張彩鳳 吳云彬 宋 珍

黃腐酸促進(jìn)超氧化物歧化酶形成的作用機(jī)制探究

張彩鳳1,2吳云彬1宋 珍1

(1 太原師范學(xué)院化學(xué)系 晉中 030619 2 山西省腐植酸工程技術(shù)研究中心 晉中 030619)摘 要：本論文利用Discovery Studio 4.5初步探討了腐植酸中的黃腐酸促進(jìn)超氧化物歧化酶形成的作用機(jī)制。黃腐酸作為一種生物刺激素已被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并且很多研究表明，黃腐酸在植物的許多生理過(guò)程中起了非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，黃腐酸對(duì)玉米幼苗葉片中超氧化物歧化酶的形成有一定的促進(jìn)作用。通過(guò)分子模擬軟件Discovery Studio 4.5對(duì)機(jī)理的研究表明，這是由于黃腐酸先與植物中的鈣調(diào)蛋白結(jié)合，形成較為穩(wěn)定的配合物，后再與超氧化物歧化酶作用，降低了酶本身的能量，不僅使其更容易被合成，同時(shí)還增加了它與其他物質(zhì)的親和力。

腐植酸 黃腐酸 鈣調(diào)蛋白 超氧化物歧化酶(SOD)

腐植酸(Humic acid，HA)，是一種在自然界中普遍存在且較為易得的大分子有機(jī)物，它是動(dòng)、植物遺骸經(jīng)過(guò)十分漫長(zhǎng)的地質(zhì)過(guò)程，并由一系列微生物分解轉(zhuǎn)化而形成的一種天然有機(jī)質(zhì)。腐植酸的種類有很多，其中黃腐酸由于其較小的分子量，非常容易被生物吸收。除此，腐植酸還含有較多的活性基團(tuán)，如酮羰基和酚羥基，因此易于以氫鍵的形式與大分子物質(zhì)結(jié)合，而這一點(diǎn)又非常有利于我們進(jìn)行接下來(lái)的一系列探究。

大量的研究表明，將黃腐酸培養(yǎng)液噴灑在農(nóng)作物的表面，能夠顯著地提高被噴灑農(nóng)作物的產(chǎn)量[1～3]，而對(duì)于農(nóng)作物以外的其他植物，則可以非常明顯地促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育[4]。與此同時(shí)，大量的研究實(shí)例也證明，黃腐酸在植物的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化方面具有一定的促進(jìn)作用，如作為一種新型的生物刺激素，它能夠刺激植物體內(nèi)酶的活性，特別是對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及過(guò)氧化物酶(POD)具有明顯的作用[5～8]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在一定范圍內(nèi)，隨著黃腐酸濃度的增加，玉米幼苗葉片中SOD的含量也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)[9]。

而據(jù)文獻(xiàn)顯示，廣泛存在于植物體內(nèi)的一種受體蛋白——鈣調(diào)蛋白可以刺激SOD的生成[10]。鈣調(diào)蛋白是一種鈣受體蛋白，它可以通過(guò)與鈣離子的結(jié)合，形成鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物(Calcium-Calmodulin Complex)。與此同時(shí)，鈣調(diào)蛋白的構(gòu)型也會(huì)相對(duì)地發(fā)生一些變化，成為一些酶如SOD的激活物。SOD被激活后，它便能更好地催化如下反應(yīng)的進(jìn)行：2O2-+2H+→H2O2+O2。這樣一來(lái)，存在于生物體內(nèi)的有害物質(zhì)——超氧陰離子自由基就可以得到很好的清除[10]，因?yàn)槌蹶庪x子O2-的濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致氧化從而損壞生物自身組織[11]，所以其累積含量越少對(duì)植物的生長(zhǎng)越有利。

