穆維新 王耀賢 閆立曼

·論著·

2型糖尿病合并肺癌瘤組織中COX-2的表達及意義

穆維新 王耀賢 閆立曼

目的 通過檢測COX-2在2型糖尿病合并肺癌癌組織與單純肺癌癌組織中的表達，探討其在2型糖尿病合并肺癌癌組織發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。方法 收集2型糖尿病合并肺癌(試驗組)與單純肺癌(對照組)2組手術(shù)切除的癌組織病理石蠟切片各50例。采用免疫組化的方法檢測COX-2在2組癌組織中的表達差異。結(jié)果 2型糖尿病合并肺癌及單純肺癌瘤組織中COX-2的表達積分光密度值分別為173.6±11.5，125.4±10.9,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 2型糖尿病合并肺癌癌組織中COX-2表達升高，可能是2型糖尿病合并肺癌愈后差的原因之一。

2型糖尿病合并肺癌;單純肺癌;免疫組化;COX-2

惡性腫瘤和2型糖尿病在世界范圍內(nèi)成為主要兩大慢性非傳染性疾病，是常見病、多發(fā)病及終生性疾病，惡性腫瘤中肺癌成為當(dāng)今發(fā)病率及病死率增長最快的疾病，是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。迄今，肺癌是最主要的腫瘤相關(guān)性死因之一，隨著對肺癌發(fā)病機制的不斷深入研究，在肺癌的診斷及治療方面取得了一些成果，但是肺癌的5年生存率和患者的生活質(zhì)量仍然沒有大的提高，在今天的我國，肺癌的患病率及病死率已升至惡性腫瘤之冠[1]，在肺癌病理分型中，以非小細胞肺癌(NSCLC)為多見，因此也是當(dāng)前研究的熱點。當(dāng)前，研究者急需解決的難題是怎樣提高肺癌的診治水平，改善患者的生存率及生活質(zhì)量。同樣，糖尿病隨著人民生活的改善，膳食傳統(tǒng)模式的改變，尤其是攝入高脂肪、高糖類、高蛋白類、高熱量的食物等，糖尿病也成了多發(fā)病及常見病。其中2型糖尿病占據(jù)本病群體95%。近年來研究認為2型糖尿病患者并發(fā)惡性腫瘤的危險性增加，發(fā)病率比正常人群高達兩倍甚至還多[2,3]。2型糖尿病合并惡性腫瘤病人多在中晚期，且愈后較差[4]。其中，肺癌發(fā)病率在2型糖尿病并發(fā)惡性腫瘤中位居前三位[5]。流行病學(xué)調(diào)查顯示2型糖尿病和肺癌有許多共同的危險因素，比如吸煙、老年、環(huán)境因素、生活方式等等，另外2型糖尿病造成的代謝免疫功能紊亂、高血糖、肺損傷、肺部感染、高胰島素血癥等均可能增加肺癌的危險度，但具體原因不詳，國內(nèi)外研究較多。從動物實驗研究認為炎性因子環(huán)氧合酶-2(COX-2)參與了2型糖尿病大鼠的肺炎性損傷，一些研究證明人類的非小細胞肺癌中COX-2表達水平增高[6]，是否參與了2型糖尿病并發(fā)肺癌的發(fā)生發(fā)展并導(dǎo)致愈后差未見報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2004年1月至2014年1月所有臨床資料比較完整的肺癌標(biāo)本石蠟包埋癌組織，所有病例均外科手術(shù)或其他方式病理檢查證實為肺癌，其中共計10 618例，其中單純肺癌10 012例，2型糖尿病合并肺癌575例。我們選取2014年2型糖尿病合并肺癌(試驗組，選取病例均為腺癌)與單純肺癌(對照組，選取病例均為腺癌)患者100例。其中試驗組男28例，女22例；年齡39～76歲，平均年齡56.20歲；其病程2型糖尿病均在2年以上，其中Ⅰ期5例，Ⅱ期35例，Ⅲ10例，以上病例均無合并其他疾病。對照組男31例，女19例;年齡43～78歲，平均年齡58.40歲，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期33例，Ⅲ11例，以上病例均無合并其他疾病。2組手術(shù)切除的癌組織病理石蠟切片各50例，做免疫組化檢測COX-2的表達。2組一般資料具有可比性。

