黃仁術(shù)， 劉仁妮， 錢艷琳， 徐興苗， 項學(xué)偉

（1.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012）

蘘荷總黃酮的提取工藝及其體外抑菌活性研究

黃仁術(shù)1，2， 劉仁妮2， 錢艷琳2， 徐興苗2， 項學(xué)偉2

（1.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012）

利用響應(yīng)面法確定蘘荷總黃酮的最佳提取工藝，并探討其體外抑菌活性。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化工藝條件；對此工藝下的提取液進行濃縮，通過牛津杯法和二倍稀釋法探討其抑菌活性。在優(yōu)化工藝條件乙醇體積分?jǐn)?shù)94.75%、處理溫度100℃、液料比85∶1（mL∶g）、處理時間70 min時，蘘荷總黃酮得率為39.87%，與預(yù)測值40.79%的相對誤差僅2.26%；蘘荷總黃酮對大腸桿菌、釀酒酵母、黑曲霉沒有抑制作用，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用，其MIC分別為3.245 9、1.622 9mg/mL，MBC分別為12.983 5、6.491 8mg/mL。蘘荷總黃酮可作為一種新型抗菌藥物開發(fā)，其提取工藝可用響應(yīng)面法進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

總黃酮；蘘荷；響應(yīng)面；提取工藝；體外抑菌

蘘荷（Zingiber mioga（Thunb.）Rosc.），俗稱陽荷、茗荷、觀音花、蓮花姜、野姜等，屬藥食兩用的姜科多年生草本植物，廣泛分布我國南方地區(qū)。而植物黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖，以及增強免疫力、保護心腦血管等多種功效[1]。但目前蘘荷黃酮的研究基本屬于空白，僅張澤生報道蘘荷50%乙醇提取物具有明顯的體外抗氧化活性，對DPPH、OH-、O2-、H2O2的清除率分別達到了 70%、64%、77%、71%[2]；馬建蘋等報道蘘荷根莖乙醇提取物及石油醚和氯仿萃取物能顯著抑制金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、無乳鏈球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的生長繁殖，具有明顯的滅活作用[3]。故本文作者在響應(yīng)面法優(yōu)化蘘荷黃酮提取工藝的基礎(chǔ)上，對其抗菌活性進行研究，以期為蘘荷資源的有效開發(fā)和新型抗菌藥物的獲得提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

SW-CJ-1C型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YX-450型電熱蒸汽壓力消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；HH-S6型恒溫水浴鍋：金壇金城國勝實驗儀器廠；UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計：上海龍尼克儀器有限公司；SH2-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州英峪予華儀器有限公司；FA1204N電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DHP-9272培養(yǎng)箱：浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；硝酸鋁（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%）：上海新寶精細(xì)化工廠；氫氧化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.0%）：西隴化工股份有限公司。實驗菌株包括以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）為代表的革蘭陽性細(xì)菌，以大腸桿菌（Escherichia coli）為代表的革蘭陰性細(xì)菌，以黑曲霉（Aspergillus niger）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為代表的真菌：武漢大學(xué)中國典型微生物保藏中心；蘘荷來源于大別山區(qū)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮的測定方法 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用分光光度計可測定食品中的總黃酮含量[4]。故稱取6.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，在10mL的容量瓶中用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇充分溶解，并定容成質(zhì)量濃度0.6mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別按體積梯度將標(biāo)準(zhǔn)液添加到10mL的容量瓶中，再加入0.4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉搖勻后靜置6min，加入0.4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁，搖勻后再靜置6min，接著加入4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉，用蒸餾水定容至刻度，搖勻后靜置15min。以空白試劑作對比參照，在510 nm波長時測吸光度值，根據(jù)吸光度A，建立吸光度與總黃酮質(zhì)量M（mg）的線性關(guān)系。

1.2.2 單因素范圍試驗

1）確定乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍試驗：稱取3.0 g過80目篩的蘘荷粉末15份，分5組，每組3個重復(fù)；每組份按液料比15 mL/g分別以體積分?jǐn)?shù)0%（蒸餾水）、20%、40%、60%、80%的乙醇浸溶于錐形瓶；回流冷凝裝置下于60℃恒溫水浴60min，4 000轉(zhuǎn)速離心10min，抽濾。提取液用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容于50mL的容量瓶中，用移液槍移取1mL到10 mL的容量瓶中，按蘘荷總黃酮的測定方法測其吸光度，以確定乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2）確定處理溫度范圍試驗：在確定乙醇濃度的基礎(chǔ)上，分別以20、40、60、80、100℃水浴浸提，以確定處理溫度。

3）確定液料比范圍試驗：在確定處理溫度的基礎(chǔ)上，分別以液料比為5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1（mL∶g）的乙醇浸提，以確定液料比范圍。

