劉洪偉， 王 帥， 王 強， 王 偉， 楊艷芳， 劉錫葵， 邱德有

（1.林木遺傳育種國家重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京100091；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所，北京100050；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，云南 昆明650204）

甜菜樹貝殼杉烯合酶基因的克隆與原核表達

劉洪偉1， 王 帥1， 王 強2， 王 偉3， 楊艷芳1， 劉錫葵*4， 邱德有1

（1.林木遺傳育種國家重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京100091；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所，北京100050；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，云南 昆明650204）

本文作者研究了赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶-貝殼杉烯合酶，對其功能的研究可以為以后優(yōu)化品種提供基因?qū)用娴幕A(chǔ)。首先通過RACE-PCR技術(shù)，從甜菜樹葉片中克隆得到貝殼杉烯合酶基因（Ent-kaurene synthase gene，YlKS）的全長cDNA，共2 512 bp（GenBank登錄號為KP872698），其ORF長度為2 232 bp，共編碼743個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小為84 987，蛋白質(zhì)等電點為5.264，表明該蛋白質(zhì)呈酸性。將該基因構(gòu)建到表達載體pET32a中，得到重組質(zhì)粒pET-32a-YlKS。通過將pGG/An2、p IRS和重組質(zhì)粒pET-32a-YlKS 3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入菌株BL21（DE3）中，得到重組菌株，并進行發(fā)酵。通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白成功得到了表達。最后通過對發(fā)酵產(chǎn)物進行萃取，并使用GC-MS進行檢測，確定了該基因所編碼的酶確實是貝殼杉烯合酶。

甜菜樹；貝殼杉烯合酶；原核表達；氣質(zhì)聯(lián)用

甜菜樹 （Yunnanopilia longistaminata（W.Z.Li）C.Y.Wu et D.Z.Li（Opiliaceae））是我國特有的野生食用木本蔬菜植物[1-2]，為山柚子科甜菜樹屬的喬木植物，主要分布在我國云南紅河流域海拔在900～1 500m的亞熱帶森林中[3]。作為一種有待開發(fā)的野生食用植物資源，吳志霜等[4]對它的營養(yǎng)成分進行了報道，發(fā)現(xiàn)其氨基酸和維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)的含量都比其他植物豐富。柳建軍等對它的脂溶性化學(xué)成分進行了分析[5]，分離得到了10個化合物，并發(fā)現(xiàn)甜菜樹提取物具有一定抗氧化活性[6]。劉錫葵等從甜菜樹中分離鑒定出兩種紫杉烷類物質(zhì)[3]，可能成為一種新的紫杉烷類物質(zhì)的來源植物，并證明其主要甜味功能因子成分為艾杜醇（iditol）[7]。

作為以嫩莖葉為食用部位的甜菜樹，研究其營養(yǎng)生長的基因調(diào)控能夠為良株篩選提供基因?qū)用嫔匣A(chǔ)及參考。許多研究指出，赤霉素能促進芹菜、苜蓿、茼蒿、莧菜、白菜、菠菜等多種植物莖葉的生長和產(chǎn)量的增加[8]。在植物赤霉素的合成途徑中，首先由古巴焦磷酸合酶 （Copalyl pyrophosphate synthase，CPS）催化GGPP形成中間產(chǎn)物內(nèi)根-古巴焦磷酸（Ent-copalyl diphosphate，CDP），CDP再由內(nèi)根-貝殼杉烯合酶（Ent-kaurene synthase，KS）催化合成內(nèi)根-貝殼杉烯（Ent-kaurene），所以KS是赤霉素合成途徑中的第2個關(guān)鍵酶[9]。在水稻中內(nèi)根-貝殼杉烯合酶OsKS1催化赤霉素生物合成的第二步反應(yīng)，且其只在水稻葉片和莖中表達，而萌發(fā)中的種子和根中不表達，說明OsKS1僅與水稻地上部分生長發(fā)育相關(guān)，不參與種子的萌發(fā)和根的生長[10]。但到目前為止，編碼KS的基因在多種植物中都被相繼克隆得到[11]，但在甜菜樹上尚未見報道。