因此，玉米幼苗葉片中SOD含量的增加與黃腐酸和鈣調(diào)蛋白有關(guān)，但由于黃腐酸也可以與鈣調(diào)蛋白發(fā)生相互作用[9]，所以就目前的研究來(lái)看是無(wú)法確定其作用機(jī)制在三者都參與的情況下具體是按怎樣的途徑來(lái)進(jìn)行的。由此可提出以下三種假設(shè)來(lái)進(jìn)行機(jī)理的探討。

第一，黃腐酸與鈣調(diào)蛋白形成配合物后再與SOD相互作用；

第二，鈣調(diào)蛋白直接與黃腐酸-SOD配合物相互作用；

第三，黃腐酸-鈣調(diào)蛋白配合物與黃腐酸-SOD配合物發(fā)生相互作用。

但想要證明這些，通過(guò)宏觀的實(shí)驗(yàn)是無(wú)法做到的，必須從微觀的角度來(lái)進(jìn)行。因此，本論文利用近些年來(lái)被廣泛使用的基于統(tǒng)計(jì)力學(xué)和量子力學(xué)[12]的計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)，通過(guò)Discovery Studio 4.5軟件，從以上的三種假設(shè)出發(fā)，用分子對(duì)接(Molecular Docking)、結(jié)合能(Binding Energy)計(jì)算以及分子動(dòng)力學(xué)(Molecular Dynamics，MD)模擬來(lái)初步探討黃腐酸促進(jìn)SOD形成的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本論文中對(duì)接所使用的黃腐酸3D模型來(lái)自PUBCHEM數(shù)據(jù)庫(kù)，鈣調(diào)蛋白和SOD的3D模型則來(lái)自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)。此次實(shí)驗(yàn)用馬鈴薯的鈣調(diào)蛋白、番茄的SOD來(lái)近似代替所有植物的這兩種蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分子模擬。

1.2 材料的預(yù)處理

對(duì)于直接從PUBCHEM數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所得的黃腐酸分子，要先在Small Molecules中進(jìn)行優(yōu)化(Full Minimization)，目的是將其優(yōu)化為能量最低的合理構(gòu)象，然后通過(guò)Prepare or Filter Ligands面板，找到其可能存在的、所有的同分異構(gòu)體，為下一步分子對(duì)接(Molecular Docking)做準(zhǔn)備。

對(duì)于直接從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所得的鈣調(diào)蛋白和SOD，則要先去除蛋白質(zhì)所攜帶的水分子，然后點(diǎn)擊軟件的Prepare Protein面板，使系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化和補(bǔ)全蛋白結(jié)構(gòu)，最后通過(guò)From Receptor Cavities選項(xiàng)，找到蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)(即最有可能與配合物或是另一蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用或結(jié)合的部位。多數(shù)情況下，軟件會(huì)定位于蛋白質(zhì)的空腔部分)，為下一步的分子對(duì)接(Molecular Docking)做準(zhǔn)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)所用軟件

本論文進(jìn)行計(jì)算機(jī)分子模擬所用的軟件為美國(guó)Accery 公司自主研發(fā)的Discovery Studio 4.5，即藥物發(fā)現(xiàn)與生物大分子計(jì)算模擬平臺(tái)4.5版本。Discovery Studio(簡(jiǎn)稱DS)，它主要服務(wù)于生命科學(xué)領(lǐng)域，用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究及新藥的發(fā)現(xiàn)。它主要包含四大板塊：生物大分子板塊(如蛋白質(zhì)中氨基酸的序列分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)等)、計(jì)算化學(xué)板塊(如分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算以及分子動(dòng)力學(xué)模擬等)、基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)板塊(如基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的化合物虛擬篩選以及蛋白與蛋白、蛋白與有機(jī)化合物配體的對(duì)接等)和基于配體藥物設(shè)計(jì)板塊。

