陳 雪， 石愛民，劉紅芝， 劉 麗，王 強(qiáng)*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

鈣誘導(dǎo)花生蛋白納米顆粒的制備及其工藝優(yōu)化

陳 雪1，2， 石愛民2，劉紅芝2， 劉 麗2，王 強(qiáng)*2

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

花生蛋白作為大宗優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)，資源豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，具有良好的開發(fā)潛能。以花生分離蛋白為基質(zhì)材料制備花生分離蛋白納米顆粒，并優(yōu)化其最佳制備工藝。通過納米激光粒度儀及透射電子顯微鏡（TEM）對納米顆粒的粒徑及形態(tài)進(jìn)行表征。結(jié)果表明，制備的納米顆粒球形圓整，分散性好，粒徑分布較窄，平均粒徑為（94.66±0.53）nm。以花生蛋白為原料制備納米顆粒，不僅可拓寬花生蛋白應(yīng)用領(lǐng)域，也為開發(fā)蛋白納米顆粒新劑型提供一定的研究基礎(chǔ)。

花生分離蛋白；納米顆粒；納米激光粒度儀；透射電子顯微鏡

納米顆粒是指粒徑小于1μm的球狀膠體顆粒，其根據(jù)材料可分為生物降解型和非生物降解型兩類[1]。目前，生物降解型納米顆粒被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其主要作為藥物/營養(yǎng)素的遞送載體。蛋白質(zhì)是由各種氨基酸組成的具有空間結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，不僅具有可生物降解、無毒、無免疫原性、病人耐受和生物利用度高等特點(diǎn)，且來源廣泛[2]，是理想的生物降解型材料，因此成為許多納米顆粒制備的主要研究對象，如白蛋白、酪蛋白、膠原蛋白等動(dòng)物蛋白質(zhì)已成功應(yīng)用于納米顆粒的制備[3-6]。然而，以植物蛋白質(zhì)為基質(zhì)材料制備納米顆粒的報(bào)道相對較少，目前，應(yīng)用于納米顆粒制備的植物蛋白質(zhì)有大豆分離蛋白、玉米醇溶蛋白等[7-8]。

花生蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，含有人體必需的8種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)素，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低，營養(yǎng)價(jià)值高，是一種極具開發(fā)潛力的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)[9]。本研究中以花生分離蛋白為基質(zhì)材料，利用鈣離子誘導(dǎo)合成花生蛋白納米顆粒，所制備的納米顆粒球形圓整、分散性好，平均粒徑為（94.66±0.53）nm。

1 材料與方法

1.1 原料及所用儀器

花生分離蛋白：作者所在實(shí)驗(yàn)室自制；無水氯化鈣（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉、鹽酸均為分析純。

90-4型數(shù)顯控溫磁力攪拌器，上海振榮科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；納米激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品；H-7500型透射電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 花生蛋白納米顆粒的制備

稱取一定質(zhì)量的花生分離蛋白粉溶于去離子水中，配成一定濃度的花生分離蛋白溶液，0.5mol/L NaOH將pH調(diào)至實(shí)驗(yàn)值。將上述溶液在85℃條件下水浴加熱30 min，靜置冷卻至室溫后，用HCl將pH調(diào)至7.0。向溶液中加入一定量的CaCl2溶液，定容使最終蛋白質(zhì)濃度為初始蛋白質(zhì)濃度的1/2，室溫下靜置過夜。

1.3 花生蛋白納米顆粒的性質(zhì)考察

1.3.1 動(dòng)態(tài)光散射分析 將制備的花生分離蛋白納米溶液用納米激光粒度儀檢測納米顆粒的粒徑大小及分布，測定溫度為25℃。

1.3.2 透射電子顯微鏡表征 取一滴納米顆粒溶液加到覆有聚乙烯醇縮甲醛脂膜的銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)水平放置 2～3min使分子聚集體沉積到網(wǎng)面上，用濾紙吸去表面多余溶液，之后滴加體積分?jǐn)?shù)2%的醋酸雙氧釉溶液對納米顆粒進(jìn)行負(fù)染2 min，將銅網(wǎng)在濾紙上放置 3 min使充分染色并吸取多余的染液，干燥后用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 正交設(shè)計(jì)篩選最佳制備工藝