4）確定處理時間范圍試驗：在確定液料比的基礎(chǔ)上，在20～100min范圍內(nèi)按20 min的梯度改變水浴處理時間，以確定處理時間范圍。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 響應(yīng)面采用Design-Expert.8.0.6軟件設(shè)計，乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、處理溫度（X2）、液料比（X3）和處理時間（X4）為自變量，蘘荷總黃酮提取得率（Y）為響應(yīng)值。

1.2.4 體外抑菌試驗 純化供試菌種制成菌懸液備用。蘘荷總黃酮濃縮物抑菌效果采用牛津杯法測定，蘘荷總黃酮最低抑菌濃度（MIC）采用二倍稀釋法測定，進一步將有抑菌效果二倍稀釋液移種到培養(yǎng)基上，根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落生長情況測定蘘荷總黃酮最小殺菌濃度（MBC）[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘘荷總黃酮的測定

經(jīng)測定，吸光度A與總黃酮質(zhì)量M的線性關(guān)系為A=0.113 8M-0.001 5，R=0.999 5。相關(guān)系數(shù)符合國家標(biāo)準(zhǔn)高于0.99的要求，可作為測定依據(jù)[6]。

2.2 單因素范圍試驗

2.2.1 確定乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍試驗 經(jīng)方差分析的F檢驗，F(xiàn)=391.38＞F0.01（4，10）=5.99，表明各處理間存在真實的差異，即乙醇濃度對蘘荷總黃酮有極顯著的提取影響（P＜0.01）。為進一步明確不同處理間的差異顯著性，還必須對各均數(shù)進行兩兩比較，故通過SSR法檢驗（見表1）可見，在乙醇體積分?jǐn)?shù)升高時，蘘荷總黃酮的得率極顯著提高（P＜0.01），當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，蘘荷總黃酮的得率達到10.28%，故確定適宜提取劑為高濃度乙醇。響應(yīng)面法可進一步縮小乙醇濃度篩選范圍，選擇75%～95%區(qū)間。

表1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取效果比較表Table 1 Effects of different concentrations of ethanol on the extraction

2.2.2 確定處理溫度范圍試驗 經(jīng)F檢驗，F(xiàn)= 78.23＞F0.01（4，10）=5.99，表明處理溫度對蘘荷總黃酮有極顯著的提取影響（P＜0.01）。進一步采用SSR法檢驗（見表2），發(fā)現(xiàn)較高溫度（60～100℃）對蘘荷總黃酮的提取效果影響差異不顯著（P＞0.01）；但60℃的提取效果與40℃的差異不顯著（P＞0.01），而80℃與40℃有極顯著差異（P＜0.01），從而確定適宜處理溫度為80℃。響應(yīng)面法優(yōu)化可進一步縮小處理溫度篩選范圍，選擇60～100℃區(qū)間。

表2 不同處理溫度提取效果比較表Table 2 Effects of different tem perature treatments on the extraction

2.2.3 確定液料比范圍試驗 經(jīng)F檢驗，F(xiàn)= 933.71＞F0.01（4，10）=5.99，表明液料比對蘘荷總黃酮有極顯著的提取影響（P＜0.01）。進一步采用SSR法檢驗（見表3），發(fā)現(xiàn)隨著液料比的升高，蘘荷總黃酮的得率極顯著提高（P＜0.01），當(dāng)液料比在45∶1（mL∶g）時，蘘荷總黃酮的得率達到18.41%，故確定應(yīng)用高液料比的乙醇浸提。響應(yīng)面法可進一步增加液料比篩選范圍，選擇液料比45∶1～85∶1（mL∶g）區(qū)間。

表3 不同液料比提取效果比較表Table 3 Effects of different ratios of liquid to solid on the extraction

2.2.4 確定處理時間范圍試驗

經(jīng)F檢驗，F(xiàn)=6.65＞F0.01（4，10）=5.99，表明處理時間對蘘荷總黃酮有極顯著的提取影響（P＜0.01）。SSR法檢驗（見表4）可見，在60min時蘘荷總黃酮的得率最高，且與其他各組差異極顯著（P＜0.01），從而確定適宜的處理時間為60min。響應(yīng)面法進一步確定處理時間的篩選范圍為50～70min。

表4 不同處理時間提取效果比較表Table 4 Effects of different time treatments on the extraction

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1 回歸方程與統(tǒng)計檢驗 根據(jù)蘘荷總黃酮提取的響應(yīng)面設(shè)計方案和結(jié)果（見表5），采用設(shè)計軟件二次回歸分析，可以得到方程：

表5 蘘荷總黃酮提取響應(yīng)面設(shè)計試驗方案及結(jié)果Table 5 Design of the response surface and results for the extraction of total flavonoids from Zingiberm ioga