1.3.2 小分子與大分子的對(duì)接及動(dòng)力學(xué)模擬

小分子與大分子對(duì)接所依據(jù)的原理為Fischer E所提出的鎖匙原理，根據(jù)CHARMm力場(chǎng)(簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)其實(shí)就是幾何匹配和能量匹配)，尋找兩分子間的最佳匹配(互相作用)模式。在這里小分子指的是黃腐酸，大分子則是指鈣調(diào)蛋白以及SOD。在軟件的Receptor-Ligand Interactions面板中找到Dock Ligands(CDOCKER)選項(xiàng)設(shè)置好對(duì)接參數(shù)，然后點(diǎn)擊RUN開(kāi)始運(yùn)行，數(shù)分鐘后，即可得到對(duì)接結(jié)果。

將對(duì)接好的黃腐酸-鈣調(diào)蛋白和黃腐酸-SOD配合物根據(jù)牛頓力學(xué)來(lái)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，它主要包括以下四個(gè)過(guò)程：模擬體系的升溫過(guò)程(Heating Stage)、模擬體系的平衡過(guò)程(Equilibrium Stage)、模擬體系的采樣過(guò)程(Production Stage)以及分析體系的目標(biāo)性質(zhì)(Analysis)。然后在Simulations面板中溶劑化蛋白、設(shè)置束縛和修改動(dòng)力學(xué)參數(shù)，最后點(diǎn)擊RUN開(kāi)始運(yùn)行，數(shù)小時(shí)后即可得到模擬結(jié)果。

1.3.3 大分子與大分子的對(duì)接

大分子與大分子對(duì)接所依據(jù)的原理仍為鎖匙原理，但有所不同的是，它是基于快速傅立葉轉(zhuǎn)化相關(guān)性技術(shù)的一種剛性蛋白對(duì)接算法。算法中快速傅立葉轉(zhuǎn)化相關(guān)性技術(shù)被用于搜索蛋白-蛋白對(duì)接系統(tǒng)的平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)空間。此次實(shí)驗(yàn)采用的采樣角度為6度，由于角度較小，因此采樣較多，預(yù)測(cè)結(jié)果也更為準(zhǔn)確。在這里，大分子指的是鈣調(diào)蛋白和SOD，或是黃腐酸-鈣調(diào)蛋白和黃腐酸-SOD配合物。在軟件的Macromolecules面板中找到Dock Protein(ZDOCKER)選項(xiàng)設(shè)置的對(duì)接參數(shù)，然后點(diǎn)擊RUN開(kāi)始運(yùn)行，數(shù)小時(shí)后，即可得到對(duì)接結(jié)果。

1.3.4 結(jié)合能的計(jì)算

在軟件的Receptor-Ligand Interactions面板中找到Calculate Binding Energy選項(xiàng)，然后點(diǎn)擊計(jì)算結(jié)合能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在View Result中調(diào)出計(jì)算數(shù)據(jù)與圖表，分析所得結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 黃腐酸-鈣調(diào)蛋白及黃腐酸-SOD配合物和它們的動(dòng)力學(xué)模擬

近年來(lái)，隨著消費(fèi)升級(jí)的不斷深入，格蘭仕順應(yīng)市場(chǎng)需求，也憑借著強(qiáng)大的研發(fā)、制造能力，不斷推出了一系列的高端家電產(chǎn)品，其中雙變頻微波爐及微蒸烤一體機(jī)更是其突出的代表性產(chǎn)品。

從圖1可以看出，黃腐酸分子中一共有4個(gè)羥基，2個(gè)羰基及2個(gè)含氧環(huán)，它們都是能夠形成氫鍵的基團(tuán)。而圖2中所顯示的黃腐酸分子能夠給出或是接受H的部分與它所含有的基團(tuán)都是相對(duì)應(yīng)的，如：粉色代表能夠給出氫的部分，從2D效果圖可以看出這是羥基所在的位置；綠色代表能夠接受氫的部分，從2D效果圖可以看出這是羰基和含氧環(huán)所在的位置。

圖1 黃腐酸分子(2D)Fig.1 Fulvic acid(2D)

圖2 黃腐酸分子表面能形成氫鍵區(qū)域示意圖Fig.2 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds with other macromolecular substances

圖2 黃腐酸分子表面能形成氫鍵區(qū)域示意圖

Fig.2 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds with other macromolecular substances

