率為26.07%。2.3 牧草作用對污泥PAHs的修復效果及貢獻分析

2.3.1 牧草作用對污泥PAHs修復效果分析 利用牧草-污泥微生物聯(lián)合去除率扣除污泥微生物去除率，計算了牧草作用對污泥PAHs的去除率，見圖4和圖5。苜蓿對盆栽污泥PAHs總量的去除率為63.22%，其中，對2環(huán)、3環(huán)、4環(huán)、5環(huán)、6環(huán)多環(huán)芳烴的去除率分別為61.34%、59.37%、62.03%、70.86%、61.57% 。雀麥對盆栽污泥PAHs總量的去除率為58.21%，其中，對2環(huán)、3環(huán)、4環(huán)、5環(huán)、6環(huán)多環(huán)芳烴的去除率分別為49.79%、56.49%、57.33%、64.33%、55.87%，可見，兩種牧草對5環(huán)多環(huán)芳烴的去除效果均表現(xiàn)突出。

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，通過高溫滅菌使污泥改變了基本物理性狀，致使滅菌污泥處理種植牧草無法成活，因此，本研究牧草作用對污泥PAHs去除率由牧草-污泥微生物聯(lián)合去除率與污泥微生物去除率的差值計算所得。但牧草作用的去除率不僅包含了牧草的單一作用，而且還包含了牧草-污泥微生物的交互作用、根系分泌物的作用以及蒸騰等綜合因素的影響。

2.3.2 牧草作用對污泥PAHs修復的貢獻分析 牧草對PAHs修復的貢獻主要受牧草吸收、根系分泌物的作用、蒸騰及與污泥微生物的交互作用等因素所影響。本研究已證實苜蓿作用對盆栽污泥PAHs總量的去除率達63.22%，雀麥的去除率為58.21%。經(jīng)計算，苜蓿直接吸收帶走PAHs的貢獻率占1.13%，雀麥的貢獻率為1.58%，而由牧草-污泥微生物交互作用、蒸騰等其他方式去除PAHs的貢獻率約高達73.35%。

圖4 苜蓿作用對污泥PAHs總量及不同環(huán)數(shù)的去除率Fig.4 The removal rate of total PAHs and different rings PAHs by alfalfa in contaminated sludge

圖5 雀麥作用對污泥PAHs總量及不同環(huán)數(shù)的去除率Fig.5 The removal rate of total PAHs and different rings PAHs by smooth brome in contaminated sludge

2.4 污泥16種PAHs去除效果的酶活性分析

盆栽試驗5個月后，測定了污泥中堿性磷酸酶、脲酶和多酚氧化酶活性，不同處理下酶活性結(jié)果如表2。J+M和J+W處理下的堿性磷酸酶活性比CK及J處理均有顯著提高，與上述結(jié)果的去除率規(guī)律相一致，這說明了堿性磷酸酶可能參與了降解PAHs的過程。而脲酶活性卻與PAHs的降解規(guī)律恰好相反，多酚氧化酶活性未表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律。

3 討論

本研究結(jié)果表明，兩種牧草-污泥微生物聯(lián)合作用的去除率平均為 81.24%，其中污泥微生物對多環(huán)芳烴總量的去除率達20.52%，聯(lián)合作用的去除率顯著高于二者單一作用。其原因可能與牧草根系發(fā)達、根際微生物豐富的特點有關[21-22]，或與植物分泌的根際物促進微生物群落生長、增加微生物活性有關[23]。目前國內(nèi)外以污泥作為介質(zhì)開展牧草-微生物聯(lián)合修復污泥多環(huán)芳烴的研究較少，在文獻中僅發(fā)現(xiàn)了本課題組的研究成果[14-15]，而以土壤作為介質(zhì)開展牧草-微生物聯(lián)合修復多環(huán)芳烴污染的研究較多[24-25]，均表現(xiàn)出了較好的修復效果，本研究結(jié)果與此相符合。

表2 不同處理下土壤酶活性測定結(jié)果Table 2 The soil enzymatic activities in different treatments

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Within each column, values followed by the different letters are significantly different (P<0.05).

本研究結(jié)果認為，牧草、污泥微生物以及二者聯(lián)合作用對6環(huán)芳烴的降解效果與其他環(huán)數(shù)相比表現(xiàn)突出，該結(jié)果與趙歐亞[17]得出的鐮刀菌對污染土壤6環(huán)芳烴的去除率顯著高于5環(huán)芳烴去除率的結(jié)論相一致。其原因可能是污泥中存在高環(huán)芳烴專性降解菌株，對6環(huán)芳烴具有獨特的降解能力。 Ma等[26]和Wang等[27]從污泥中篩選出多環(huán)芳烴降解菌，本研究污泥微生物對多環(huán)芳烴的降解作用恰好證實了該結(jié)果。而目前關于微生物對高環(huán)芳烴的降解途徑和代謝產(chǎn)物研究至今還未探明[28]。Cao 等[29]的研究表明高環(huán)芳烴在開環(huán)裂解過程中可能形成兒茶酚類或其他中間體從而被降解，并沒有檢索到有關于高環(huán)芳烴降解轉(zhuǎn)化為低環(huán)芳烴的任何報道，因此在高環(huán)芳烴降解過程中是否會對其他環(huán)數(shù)的降解有影響還有待于進一步深入研究。