從數(shù)字模型方差分析的結(jié)果來看 （見表6）：模型的F=14.42，（Prob＞F）＜0.000 1，表明模型顯著，實驗設(shè)計可靠具有統(tǒng)計學(xué)意義；模型失擬項（Prob＞F）= 0.126 1＞0.05，表明模型失擬項不顯著，模型與實驗擬合程度高，各實驗點均能用模型描述。此外，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.935 2＞0.9，表明模型擬合程度好，可信度較高；變異系數(shù) （CV）=8.44%，信噪比14.339＞4，表明模型方程能夠很好的反映真實的實驗值。因此，蘘荷總黃酮的提取工藝可以用該模型預(yù)測。根據(jù)模型系數(shù)顯著性檢驗的結(jié)果可知，該模型中X1、X2、X3、X1X2的偏回歸系數(shù)極顯著（P＜0.01），X1X3的偏回歸系數(shù)顯著（P＜0.05），說明乙醇體積分?jǐn)?shù)、處理溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和處理溫度的交互項、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互項對蘘荷總黃酮提取得率的影響顯著或極顯著。

2.3.2 蘘荷總黃酮提取的響應(yīng)面分析 處理溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)有交互作用（見圖1），隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，蘘荷總黃酮提取得率升高至恒定或先升高后降低；在低乙醇體積分?jǐn)?shù)時，提取得率隨著處理溫度的提升先緩慢降低，再緩慢升高，基本保持一個平衡狀態(tài)；而在高乙醇體積分?jǐn)?shù)時，提取得率隨著處理溫度的提升，保持一個增長性的提升速度。由圖2可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比也有交互作用，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，蘘荷總黃酮的提取得率先提高后降低；隨著液料比的增加，蘘荷總黃酮的提取得率也隨之增加，但在高體積分?jǐn)?shù)乙醇時增加的更加明顯。

表6 蘘荷總黃酮提取工藝優(yōu)化數(shù)學(xué)模型方差分析Table 6 Variance analysis of the optimal mathematical model for the extraction of total flavonoids from Zingiberm ioga

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和處理溫度的響應(yīng)面Fig.1 Response surface of ethanol solution and treatment temperature

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of ethanol solution and liquidsolid ratio

由圖3可見，蘘荷總黃酮的提取得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而先升高后降低，處理時間對其影響則不大。由圖4可見，蘘荷總黃酮的提取得率隨著液料比的增加而增加，隨著處理溫度的提升而先降低后增加。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)和處理時間的響應(yīng)面Fig.3 Response surface of ethanol solution and treatment time

圖4 處理溫度和液料比的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of liquid-solid ratio and treatment tem perature

2.3.3 試驗驗證 經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化計算，得出在乙醇體積分?jǐn)?shù)94.75%、處理溫度100℃、液料比85∶1（mL/g）、處理時間70min時，蘘荷總黃酮提取得率最大，達到40.79%。該工藝條件下進行提取驗證，蘘荷總黃酮平均得率為39.87%，與預(yù)測值相對誤差僅2.26%。

2.4 體外抑菌試驗

2.4.1 牛津杯法測定蘘荷總黃酮抑菌效果 由圖5、圖6可知，蘘荷總黃酮濃縮液（質(zhì)量濃度25.967 mg/mL）對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用；但對大腸桿菌、釀酒酵母、黑曲霉未見抑菌作用。其中，蘘荷總黃酮對枯草芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑為23.1mm；對金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑為16mm。

圖5 蘘荷總黃酮對枯草芽孢桿菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory activity of total flavonoids from Zingibermioga against Bacillus subtilis

圖6 蘘荷總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory activity of total flavonoids from Zingiber m ioga against Staphyloccocus aureus

2.4.2 蘘荷黃酮的MIC、MBC測定 通過蘘荷總黃酮對柘草芽孢桿菌的MIC、MBC測定結(jié)果來看 （見圖7），蘘荷總黃酮的濃縮液在1/8倍稀釋前，試管中的枯草芽孢桿菌生長受抑制、培養(yǎng)液清亮，之后枯草芽孢桿菌生長、培養(yǎng)液混濁；其1/2倍稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，未見有枯草芽孢桿菌菌落出現(xiàn)，而1/4倍稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，枯草芽孢桿菌生長且菌落數(shù)多于5個。說明蘘荷總黃酮對枯草芽孢桿菌的MIC為其濃縮液的1/8倍稀釋液，即質(zhì)量濃度3.245 9 mg/mL；MBC為其濃縮液的1/2倍稀釋液，即質(zhì)量濃度12.983 5mg/mL。

圖7 蘘荷總黃酮對枯草芽孢桿菌的M IC、MBC測定Fig.7 M IC and MBC of total flavonoids from Zingiber m ioga against Bacillus subtilis