本研究中利用RACE-PCR技術(shù)首次從甜菜樹中克隆得到了KS基因的cDNA全長，并將其構(gòu)建到原核表達載體pET32a中得到重組質(zhì)粒，并和質(zhì)粒pGG/An2（含有一個玉米的ent-CPS基因An2[12]）、p ISR[13]共轉(zhuǎn)到表達菌株BL21（DE3）進行發(fā)酵，通過GC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進行了研究，現(xiàn)將有關(guān)方法和結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長蕊甜菜樹幼苗由中科院昆明植物研究所劉錫葵副研究員實驗室培育，在溫室種植20 d到生長狀態(tài)良好，取幼嫩葉片1 g，迅速用液氮冷凍，存于-80℃?zhèn)溆?。細菌蛋白質(zhì)提取試劑盒、克隆載體pUC-19、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）：購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；表達載體pET32a由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所王偉副研究員提供。質(zhì)粒pGG/An2、p ISR及pET-28-OsKS（含有一個水稻的KS基因OsKS1[14]）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的王強教授構(gòu)建。

1.2 甜菜樹葉片RNA的提取

使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAout2.0試劑盒，按照其說明書步驟提取凍存的甜菜樹葉總RNA，并在樣品上柱后純化之前，加TAKARA公司的DNaseⅠ進行處理，去除DNA。cDNA的合成使用 Clontech公司的 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，按照說明書的步驟合成5’和3’RACE Ready cDNA。

1.3 基因RACE、全長克隆與序列分析

通過分析本課題組的甜菜樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（尚未發(fā)表），得到KS基因的片段，并設(shè)計RACE-PCR引物YLKS5-1：CCAGATAATCCAGACAGTTAGCGTT T；YLKS3-1：ATGGGCAAAGAATGGCGTGTT。PCR擴增條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。

然后通過RACE-PCR擴增得到甜菜樹KS基因的兩端序列，利用MegAlign拼接出全長，并命名該基因為 YloKS。設(shè)計 ORF擴增引物 YLKS1：ATGTTTAAAGCAGATGAGCTCTCCGTT；YLKS2：TT AATTTTGCAGCAAATTTTGCGAT。使用KAPA公司的HIFI熱啟動高保真酶進行擴增，PCR條件如下：95℃預(yù)變性3min；98℃變性20 s，62℃退火15 s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR得到的片段進行膠回收，然后連接到pUC-19克隆載體上送到中美泰和公司進行測序驗證。

1.4 表達引物的設(shè)計和載體構(gòu)建

使用軟件Primer 5分析克隆到的KS基因序列的以及原核表達載體pET32a的酶切位點，分別選用Bam H I和Not I兩個酶切位點（下劃線處標(biāo)出），并設(shè)計引物，上游引物為YLKS-PET-1-1：CGGGAT CCATGTTTAAAGCAGATGAGCTCTCCGTT，下游引物為 YLKS-PET-2-1：TTGCGGCCGCTTAATTTT GCAGCAAATTTTGCGAT。以含有YlKS的pUC-19質(zhì)粒為模板，使用KAPA公司的HIFI熱啟動高保真酶進行PCR擴增，PCR條件如下：95℃預(yù)變性3 min；98℃變性20 s，60℃退火15 s，72℃延伸1min，共3個循環(huán)；98℃變性20 s，62℃退火15 s，72℃延伸1min，共28個循環(huán)；72℃延伸10min。

將得到的PCR產(chǎn)物使用Axygen公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行回收，和表達載體分別使用Kpn I和Not I（NEB公司）進行雙酶切。酶切2 h后再次進行純化，并用的T4 DNA連接酶（NEB公司）16℃連接6 h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，倒置37℃過夜培養(yǎng)，菌落PCR篩選陽性菌株。將陽性菌株送北京中美泰和公司測序驗證。

