周桂林+范家萌+周賢達+王兆賢+王浩波

摘 要：為加強兩系超級稻豐兩優(yōu)四號的品種質(zhì)量控制，打擊假冒偽劣，該研究利用SSR分子標記技術(shù)構(gòu)建豐兩優(yōu)四號的指紋圖譜，篩選適用于該品種的SSR特征引物，并利用純度SSR快速鑒定技術(shù)體系鑒定豐兩優(yōu)四號的純度。結(jié)果表明：在48對標準SSR引物中，有19對引物在豐兩優(yōu)四號親本間具有多態(tài)性，雜交種呈現(xiàn)雙親互補帶型，可用于該品種純度鑒定；利用SSR快速鑒定技術(shù)鑒定豐兩優(yōu)四號樣品純度的結(jié)果表明，引物RM224和RM336不僅能區(qū)分母本、父本混雜，還能鑒定多種串粉和機械混雜，是對豐兩優(yōu)四號純度鑒定較為適宜的特征引物。

關(guān)鍵詞：兩系超級稻；豐兩優(yōu)四號；SSR；指紋圖譜；純度

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）13-0138-04

Fingerprinting Construction and Rapid Purity Identification of a Two-line Super Rice Variety，

Fengliangyou 4

Zhou Guilin et al.

（Hefei Fengle Seed Co.，Ltd，Hefei 230000，China）

Abstract：To enhance the quality control and fight against counterfeit and defective seeds of a two-line super rice variety fengliangyou 4，fingerprinting map was constructed，and specific primers were screened and used to detect the purity of the sample.The results revealed that the parents of fengliangyou4 showed polymorphism at 19 of 48 SSR markers，and the hybrid's amplification bands were complementary with that of the parents，indicating that the 19 markers were available for purity identification of the hybrid；but RM224 and RM336 were more suitable，because they can distinguish not only parents，but also abnormal seeds caused by out-crossing and mechanical mixing.

Key words：Two-line super rice；Fengliangyou 4；SSR；Fingerprinting map；Purity

品種質(zhì)量包括真實性和純度，是目前我國雜交水稻推廣環(huán)節(jié)中最突出的問題之一，每年都有不少假種和低純度的種子出售，給農(nóng)民和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了很大損失。品種的真實性檢驗和純度鑒定是防止假冒偽劣種子進入市場的重要手段[1，2]。因此，建立簡便、經(jīng)濟、快速、準確的種子真實性和純度鑒定技術(shù)對種子生產(chǎn)經(jīng)營部門和廣大農(nóng)民來說具有重要意義。

SSR標記具有共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)好和簡單快捷等特點，同時符合作物品種鑒定的4個基本準則即環(huán)境的穩(wěn)定性、品種間變異的可識別性、最小的品種內(nèi)變異和試驗結(jié)果的可靠性，且鑒定時間短、費用適中，因而SSR標記法成為當(dāng)前應(yīng)用最廣的種子室內(nèi)真實性及純度檢驗方法[3-5]。此外，新修訂的GB/T3543.5-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定》將“田間小區(qū)種植是鑒定品種真實性和測定品種純度的最為可靠、準確的方法”修改為“田間小區(qū)種植是鑒定品種真實性和測定品種純度的可靠方法之一”（即認可其它準確、可靠的品種真實性和純度鑒定方法），并特別指出，針對品種真實性驗證或身份鑒定，允許采用SSR和SNP分子標記方法；同時，新種子法第四十七條規(guī)定：“農(nóng)業(yè)、林業(yè)主管部門可以采用國家規(guī)定的快速檢測方法對生產(chǎn)經(jīng)營的種子品種進行檢測，檢測結(jié)果可以作為行政處罰依據(jù)”，其中，快速檢測方法即包括DNA檢測方法。

“豐兩優(yōu)四號”屬秈型兩系雜交水稻，是合肥豐樂種業(yè)股份有限公司自主選育的兩系雜交水稻新品種，該品種產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)，且具有較好的抗病性，2007年入選農(nóng)業(yè)部超級稻并列為第二批超級稻示范推廣品種，2009年通過國家審定，2011年被列為長江中下游中秈稻遲熟組篩選試驗對照品種。本研究擬利用農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標準《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》（NY/T 1433-2014）中推薦的48個SSR標記，構(gòu)建豐兩優(yōu)四號的指紋圖譜，并篩選適合的特征引物用于該雜交種純度的快速鑒定，為加強種子質(zhì)量控制，打擊假冒偽劣種子，保護育種者、種子生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)和農(nóng)民的合法權(quán)益提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為純度合格的豐兩優(yōu)四號標準樣品及其親本，以及制種過程中混雜嚴重，但是純度未知的豐兩優(yōu)四號檢測樣品，均由合肥豐樂種業(yè)股份有限公司提供。SSR引物和DNA聚合酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)中心，引物序列來自中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》（NY/T 1433-2014）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)芽 按照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》（GB/T3543.4—1995）要求，每個樣品隨機取220粒種子，均勻置于發(fā)芽床上，溫度為30℃、光照為750lx、濕度為75%的條件下發(fā)芽3～7d。