1）單因素水平設(shè)置。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，本試驗(yàn)將重點(diǎn)考察制備過程中可能影響花生分離蛋白納米顆粒粒徑及分布的最終蛋白質(zhì)濃度、實(shí)驗(yàn)pH及CaCl2濃度3個(gè)因素，設(shè)置水平分別為：最終蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度：1、3、5、7、9 mg/mL；實(shí)驗(yàn)pH值：8、9、10、11、12；CaCl2濃度：2.5、3.5、5.0、6.5、7.5mmol/L。

2）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按L15（33）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)（表1）。并采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)、回歸方程方差分析，各因素對花生分離蛋白納米顆粒粒徑及分布影響程度分析。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Orthogonal factor levels

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)pH對花生蛋白納米顆粒粒徑的影響酸性實(shí)驗(yàn)條件下，花生蛋白其等電點(diǎn)產(chǎn)生沉淀而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故本研究中選擇堿性條件作為實(shí)驗(yàn)研究的pH范圍。固定花生蛋白最終質(zhì)量濃度為3 mg/mL，CaCl2濃度為5 mmol/L，分別在不同實(shí)驗(yàn)pH值條件下制備花生蛋白納米顆粒，對粒徑進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。隨著實(shí)驗(yàn)pH值的逐漸增大，納米顆粒的粒徑呈先減小后增大的趨勢，在pH值11時(shí)達(dá)到最小?；ㄉ鞍椎牡入婞c(diǎn)在4.5左右，pH為堿性時(shí)，花生蛋白帶負(fù)電荷。此外，在堿性條件下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生水解，蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)或多肽鏈會(huì)發(fā)生斷裂，而隨著pH的升高，蛋白質(zhì)的水解程度也逐漸增大[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，體系的粒徑呈先減小后增大的趨勢，這可能是由于在pH 8～11時(shí)，隨著pH的升高，水解后得到的分子鏈段越來越小，從而使得形成的蛋白顆粒的粒徑呈下降趨勢；當(dāng)pH過高時(shí)，可能使得已形成的蛋白顆粒的表面電荷發(fā)生改變，引起蛋白顆粒間的相互聚集，從而使得體系的粒徑呈增大的趨勢。

圖1 實(shí)驗(yàn)pH值對花生蛋白納米顆粒粒徑的影響Fig.1 Effect of pH on the particle size of peanut protein nanoparticles

2.1.2 CaCl2濃度對花生蛋白納米顆粒粒徑的影響固定實(shí)驗(yàn)pH值為11，花生蛋白最終質(zhì)量濃度為3 mg/mL，分別在不同CaCl2濃度條件下制備花生蛋白納米顆粒，對粒徑進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。隨著CaCl2濃度的逐漸增大，納米顆粒的粒徑呈先減小后增大的趨勢，在CaCl2濃度為5mmol/L時(shí)達(dá)到最小。這可能是由于蛋白質(zhì)經(jīng)水解后得到的分子鏈段上存在與Ca2+相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)體系的Ca2+濃度逐漸增加時(shí)，使得越來越多的分子鏈段與其相互作用，促進(jìn)分子鏈段的穩(wěn)定折疊，從而誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)緊湊、粒徑較小的蛋白質(zhì)聚集體的形成；當(dāng)Ca2+濃度過高時(shí)，過多的Ca2+可能進(jìn)一步與蛋白質(zhì)聚集體相互作用，從而使得體系的粒徑呈增大的趨勢。有研究表明，水解后的蛋白質(zhì)由于氨基酸殘基的暴露，可與高價(jià)態(tài)的金屬離子相互作用而形成具有穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的蛋白分子聚集體[11]，本實(shí)驗(yàn)所得與該結(jié)論相似。