通過蘘荷總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC、MBC測定結(jié)果可知（見圖8），蘘荷總黃酮的濃縮液在1/16倍稀釋前，試管中的金黃色葡萄球菌生長受抑制、培養(yǎng)液清亮，之后金黃色葡萄球菌生長、培養(yǎng)液混濁；其1/4倍稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)生長但總數(shù)小于5個，而1/8倍稀釋液轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)皿后，菌落出現(xiàn)大片生長。說明蘘荷總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC為其濃縮液的1/16倍稀釋液，即質(zhì)量濃度1.622 9 mg/mL；MBC為其濃縮液的1/4倍稀釋液，即質(zhì)量濃度6.491 8mg/mL。

圖8 蘘荷總黃酮對金黃色葡萄球菌的M IC、MBC測定Fig.8 M IC and MBC of total flavonoids from Zingiber m ioga against Staphyloccocus aureus

3 結(jié)語

本研究中以蘘荷為原料，利用響應(yīng)面法建立了蘘荷總黃酮提取工藝條件的數(shù)學(xué)回歸模型：Y=-104.272 66+6.762 77X1-2.615 14X2-1.321 55X3-1.337 32X4+0.015 138X1X2+0.013 025X1X3+0.014 225X1X4+0.003 8562 5X2X3+0.000 65X2X4+0.001 575X3X4-0.054 376X12+0.007 0810 4X22-0.000 1470 83X32+0.000 161 667X42。通過二次回歸方程得到蘘荷總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)94.75%、處理溫度100℃、液料比85∶1（mL∶g）、處理時間70min時，此工藝條件下蘘荷總黃酮提取得率為39.87%，與預(yù)測值40.79%的相對誤差僅2.26%。說明建立的模型與實際情況擬合很好，響應(yīng)面法適用于對蘘荷總黃酮提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。對此工藝下提取的蘘荷總黃酮的體外抑菌試驗表明，蘘荷總黃酮濃縮液在質(zhì)量濃度25.967mg/mL時，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用，對大腸桿菌、釀酒酵母、黑曲霉沒有抑制作用；蘘荷總黃酮對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為3.245 9、1.622 9mg/mL，MBC分別為12.983 5、6.491 8mg/mL。

[1]HUANG Renshu，HU Xiaomeng，HEHuili.Optim ization of ultrasonic-assisted extraction techniquesof isoflavones from Pueraria lobata（w ild）ohw iin dabiemountain by response surfacemethodology and reducing powermeasurement[J].Chin Pharm J，2015，50（1）：51-57.（in Chinese）

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[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范－食品理化檢測[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

Extraction of Total Flavonoids from Zingiberm ioga and in Vitro Antibacterial Activities

HUANG Renshu1，2， LIU Renni2， QIAN Yanlin2， XU Xingmiao2， XIANG Xuewei2
（1.Plant Cell Engineering of Anhui Province Engineering Technology Research Center，Lu'an 237012，China；2. College of Biological and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu'an 237012，China）

To determ ine the optimal extraction of total flavonoids from Zingiber mioga by the response surfacemethodology and then to study the in vitro antibacterial activities.On the basis of single factor experiments，a 4-factor，3-level Box-Behnken center-united experimentwas conducted. The Box-Behnken experimentoptim ized the processing conditionsby response surfacemethodology. Then the extract from the optimal conditions was concentrated.Finally，the in vitro antibacterial activitiewere determ ined by oxford plate testsand doubling dilutionmethod.The optimal conditions were as follows：ethanol concentration 94.75%，treatment temperature 100℃，liquid-to-solid ratio 85∶1 （m L∶g），treatment time 70 m in.Under the optimal conditions，the extraction rate of total flavonoids was 39.87%，of which the relative error was only 2.26%compared w ith the predicted value of40.79%；total flavonoids from Zingibermioga had no inhibitory effectson Escherichia coli，Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger，but did inhibit the grow th of Bacillus subtilis and Staphyloccocus aureus w ith theminimal inhibitory concentration（M IC）3.245 9mg/m L and 1.622 9 mg/m L and them inimal bactericidal concentration（MBC）12.983 5 mg/m L and 6.491 8mg/m L，respectively.CONCLUSION Total flavonoids from Zingiber mioga could be a new type of antibacterial agents and the extraction was suitable for the regression analysis and parameter optimization by response surfacemethodology.

total flavonoids，Zingiber mioga，response surface methodology，extracting process，inhibitory bacteria experiment in vitro

R 931.71

A

1673—1689（2017）05—0524—07

2015-12-12

安徽省2014年高校優(yōu)秀青年人才支持計劃資助項目。

黃仁術(shù)（1976—），女，漢族，新疆阿克蘇人，副教授，主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail：ahhrs@126.com

黃仁術(shù)，劉仁妮，錢艷琳，等.蘘荷總黃酮的提取工藝及其體外抑菌活性研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（05）：524-530.