1.2 2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn) 肺癌臨床分期按照國際TNM標(biāo)準(zhǔn) (UICC 2009)。2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)按照1999年世界衛(wèi)生組織發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)。滿足下面條件任意一項：(1)有糖尿病癥狀+任意時間血漿葡萄糖濃度≥11.1 mmol/L；(2)空腹血漿葡萄糖濃度≥7.0 mmol/L； (3)餐后2 h血糖濃度≥11.1 mmol/L。

1.3 試劑及儀器設(shè)備

1.3.1 試劑:兔抗人COX-2多克隆抗體(Santa Cruz公司);鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司);PBS緩沖液等(福州邁新生物技術(shù)公司)。

1.3.2 儀器設(shè)備:顯微鏡：日本奧林巴斯IX71熒光倒置顯微鏡;CCD:Discovery C15;IS Capture成像軟件采集系統(tǒng);切片機：德國萊卡RM2015;離心機：北京離心機廠LDZ5-2型;電子天平：瑞士METTER AE100型;移液器：德國EPPENDORF;干燥箱：日本三洋MIR-153型;低溫冰箱：日本三洋MDF-382E型;恒溫水浴箱：江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型;醫(yī)用微波爐：浙江臨安愛迪儀器廠YWY781B型。

1.4 免疫組化方法

1.4.2 顯微鏡觀察：選擇試驗組和對照組的陽性和陰性組織相、進行200×和400×的顯微照相。

1.4 3 圖像分析：計算機圖像處理系統(tǒng)由CMOS(日本OLYMPUS公司)及專用軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus)組成。依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖像灰度選擇合適的灰度分割閾值，實現(xiàn)雙閾值分割,得到樣品的半灰度目標(biāo)圖像，以人機交互方式測定陽性免疫染色強度及面積。每組取50例，每例測5個視野。由計算機計算出所測陽性反應(yīng)物相對含量的灰度值及面積。選擇有意義的組織相，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤。

2 結(jié)果

2.1 COX-2陽性染色 其主要定位在核膜，位于肺癌癌細胞的胞漿中，胞漿呈棕黃色彌漫性分布。2型糖尿病合并肺癌組較單純肺癌組棕黃色顆粒比較粗大。試驗組隨著患者TNM分期的增加，棕黃色顆粒染色更加深染，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期免疫染色強度及面積積分光密度值分別為(162.4±8.9)，(171.3±9.6)，(180.4±10.3)。對照組同樣隨著TNM分期不同，棕黃色顆粒染色變化隨分期增加而加深，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期免疫染色強度及面積積分光密度值分別為(119.6±7.9)，(121.8±10.5)，(128.7±11.5)，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖1、2。

TNM分期試驗組例數(shù)光密度值對照組例數(shù)光密度值Ⅰ5162.4±8.96119.6±7.9Ⅱ35171.3±9.633121.8±10.5Ⅲ10180.4±10.311128.7±11.5

圖1 試驗組HE染色(×200)圖2 對照組HE染色(×200)

2.2 免疫熒光染色成綠色 經(jīng)測定陽性免疫染色強度及面積，COX-2積分光密度值試驗組與對照組分別為(173.6±11.5)，(125.4±10.9),試驗組表達COX-2明顯高于對照組，且隨著分期的增加，其表達的積分光密度值有增加，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2，圖3、4。

項目試驗組對照組光密度值173.6±11.5125.4±10.9

圖3 試驗組免疫熒光 染色(×200)圖4 對照組免疫熒光 染色(×200)

3 討論

肺癌是美國最常見的惡性腫瘤之一，在男性和女性中均為腫瘤死亡的首要原因，在美國每年死亡人數(shù)超過乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和胰腺癌的總和[7]。在世界范圍內(nèi)，肺癌同樣是腫瘤死亡的首要原因，估計每年有150萬人死于肺癌[8]。糖尿病跟癌癥同樣是快速增長的慢性非傳染性疾病之一，隨著糖尿病發(fā)病率的快速增加，其并發(fā)癥的研究越來越廣泛越來越深入，國內(nèi)外關(guān)于糖尿病合并肺癌的流行病學(xué)研究認為2型糖尿病增加肺癌的風(fēng)險，且發(fā)現(xiàn)時多為中晚期[4]，具體發(fā)病機制不詳。腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移是在宿主反應(yīng)的情況下進行的，越來越多的證據(jù)證明腫瘤生成的炎性反應(yīng)在機體免疫系統(tǒng)與惡性腫瘤相互作用中起了重要作用。雖然基因的改變在正常機體細胞轉(zhuǎn)化成惡性腫瘤細胞的過程中特別重要，但是惡性腫瘤微環(huán)境中的炎性反應(yīng)在惡性腫瘤發(fā)展到轉(zhuǎn)移癌的過程中也是非常重要，所以炎性反應(yīng)、宿主的免疫系統(tǒng)及惡性腫瘤之間的關(guān)系越來越廣泛的被大家所接受[9]。