1.5 重組蛋白的原核表達

將3種質(zhì)粒pGG/An2、p ISR和重組質(zhì)粒pET-32a-YlKS（或pET-32a或pET-32a-OsKS）共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）菌株，涂到含有氯霉素（Chlor，34μg/mL）、壯觀霉素（Spec，50μg/mL）和氨芐霉素（Amp，50μg/mL）的平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。以pGG/An2、pISR和空載體pET-32a（+）3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入菌株BL21（DE3）中，得到的菌株作為陰性對照；以pGG/An2、p ISR和pET-28-OsKS 3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入菌株BL21（DE3）中，得到的菌株作為陽性對照；以pGG/An2、p ISR和重組質(zhì)粒pET-32a-YlKS 3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入菌株BL21（DE3）中，得到的菌株進行實驗。挑取5個單克隆到2 mL含有3種抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，活化12 h。

21世紀(jì)初中國推出文化“走出去”戰(zhàn)略以來，成績斐然，“譯介在其中發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用”[1]。謝天振教授提出的“譯介”致力于“揭示譯語文化系統(tǒng)中的政治、意識形態(tài)、文學(xué)觀念、經(jīng)濟因素等對文學(xué)翻譯的操縱和影響”[2]。由此，“譯介”的概念不再局限于自身框架中，它突破傳統(tǒng)意義上的翻譯研究，從其他學(xué)科汲取養(yǎng)分豐盈自己，獲得更為長久的生命力。傳播學(xué)不僅是一門探討傳播現(xiàn)象與規(guī)律的學(xué)科，其交叉學(xué)科的屬性也使得它成為一種研究方法。從傳播學(xué)的角度來審視文學(xué)作品的譯介，不僅完善了傳播學(xué)的知識體系，推動傳播學(xué)理論建設(shè)，也為譯介研究提供新思路、新方法、新收獲。

取600μL活化的菌液加入到裝有60 mL TB培養(yǎng)基的玻璃三角瓶中，37℃培養(yǎng)2.5 h。然后，加入660μL 50%的無菌甘油和6mL的10×磷酸緩沖液。在18℃預(yù)培養(yǎng)1 h后，取出三角瓶，加入100μL 5mg/mL的IPTG，在18℃下表達72 h。

取出10mL表達得到的菌液，8 000 r/min下離心8min，去上清液。加入2 mL細菌蛋白質(zhì)溶解液，充分混勻后37℃孵育3 h，離心取上清液，得到總蛋白質(zhì)并進行SDS-PAGE電泳，檢測YlKS基因的重組蛋白是否表達。

1.6 發(fā)酵產(chǎn)物的萃取及GC-MS分析

在50 mL發(fā)酵菌液中加入50 mL的正己烷萃取8 h，每隔2 h左右搖晃一下。然后，500W超聲5min，使萃取更充分。4℃過夜。取35mL正己烷氮吹，最后定容到1mL，待GC-MS檢測。

樣品的GC-MS分析采用Agilent 7890A/5975C完成，所用的柱子為HP-5MS（30 m×250μm ID× 0.25μm）。采取不分流方式進樣，每次進樣1μL。分離程序為：80℃，2 min；10℃/min的速度升溫到210℃；以3℃/min的速度升溫至240℃；240℃保持3min。進樣口溫度為250℃，質(zhì)譜四級桿檢測器溫度為150℃。質(zhì)譜條件為儀器默認(rèn)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 YlKS基因的克隆和序列分析

對YlKS的ORF序列進行分析發(fā)現(xiàn)其編碼743個氨基酸，使用DNASTAR中的EditSeq預(yù)測得出其編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為84 987，蛋白質(zhì)等電點為5.264，表明該蛋白質(zhì)呈酸性。