圖3和圖4分別是黃腐酸與鈣調(diào)蛋白和SOD的對(duì)接結(jié)果示意圖，圖中紅色區(qū)域?yàn)樽钣锌赡艿幕钚晕稽c(diǎn)，綠色部分的作用則如同數(shù)學(xué)中的坐標(biāo)一樣，黃腐酸分子就是在其中按“坐標(biāo)”逐個(gè)移動(dòng)以尋找最佳(即不僅能量最低且又具有一定的合理性)的對(duì)接部位。

圖5顯示的是黃腐酸與鈣調(diào)蛋白對(duì)接后兩者的非鍵作用，圓圈部分為與黃腐酸產(chǎn)生非鍵作用的鈣調(diào)蛋白中的氨基酸，不同的顏色表示鍵的類型不同。由圖可知，有電荷間的吸引力、氫鍵、碳?xì)滏I、π-烷基鍵及π-σ鍵；圖6顯示的是黃腐酸與SOD對(duì)接后兩者的非鍵作用，由圖可知，有碳?xì)滏I、π-烷基鍵及π-S鍵。結(jié)合圖1和圖2可知，圖5和6中所提到的那些鍵大都與羰基、羥基、含氧環(huán)中的氧及苯環(huán)上的大π鍵有關(guān)，據(jù)此可以推斷，對(duì)于黃腐酸分子，不論是與生物大分子進(jìn)行對(duì)接還是與其他有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)，主要都是與它所含的以上基團(tuán)作用。

圖3 鈣調(diào)蛋白和黃腐酸對(duì)接示意圖Fig.3 Results of docking (the fulvic acid was combined with calmodulin)

圖4 SOD和黃腐酸對(duì)接示意圖Fig.4 Results of docking (the fulvic acid was combined with SOD)

圖5 黃腐酸與鈣調(diào)蛋白對(duì)接后兩者非鍵作用示意圖Fig.5 Non-bond interaction of fulvic acid-calmodulin compound

圖6 黃腐酸與SOD對(duì)接后兩者非鍵作用示意圖Fig.6 Non-bond interaction of fulvic acid-SOD compound

由圖7可知，隨著溫度的增加，體系的總能量總體來(lái)講是呈下降趨勢(shì)的，能量越低，物質(zhì)本身便越穩(wěn)定。而與此同時(shí)，對(duì)于鈣調(diào)蛋白來(lái)說(shuō)，能量的降低也有利于它與其他物質(zhì)的結(jié)合。通過(guò)軟件計(jì)算可知：非活性鈣調(diào)蛋白與Ca2+的結(jié)合能是-349.32 kcal/mol，與黃腐酸分子結(jié)合后再與Ca2+結(jié)合的結(jié)合能是-357.05 kcal/mol，可以看出結(jié)合能有所下降，由此可推斷黃腐酸可以促進(jìn)非活性的鈣調(diào)蛋白向活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而能夠促進(jìn)生物體內(nèi)與鈣調(diào)蛋白有關(guān)的生理活動(dòng)的進(jìn)行，如刺激SOD的生成，利于植物的生長(zhǎng),提高植物的抗逆性能。

圖7 黃腐酸-鈣調(diào)蛋白配合物的動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果Fig.7 Results of dynamics simulation (fulvic acid was combined with calmodulin)

圖8為黃腐酸-SOD配合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬后所得的結(jié)果。由圖可知，隨著溫度的增加，體系的總能量與開(kāi)始相比最終也是呈下降趨勢(shì)的，這就說(shuō)明配合物的構(gòu)型也變得更加穩(wěn)定了。通過(guò)軟件計(jì)算可知：未與黃腐酸分子對(duì)接前，SOD的能量為-3517.1514 kcal/mol，而與黃腐酸分子對(duì)接后SOD自身的的能量變?yōu)?3632.9798 kcal/mol，能量有所下降，但是下降的并不是十分明顯，因此還需通過(guò)接下來(lái)的計(jì)算來(lái)證明到底哪種作用機(jī)理更為合理。