惡性腫瘤與炎癥/免疫系統(tǒng)之間的作用通過免疫監(jiān)視、免疫編輯、腫瘤形成中宿主機體細胞網(wǎng)絡(luò)的共同調(diào)控、腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制等方面交互作用的。其中炎性因子環(huán)氧化酶(COX)起重要作用，COX也稱前列腺素內(nèi)過氧化酶或是前列腺素G氫化氧化物，具有脂肪酸環(huán)氧合酶及前列腺素(PG)氫過氧化物酶兩種活性，COX有三種形式，其中COX-1分布在多數(shù)機體細胞和組織中,它能夠促使花生四烯酸(AA)生成前列腺素(PG)，其在體內(nèi)起著抑制胃酸分泌以保護胃黏膜和維持腎臟血流的作用。其活性完全依賴于底物，而COX-2是一種誘導(dǎo)型的同工酶， COX-2是由花生四烯酸合成前列腺素和血栓烷素的限速酶，是一種雙功能酶，正常人機體內(nèi)幾乎不能檢測到，僅僅在當(dāng)人體機體細胞受到刺激因素如外傷、感染、生長因子、促癌劑、細胞因子等刺激后開始迅速合成，在靜息狀態(tài)下并不表達，可參與包括腫瘤在內(nèi)的多種生理病理過程[10]。COX-2長約8.3 kb，是由10個外顯子及 9個內(nèi)含子構(gòu)成，其位于第1號染色體的 q25.2～q25.3， 其中 5′端含有 CpG 島，內(nèi)有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，可編碼 604個氨基酸，COX-2主要定位在細胞核膜上，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)側(cè)和細胞膜上。在病理情況下，可能參與炎癥、疼痛、發(fā)熱及腫瘤的形成，COX-3被認為是保留了內(nèi)含子和突變因子的COX-1遺傳變異體，因此又稱COX-1B。所有COX的存在形式也就是亞型在結(jié)構(gòu)特征上是相似的，它們有一個疏水性的通道，這個通道可以使花生四烯酸帶著發(fā)夾構(gòu)型進入COX的催化區(qū)域。當(dāng)機體受刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生COX-2后，使AA大量轉(zhuǎn)變?yōu)镻G和血栓素，促進白三烯及羧基環(huán)氧素等炎性介質(zhì)產(chǎn)生，引起嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，同時吸引大量炎性細胞及因子共同發(fā)生炎性反應(yīng)，在臨床中使用的非甾體抗炎藥正是抑制COX-2的活性降低PG的合成發(fā)揮抗炎作用。國內(nèi)外相關(guān)研究認為患者長期使用非甾體抗炎藥物，胃腸道腫瘤相對危險度為0.57，也就是用藥后胃腸道腫瘤的發(fā)生率下降了43%，同時還發(fā)現(xiàn)使用超過5年患者其胃腸道腫瘤患病的相對危險度為0.21，并得出服用年限與腫瘤發(fā)生危險度呈負相關(guān)關(guān)系[11]。據(jù)上述報道，非甾體抗炎藥是否能明確降低癌癥的發(fā)生率及其機制備受關(guān)注。國外一些學(xué)者研究證明人類非小細胞癌(NSCLC)中組成性環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達水平增高[12]，在肺癌形成過程中有重要作用。Khuri等用原位雜交的方法檢測了160例NSCLCI期患者的標(biāo)本中COX-2的表達，并觀察到了COX-2過表達預(yù)示了患者更短的生存期，COX-2高表達降低了總生存率并且減少了無瘤生存率[13]。Tsubochi等[12]研究在Ⅰ期肺腺癌患者中COX-2的表達和預(yù)后不良相關(guān)。另外有研究顯示在癌前病變中COX-2表達增加[14]。COX-2在腫瘤形成的機制可能是：(1)通過增加腫瘤組織血管生成,炎性反應(yīng)和酪氨酸激酶受體通路構(gòu)成了由許多對惡性表型有貢獻的調(diào)節(jié)因子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。其中COX-2和表皮生長因子受體(EGFR)的交互信號是這些通路中被研究最深入之一。研究認為COX-2和EGFR可以相互作用來調(diào)控細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及入侵[15],這引起了研究者使用COX-2和EGFR抑制劑聯(lián)合治療NSCLC的興趣，EGFR抑制劑可以減少血管生成因子比如白介素-8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，這也是COX-2抑制劑抑制血管生成的機制之一[16]。Toamey等[17]研究報道COX-2可能通過產(chǎn)生降解細胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白誘導(dǎo)新生血管的生成。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM的一種酶，其可促進腫瘤細胞向周圍浸潤，并可幫助內(nèi)皮細胞向遠處遷移，增強腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力，當(dāng)COX-2轉(zhuǎn)錄受抑制時，MMP-7基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯也受到限制，這樣，COX-2通過上調(diào)MMP-7的表達降解ECM。(2)增強侵襲力，在COX-2代謝產(chǎn)物中前列腺素E2(PGE2)在腫瘤微環(huán)境中廣泛大量存在，是一個重要的調(diào)控免疫因子，同時也調(diào)控著內(nèi)皮細胞的生長、浸潤和上皮細胞的存活[15]。前列腺受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)超家族，是通過EP1、EP2、EP3、EP4這4個GPCR發(fā)揮多種作用，PGE2通過EP4受體的信號通路在介導(dǎo)NSCLC的浸潤，且抑制腫瘤COX-2可以降低MMP-2、CD44和EP4受體的表達和浸潤，提示PGE2在NSCLC患者中通過EP受體信號通路調(diào)控COX-2依賴的、CD44和MMP-2介導(dǎo)的浸潤[18]。(3)降低宿主免疫力，在肺癌及其他惡性腫瘤中，腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制是公認的，以前的研究證實在NSCLC中腫瘤細胞過表達COX-2是導(dǎo)致肺癌免疫抑制網(wǎng)絡(luò)的原因，在一些惡性腫瘤中COX-2的同工酶活性在惡性腫瘤組織中較其正常組織明顯增高，且在肺癌中COX-2同樣會過表達[19]。在肺癌小鼠模型，特異基因或藥物抑制COX-2可以明顯的縮小腫瘤的大小。(4)促進腫瘤細胞增殖及抗凋亡等方式參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展,Thiel等[20]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，COX-2能夠延長細胞周期的G1期，其能通過降低細胞周期蛋白含量從而抑制細胞凋亡，并增加正常細胞發(fā)生突變的幾率。