本研究中牧草因直接吸收去除的PAHs占有較小的比例，僅1%左右。造成牧草直接吸收貢獻率低的原因可能是植物被動吸收有機污染物的過程受到污染物的性質(zhì)、土壤類型及植物種類等因素的影響[30]。而對于植物蒸騰等其他途徑去除PAHs貢獻率的研究未見報道，因此有待于進一步驗證。

4 結(jié)論

1)從修復效果看，兩種牧草-污泥微生物聯(lián)合作用的去除率平均為81.24%，比污泥微生物單一作用平均提高了2.96倍，比牧草作用提高了33.9%，且對6環(huán)芳烴的去除效果表現(xiàn)突出。

2)從貢獻率看，牧草因直接吸收去除PAHs的貢獻率平均為1.35%，污泥微生物單一作用的貢獻率為24.67%，其他可能因牧草-污泥微生物的交互作用、牧草的蒸騰作用及根系分泌物的作用等共同去除的貢獻率為79.46%。

3)從酶活性看，牧草-污泥微生物聯(lián)合作用處理下的堿性磷酸酶活性均比對照與污泥微生物單一作用有顯著提高，與去除率規(guī)律相一致，說明了堿性磷酸酶可能參與了降解PAHs的過程。

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Contribution of herbage and sludge-microbes to remediation of polycyclic aromatic hydrocarbons

ZHANG Li-Xiu1, LI Yan1, LI Cheng3, SHI Wei1, ZHAO Ou-Ya1, LI Cheng4, CHEN Miao-Miao4, WANG Xiao-Min1,2, YANG Zhi-Xin1,2*

1.CollegeofResourcesandEnvironmentScience,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China; 2.KeyLaboratoryforFarmlandEco-environmentofHebei,Baoding071000,China; 3.HebeiProvincialAcademyofEnvironmentalSciences,Shijiazhuang050000,China; 4.AcademyofScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China

A pot experiment was conducted to investigate the contribution of alfalfa (Medicagosativa), smooth brome (Bromusinermis), and sludge microbes to the remediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). After 5 months, the total removal rate of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by sludge microbes was 20.52% in the absence of forage grass, and the removal rate of PAHs with different rings was as follows: six rings≈four rings≈three rings>five rings≈two rings. The total removal rate of PAHs by grass-sludge microbes was 83.74% (alfalfa) and 78.73% (smoothbrome). Therefore, the addition of a grass significantly increased the average PAH removal rate by almost three times compared with that of sludge microbes alone. The highest degradation rate was for the six-ring PAHs. In the absence of sludge microbes, the degradation rate of PAHs by alfalfa and smoothbrome was 63.22% and 58.21%, respectively (on average, 33.90% less than that of the grass-sludge microbes combination).The grasses showed the highest PAH removal rate for five-ring PAHs. Further analyses of the contribution rates of grass and sludge microbes to PAH degradation showed that 1.35% of PAHs was removed by direct absorption, 24.67% by microbes, and 79.46% through grass-sludge microbial interactions, transpiration, and the effects of root secretions. The treatments were ranked from highest sludge alkaline phosphatase activity to lowest as follows: non-sterilized sludge+alfalfa treatment (J+M)≈non-sterilized sludge+smooth brome treatment (J+W)>non-sterilized sludge treatment (J)>sterilized sludge treatment (CK) (P<0.05), consistent with the order of the treatments based on PAHs degradation. In conclusion, the use of grass and sludge microbes was more effective for removing PAHs from contaminated sludge than either grass or sludge microbes alone. The combined action of grass and microbes removed PAHs as a result of their interactions and transpiration.

sludge; herbage; sludge microbial; PAHs; contribution rate

10.11686/cyxb2016508

2016-12-30；改回日期：2017-03-22

河北省高層次人才資助項目(留學人員科技活動項目擇優(yōu)資助，2013-2016)和河北省教育廳項目(Z2013058)資助。

張麗秀(1992-)，女，河北唐山人，在讀碩士。 Email：2457116753@qq.com

*通信作者Corresponding author. Email：yangzhixin@126.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

張麗秀, 李巖, 李橙, 石維, 趙歐亞, 李成, 陳苗苗, 王小敏, 楊志新. 牧草和污泥微生物對污泥PAHs修復的貢獻分析研究. 草業(yè)學報, 2017, 26(7): 232-238.

ZHANG Li-Xiu, LI Yan, LI Cheng, SHI Wei, ZHAO Ou-Ya, LI Cheng, CHEN Miao-Miao, WANG Xiao-Min, YANG Zhi-Xin. Contribution of herbage and sludge-microbes to remediation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 232-238.