圖2 Ca2+濃度對花生蛋白納米顆粒粒徑的影響Fig.2 Effect of Ca2+concentration on the particle size of peanut protein nanoparticles

2.1.3 最終蛋白質(zhì)濃度對花生蛋白納米顆粒粒徑的影響 固定實(shí)驗(yàn)pH值為11，CaCl2濃度為5 mmol/L，分別在不同最終蛋白質(zhì)濃度條件下制備花生蛋白納米顆粒，對粒徑進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。隨著蛋白質(zhì)濃度的逐漸增大，納米顆粒的粒徑呈先減小后增大的趨勢，在蛋白質(zhì)最終質(zhì)量濃度為3mg/mL時(shí)達(dá)到最小。分析其原因，可能是由于在實(shí)驗(yàn)pH及Ca2+濃度確定的條件下，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為3mg/mL時(shí)，體系恰好達(dá)到平衡狀態(tài)，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度增加時(shí)，體系中沒有足夠的Ca2+與蛋白質(zhì)分子鏈段相互作用，導(dǎo)致多余的蛋白質(zhì)分子間相互作用形成較大蛋白質(zhì)聚集體從而使得體系的平均粒徑有所增大。

圖3 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對花生蛋白納米顆粒粒徑的影響Fig.3 Effect of protein concentration on the particle size of peanut protein nanoparticles

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于單因素實(shí)驗(yàn)，以實(shí)驗(yàn)pH 11、最終蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度3mg/mL、CaCl2濃度5mmol/L為零水平，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，以納米顆粒的粒徑為響應(yīng)值，分析各因素對納米顆粒粒徑的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal design

2.2.1 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，利用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，建立納米顆粒粒徑Y(jié)與各影響因素X間的二次回歸方程，并對結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 各因子組合花生分離蛋白納米顆粒粒徑方差分析表Table 3 Variance analysis for the particle size of peanut protein nanoparticles from different factor combinations

經(jīng)SAS數(shù)據(jù)處理，采用多項(xiàng)式回歸分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合，得到的二次多項(xiàng)式如式（1）：

由方差分析可知，回歸方程的顯著性檢驗(yàn)F值為10.811 77（P=0.008 69＜0.01），表明回歸方程在試驗(yàn)點(diǎn)上的擬合度達(dá)到極顯著水平；失擬性檢驗(yàn)F值為4.413 397（P=0.190 241＞0.05），表明差異不顯著，回歸方程無失擬因素存在；且回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.951 1，說明模型成立且可靠。

剔除α=0.05顯著水平不顯著項(xiàng)后，簡化后的回歸方程如式（2）：

2.2.2 各因素影響程度分析 各因素的F值可反映出其對試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，比值F越大，表明對試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。由表3可知，比值FX1=2.750 127，F(xiàn)X2=0.756 4，F(xiàn)X3=1.869 957，即各因素對花生分離蛋白納米顆粒粒徑的影響程度大小順序?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)pH＞CaCl2濃度＞花生分離蛋白最終質(zhì)量濃度。

2.2.3 回歸模型的驗(yàn)證 經(jīng)SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析，花生分離蛋白納米顆粒的最佳理論制備工藝參數(shù)為：實(shí)驗(yàn)pH 10.94，花生分離蛋白最終質(zhì)量濃度2.98 mg/mL，CaCl2濃度5.05mmol/L。此條件下花生分離蛋白納米顆粒的理論預(yù)測粒徑為89.638 33 nm，置信區(qū)間為[83.620 0，95.656 6]。為驗(yàn)證所分析結(jié)果是否可靠，在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到花生分離蛋白納米顆粒的粒徑為（94.66±0.53）nm，在置信區(qū)間范圍內(nèi)，可知實(shí)際值與理論值相符。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，花生分離蛋白納米顆粒粒徑均一，具有較好的分散性及圓整度（見圖4）。

圖4 花生蛋白納米顆粒的透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.4 Transm ission electron m icroscopy image of peanut protein nanoparticles