我們的本課題的研究證明了2型糖尿病合并肺癌患者的COX-2比單純肺癌組患者有更高的表達，并且發(fā)現(xiàn)腫瘤TNM分期級別越高，其表達越高，可能是2型糖尿病合并肺癌患者預(yù)后更差的原因之一。一些研究顯示在肺癌的前期病灶COX-2表達增高，于是許多學(xué)者開始研究著眼COX-2抑制劑在化學(xué)預(yù)防方面可能存在的治療作用。Mao等[21]學(xué)者通過口服6個月的塞來昔布(celecoxib)給予重度吸煙者，進行肺泡灌洗液和活檢等支氣管檢查，結(jié)果顯示了應(yīng)用該藥作為預(yù)防用藥的可行性。最新研究Sung等[22]研究人員通過MTT實驗檢測藥物處理腫瘤的敏感性，采用二乙酸二氯熒光素測量活性氧的產(chǎn)生，該研究顯示celecoxib聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶可能增強抗鱗狀細胞癌的療效。并且認為這種聯(lián)合治療的可能主要機制是阻斷AKT通路產(chǎn)生活性氧增強抗癌療效。更大的以安慰劑作為對照組的隨機臨床研究也在進行中，以檢測COX-2抑制劑在肺癌預(yù)防中的療效[21]。國內(nèi)學(xué)者王玲嬋等[23]通過將肺腺癌A549細胞接種BALB/c雄性裸鼠右側(cè)腋部皮下組織，建立了移植瘤動物模型，研究探討了COX-2抑制劑艾瑞昔布是否能抑制轉(zhuǎn)移瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾瑞昔布能抑制非小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，他們研究作用機制可能與上調(diào)PTEN蛋白和下調(diào)cortactin蛋白的表達有關(guān)。應(yīng)用COX-2抑制劑是否能改善2型糖尿病合并肺癌患者的預(yù)后，尚待我們以后進一步研究。

1 Alharbi KK.Clinical efficacy and possible applications of genomics in lung cancer.Asian Pac J Cancer Prev,2015,16:1693-1698.