圖8 黃腐酸-SOD配合物的動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果Fig.8 Results of dynamics simulation (fulvic acid was combined with SOD)

2.2 大分子-大分子復(fù)合物和結(jié)果分析

圖9 SOD為受體,鈣調(diào)蛋白為配體進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.9 SOD as a receptor, calmodulin as a ligand, the calmodulin was combined with SOD

圖10 已與黃腐酸對(duì)接的SOD為受體,鈣調(diào)蛋白為配體進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.10 Fulvic acid- SOD compound as a receptor, calmodulin as a ligand, the calmodulin was combined with fulvic acid-SOD

圖11 SOD為受體,已與黃腐酸對(duì)接的鈣調(diào)蛋白為配體進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.11 SOD as a receptor, fulvic acid-calmodulin compound as a ligand, the fulvic acid-calmodulin compound was combined with SOD

圖12 已與黃腐酸對(duì)接的SOD為受體，已與黃腐酸對(duì)接的鈣調(diào)蛋白為配體進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.12 Fulvic acid-SOD compound as a receptor, fulvic acid-calmodulin compound as a ligand, the fulvic acid-calmodulin compound was combined with fulvic acid-SOD

比較黃腐酸-SOD配合物和黃腐酸-鈣調(diào)蛋白配合物的結(jié)合能，-106.69 kcal/mol和-357.05 kcal/mol，可看出后者比前者構(gòu)象更加穩(wěn)定，因此黃腐酸更易于與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成配合物。

由以上數(shù)據(jù)可知：黃腐酸促進(jìn)植物體內(nèi)SOD的形成最可能的途徑是：黃腐酸先與鈣調(diào)蛋白結(jié)合再與SOD作用，因?yàn)閺哪芰康慕嵌葋?lái)看，這樣所需的能量最低，反應(yīng)也更容易朝此方向進(jìn)行。

3 結(jié)論

大田實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃腐酸能夠作為一種生物刺激素作用于植物，而且用黃腐酸培養(yǎng)液培育的植物，其細(xì)胞質(zhì)中SOD的含量明顯增加，而這種酶的增多對(duì)于植物體內(nèi)超氧自由基的清除又有很明顯的促進(jìn)作用[13-15]，同時(shí)還可以增加植物的抗逆性。本論文計(jì)算機(jī)分子模擬的計(jì)算結(jié)果表明，黃腐酸促進(jìn)植物體內(nèi)SOD的形成最有可能的機(jī)理是：黃腐酸先與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，形成較為穩(wěn)定配合物，后再與SOD作用，降低了酶本身的能量，從而增強(qiáng)了其與其他物質(zhì)作用時(shí)的親和力。與此同時(shí)，由于沿此途徑形成的酶的能量較低，因而也有利于刺激植物體內(nèi)SOD的形成。

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A Preliminary Study on the Mechanism of Formation of Superoxide Dismutase Affected by Fulvic Acid

Zhang Caifeng1,2, Wu Yunbin1, Song Zhen1
(1 Taiyuan Normal University, Jinzhong, 030619 2 Humic Acid Engineering and Technology Research Center of Shanxi Province, Jinzhong, 030619)

A study on the formation mechanism of superoxide dismutase (SOD) was conducted. The result showed that the formation of superoxide dismutase in plant’s leaves was promoted by fulvic acid to some extent. The molecular simulation analysis indicated that fulvic acid could reduce the binding energy between the calmodulin and Ca2+to make calmodulin becoming easier to be activated.

humic acid; fulvic acid; calmodulin; superoxide dismutase(SOD)

TQ314.1，Q554

1671-9212(2017)03-0056-06

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.03.006

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：51174275)、山西省留學(xué)歸國(guó)基金資助(No.2011085)和太原師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(CXCY1606)資助。

2017-5-25

張彩鳳，女，1964年生，教授，主要從事腐植酸生物功能方面研究，E-mail：841322483@qq.com。