4 結(jié)語

通過條件優(yōu)化，利用鈣離子誘導(dǎo)法成功制備了花生分離蛋白納米顆粒。制得的花生分離蛋白納米顆粒具有良好的分散性、粒度分布均一，平均粒徑為（94.66±0.53）nm。本研究中，花生蛋白納米顆粒的制備具有操作簡單、無有毒試劑使用等優(yōu)點(diǎn)，因此，在新型遞送載體領(lǐng)域，其極具作為藥物/營養(yǎng)素遞送載體的應(yīng)用潛力。

[1]COOMBES A G A，LIN W，O'HAGEN D T，et al.Preparation of protein m icrospheres，films and coatings：U.S.Patent 6，592，844[P].2003-7-15.

[2]王強(qiáng).花生加工品質(zhì)學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[3]SILVA R，F(xiàn)ERREIRA H，CARVALHO A C，etal.Proteinm icrospheres as suitable devices for piroxicam release[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2012，92：277-285.

[4]BRESLAUER D N，MULLER S J，LEE L P.Generation of monodisperse silk microspheres prepared w ith m icrofluidics[J]. Biomacromolecules，2010，11（3）：643-647.

[5]ZENG Ying，XIAO Suyao，CHEN Xuexiang，etal.Preparation and characterization of casein-glucose conjugatesmicrospheres[J]. Science and Technology of Food Industry，2013，34（12）：238-242.（in Chinese）

[6]JAHANSHAHIM，SANATIM H，HAJIZADEH S，etal.Gelatin nanoparticle fabrication and optimization of the particle size[J]. Physica Status Solidi（a），2008，205（12）：2898-2902.

[7]TENG Z，LUO Y，WANG Q.Nanoparticles synthesized from soy protein：preparation，characterization，and application for nutraceuticalencapsulation[J].Journal of Agricultural and Food Chem istry，2012，60（10）：2712-2720.

[8]MULLER V，PIAIJF，F(xiàn)AJARDO A R，etal.Preparation and characterization of zein and zein-chitosanmicrospheresw ith great prospectiveofapplication in controlled drug release[J].Journal of Nanomaterials，2011，2011：10.

[9]王強(qiáng).花生生物活性物質(zhì)概論[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2012.

[10]JIXiaoman，MA Chuanguo，WANGWei，etal.Effectofmodification on physicochemical properties of proteins[J].Cereals& Oils，2015，28（1）：16-19.（in Chinese）

[11]ZHANG J，LIANG L，TIAN Z，etal.Preparation and in vitro evaluation of calcium-induced soy protein isolate nanoparticles and their formationmechanism study[J].Food Chem istry，2012，133（2）：390-399.

Optim ization for the Preparation of Calcium-Induced Peanut Protein Nanoparticles

CHEN Xue1，2， SHIAimin2， LIU Hongzhi2， LIU Li2， WANGQiang*2
（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；2.Institute of Agro-Food Science and Technology Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Peanutprotein,as a high quality vegetable protein,rich in resources and high nutritional value,and it has good development potential.Nanoparticles were synthesized from peanut protein isolate,and optim ized their preparation process.The size and spherical shape of nanoparticleswere characterized bynanolasergranulometer and transm ission electron m icroscopy (TEM).The results show that the nanoparticleswere achieved w ith good dispersibility,round shape and narrow particle size distribution.The average particle sizewas（94.66±0.53）nm.The preparation of nanoparticles from peanut protein notonly can broaden the field of peanut protein application,butalso provide a basis for the developmentofnew formulationsof protein nanoparticles.

peanut protein isolate，nanoparticles，nano laser granulometer，transm ission electron microscope（TEM）

TQ 201

A

1673—1689（2017）05—0494—05

2015-05-20

國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2012DFA31400）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-201X-IAPPST）。

*通信作者：王 強(qiáng)（1965—），男，北京人，工學(xué)博士，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事糧油加工與副產(chǎn)物綜合利用研究。

E-mail:wangqiang06@caas.cn

陳雪，石愛民，劉紅芝，等.鈣誘導(dǎo)花生蛋白納米顆粒的制備及其工藝優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（05）：494-498.