圖1 YlKS基因的cDNA末端及ORF擴增Fig.1 Cloning of the cDNA ends and ORF of YlKS

2.2 表達載體pET-32a-YlKS的構(gòu)建及原核表達

將轉(zhuǎn)化pET-32a-YlKS表達載體的菌株進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果為陽性。比對測序結(jié)果表明，YlKS基因片段已成功連接到表達載體中。

以轉(zhuǎn)入pET-32a載體的菌株作為對照，來分析pET-32a-YlKS載體中YlKS基因的表達情況。兩種重組菌株表達后收集菌體并裂解，上清液進行SDS-PAGE電泳驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達的重組蛋白約在103 000位置（見圖2），與預(yù)測的融合蛋白一致。

2.3 產(chǎn)物GC-MS分析

將對照和樣品發(fā)酵得到的菌液用正己烷抽提，將抽提溶劑氮吹，定容至1 mL，用GC-MS進行檢測。結(jié)果顯示：陽性對照中貝殼杉烯在GC中保留時間（RT）為20.32min（圖3（a）），樣品在20.31min處也存在特征峰（圖3（b）），而轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的陰性對照則在此時間沒有相應(yīng)的特征峰（圖3（c））。圖4（a）顯示為水稻的貝殼杉烯合酶產(chǎn)物的GC-MS圖譜，圖4（b）顯示為甜菜樹的貝殼杉烯合酶產(chǎn)物的GCMS圖譜，兩者質(zhì)譜圖基本一致。通過色譜的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以判斷，本實驗中得到的基因確實為貝殼杉烯合酶基因。

圖2 YlKS重組蛋白PAGE電泳Fig.2 PAGE analysis of the Y lKS recombinant protein

圖3 大腸桿菌中發(fā)酵產(chǎn)物的GC結(jié)果分析Fig.3 GC analysis of the fermentation product in E.coli

圖4 發(fā)酵產(chǎn)物貝殼杉烯的GC-MS結(jié)果分析Fig.4 GC-MS analysis of the fermentation product ent-kaurene

3 結(jié)語

甜菜樹在我國云南地區(qū)，作為一種甜味野生蔬菜，深受當(dāng)?shù)孛癖姷南矏郏臧l(fā)現(xiàn)其具有紫杉烷類化合物[6]，使人關(guān)注它的萜類化合物代謝途徑。我們從代謝的角度入手，研究了此植物赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶--貝殼杉烯合酶。本文中借助大腸桿菌系統(tǒng)進行反應(yīng)，在大腸桿菌中，雖然有甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸 （The methyl erythritol phosphate，MEP）途徑，但是異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP） 和 二 甲 基 丙 烯 基 焦 磷 酸（Dimethylallyl diphosphate，DMPP）的合成很少，Cyr等[13]將MEP途徑中的兩個限速酶基因脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因 （1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase gene，DXS）和脫氧木酮糖磷酸還原異構(gòu)酶基因 （1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductase gene，DXR），以及異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因（Isopentenyl diphosphateisomerase gene，IDI）基因剪切信號肽后，重組到pCDFDuet載體中，得到的p IRS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌能夠增加 IPP和DMPP的產(chǎn)量，同時將GGPPS基因和CPS基因重組到pACYCDuet質(zhì)粒中得到pGG/An2重組質(zhì)粒，可以用來在大腸桿菌中合成GGPP。本文中將pGG/ An2、p ISR和重組質(zhì)粒pET-32a-YlKS 3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入菌株BL21（DE3）中，得到重組菌株，進行發(fā)酵，通過對發(fā)酵產(chǎn)物進行萃取，應(yīng)用GC-MS進行檢測，確定了YlKS基因表達的酶具有貝殼杉烯合酶的功能。通常情況下，需要對二萜合酶功能驗證時，需要先將蛋白質(zhì)進行表達并得到可溶性的蛋白質(zhì)，再在體外反應(yīng)體系中加入底物GGPP進行測試，本文中使用合成生物學(xué)技術(shù)，使大腸桿菌能夠合成底物GGPP，這種驗證二萜合酶的方法更省時省力，方便經(jīng)濟，在二萜合酶的研究中具有很大的優(yōu)勢。