2 Hemminki K，Li X，Sundquist J，et al．Risk of cancer following hospitalization for type 2 diabetes．Oncologist，2010，15：548-555．

3 Zhan YS，F(xiàn)eng L，Tang SH，et al．Glucose metabolism disorders in cancer patients in a Chinese population． Med Oncol，2010，27：177-184．

4 Ellis LM,Hicklin DJ.VEGF-targeted therapy:methanisms of antitumour activity.Nat Rev Cancer,2008,8:579-591.

5 滕家安，秦儉梁，王仁生，等.老年2型糖尿病合并惡性腫瘤252例臨床分析.中國老年學(xué)雜志，2008,10:2007-2009.

6 Tsuochi HN,Sato M,Hiyama M,et al.Combined analysis of cyclooxygenase-2 expression with p53 and Ki-67 in nonsmall cell lung cancer.Ann Thorac Surg,2006,82:1198-1204.

7 Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics.CA Cancer J Clin,2009,59:225-249.

8 Youlden DR, Cramb SM,Baade PD.The international epidemiology of lung cancer:geographical distribution and secular trends.J Thorac Oncol,2008,3:819-831.

9 DeNardo DG,Johansson M,Coussens LM.Immune cells as mediators of solid tumor metastasis.Cancer Metastasis Rev,2008,27:11-18.

10 陳昕晟，陳真.環(huán)氧化酶-2與肝纖維化的關(guān)系研究.安徽醫(yī)藥，2013，7：1081-1082.

11 Rothwell PM,Wilson M，Elwin CE，et al．Long term effect of aspinin on colorectal cancer incidence and mortality,20-year follow-up offive randomized trials．Lancet,2010,376：1741-1750.

12 Tsubochi HN,Sato M,Hiyama M,et al.Combined analysis of cyclooxygenase-2 expression with p53 and Ki-67 in nonsmall cell lung cancer.Ann Thorac Surg,2006,82:1198-1204.

13 Khuri FRH,Wu JJ,Lee BL,et al.Cyclooxygenase-2 over expression is a marker of poor prognosis in stage I non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res,2001,7:861-867.

14 Hosomi YT,Yokose Y.Increased cyclooxygenase-2(COX-2)expression occurs frequently in precursor lesions of human adenocarcinoma of the lung.Lung Cancer,2000,30:73-81.

15 Krysan KK,Reckamp S,Sharma M,et al.PGE2 activates MAPK/Erk pathway in non-small cell lung cancer cells in an EGF receptor-independent manner.Cancer Res,2005,65:6275-6281.

16 Williams CSM,Tsujii J,Reese SK,et al.Host cyclooxygenase-2 modulates carcinoma growth.J Clin Invest,2000,105:1589-1594.

17 Toamey DP,Murphy JF,Conlon KJ.COX-2,VEGF and tumor angiogenesis.The Surgeon,2009,7:174-180.

18 Dohadwala MJ,Luo L,Zhu Y,et al.Non-small cell lung cancer cyclooxygemase-2 dependent invasion is mediated by CD44.J Biol Chem,2001,276:20809-20812.

19 Huang MM,Stolina S,Sharma J,et al.Non-small cell lung cancer cyclooxygenase-2-dependent regulation of cytokine balance in lymphocytes and macrophages:up-regulation of interleukin 10 and down-regulation of interleukin 12 production.Cancer Res,1998,58:1208-1216.

20 Thiel A,Heinonen M,Rintahaka J,et al.Expression of cyclooxygenase-2 is regulated by glycogen synthase kinase-3beta in gastric cancer cells.Biol Chem,2006,281:4564-4569.

21 Mao JT,Fishbein MC,Adams B,et al.Celecoxib decreases Ki-67 proliferative index in active smokers.Clin Cancer Res,2006,12:314-320.

22 Sung MW,Lee DY,Park SW,et al.Celecoxib enhances the inhibitory effect of 5-Fu on human squamous cell carcinoma proliferation by ROS production.Laryngoscope,2016,26:26309.

23 王玲嬋，崔立靜，王東昌,等.艾瑞昔布抑制肺腺癌A549細胞裸鼠移植瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及機制.中國癌癥雜志,2017,27:1-6.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.015

項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(編號：ZD20140272)

050100 河北省石家莊市井陘礦區(qū)醫(yī)院(穆維新)；河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院東院急診科(王耀賢、閆立曼)

王耀賢，050011 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院東院急診科；

E-mail:mmllcc36@sina.com

R 578.1,R 734.2

A

1002-7386(2017)14-2139-04

2017-01-12)