赤霉素能促進蔬菜的細胞分裂、細胞伸長、葉片擴大和莖伸長生長，促進側(cè)枝生長、抽苔等[15]。甜菜樹的食用部位是嫩莖葉，所以研究赤霉素對甜菜樹莖葉的生長是非常重要的。作為赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一的KS在蘋果[11]、梨[16]中都有研究。在水稻中，如果KS基因缺失突變體表現(xiàn)為嚴(yán)重矮化、不能開花[10]，這種現(xiàn)象可以用在對矮化苗的選育中，尤其在矮化的果樹砧木研究中有突出作用[11，16]。目前，編碼KS的基因在其他多種植物上相繼得到克隆[17-20]，我們首次報道從甜菜樹中克隆得到KS基因，并通過原核表達驗證其功能。甜菜樹作為中國云南紅河流域的一種野生食用木本蔬菜植物，深受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?，現(xiàn)在也逐漸開始了人工種植，但價格依然昂貴，對該基因的研究可以為以后對甜菜樹不同株高的選育提供一定基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression of the Ent-Kaurene Synthase Gene from Yunnanopilia longistam inata（W.Z.Li，C.Y.W u et D.Z.Li）（Opiliaceae）

LIU Hongwei1， WANG Shuai1， WANG Qiang2， WANGWei3，YANG Yanfang1， LIU Xikui*4， QIU Deyou1
（1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，The Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China；2.College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；4.State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resourses in West China，Kunm ing Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunm ing 650204，China）

Yunnanopilia longistaminata isaw ild woody vegetable in China，and its tender stems and leaves are edible.So far，studies of Y.longistaminata havemostly been focused on tissue culture，physiology and biochem istry，while less concentrated on the gene level.Gibberellin （GA）can enhance vegetative grow th，such as the bolting，and the grow th of stems and leaves.Usingmolecular biology methods，we studied the ent-kaurene synthase，a key enzyme in the synthesis pathway of gibberellins.Ent-kaurene synthase gene（YlKS）was cloned from the leaf of Y.longistaminata through RACE-PCR.The full gene length was 2 512 bp（GenBank accession number KP872698）. Results showed that the ORF length of YlKS was 2 232 bp and themolecularweightof its encoded protein（YlKS）was84 987.The theoretical isoelectric pointof YlKSwas5.264，which suggested that YlKS protein was acidic.The gene was cloned into the vector pET32a to get the plasm id pET-32a-YlKS.Plasm ids p IRS，pGG/An2 and pET-32a-YlKSwere co-transformed into BL21（DE3）strain to obtain a new recombinantstrain，and then the recombinantstrainwasused for fermentation. The SDS-PAGE analysis showed that the recombinant protein was expressed successfully.Finally，we used n-hexane to extract the fermentation products and the GC-MS analysis confirmed that the gene in this studywas Ent-kaurene synthase encoding gene.

Yunnanopilia longistaminata，ent-kaurene synthase，prokaryotic expression，GC-MS

Q 943.2

A

1673—1689（2017）05—0479—07

2015-05-06

中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（RIF2014-01）；中國林業(yè)科學(xué)研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（CAFYBB2012042）。

劉洪偉（1987—），男，山東莒縣人，農(nóng)學(xué)博士，助理研究員，主要從事紫杉醇相關(guān)分子生物學(xué)方向的研究。

E-mail：lhwei1987@126.com

*通信作者：劉錫葵（1967—），男，湖南湘潭人，副研究員，主要從事野生食用蔬菜和藥用植物資源化學(xué)與持續(xù)利用方面的研究。

E-mail：liuxikui@mail.kib.ac.cn

劉洪偉，王帥，王強，等.甜菜樹貝殼杉烯合酶基因的克隆與原核表達[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（05）：479-485.