1.2.2 DNA提取及測定 指紋圖譜構(gòu)建材料（豐兩優(yōu)四號標準樣品及其親本）取長4cm左右的幼苗，采用改良CTAB法[6]提取幼苗總DNA，其中，豐兩優(yōu)四號標準樣品提取4株幼苗DNA，親本各提取2株幼苗DNA。純度鑒定材料（豐兩優(yōu)四號檢測樣品）采用堿煮法快速提取幼苗總DNA：剪取0.5cm長的水稻幼苗，放入96孔PCR板的孔中，每孔加入40μL 0.2mol/L的NaOH，在沸水中煮30s，然后加入60μL 0.17mol/L的Tris-HCl，在沸水中煮沸2min，每份材料提取188株幼苗DNA，4℃保存?zhèn)溆?。以上提取的DNA，利用Nanodrop 2000C型核酸蛋白分析儀測定其濃度和質(zhì)量。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應(yīng)體積為10μL，其中含模板2.0μL（濃度為20～50ng/μL），10×PCR Buffer 1.0μL，dNTP（2.5mM）0.9μL，正反向引物（50ng/μL）各0.5μL，DNA聚合酶（5U/）0.1μL，雙蒸水5μL。PCR反應(yīng)條件為94℃變性4min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)，再72℃延伸7min，12℃保存。

1.2.4 電泳檢測 PCR擴增產(chǎn)物采用4%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測。指紋圖譜構(gòu)建時點樣一次，即使用100孔密型點樣梳一次性點樣96孔PCR板上的96個樣品，在2000V，85W條件下電泳25min后，染色、顯影，觀察帶型、統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)；純度檢測時點樣兩次，即使用100孔密型點樣梳一次性點樣96孔PCR板上的96個樣品（包括2個親本對照），在2000V，85W條件下，先電泳10min后，點樣另外98個樣品包括2個親本對照），繼續(xù)電泳25min后，染色、顯影，觀察帶型、統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豐兩優(yōu)四號DNA指紋圖譜的構(gòu)建 對豐兩優(yōu)四號標準樣及其親本使用48對標準SSR引物進行PCR擴增，均能檢測到清晰的DNA譜帶，對PCR擴增片段賦予數(shù)值，構(gòu)建了豐兩優(yōu)四號標準樣及其親本的數(shù)字指紋圖譜（表1）。其中，19對引物在父母本間具有多態(tài)性，豐兩優(yōu)四號雜交種呈現(xiàn)雙親互補帶型（圖1），可用于該品種的純度鑒定。

2.2 豐兩優(yōu)四號純度快速鑒定 采用堿煮法快速提取混雜嚴重但是純度未知的豐兩優(yōu)四號檢測樣品190株幼苗的DNA，以親本（父、母本）作為對照，選取多態(tài)性好、譜帶清晰穩(wěn)定、非特異性擴增少的2對引物（RM224、RM336）進行PCR擴增，在4%變性聚丙烯酰胺凝膠上兩次點樣和電泳并分析結(jié)果，譜帶中出現(xiàn)雙親互補帶型的為雜交種，其他帶型為雜株（圖2），以此計算純度的百分率=雜交種單株數(shù)/檢測單株數(shù)（不包括未檢測到電泳譜帶而數(shù)據(jù)缺失的單株），并分別對RM224和RM336的擴增片段賦予數(shù)值，將電泳圖譜轉(zhuǎn)換為DNA數(shù)字指紋（表2），分析豐兩優(yōu)四號檢測樣品中不同混雜的類型及原因。

結(jié)果表明，用RM224標記檢測豐兩優(yōu)四號檢測樣品的純度為157/189=83.1%（單株2-58數(shù)據(jù)缺失），檢測到32個雜株，包括3種雜株類型（圖2A），其中，兩種雜株類型是含有母本帶型和不同于父本帶型的串粉雜合帶型（數(shù)字指紋分別為2/4和2/3），一種雜株類型是僅具有母本帶型的自交種帶型（數(shù)字指紋為2/2）；用RM336標記檢測豐兩優(yōu)四號檢測樣品的純度為129/189=68.3%（單株2-58數(shù)據(jù)缺失），檢測到60個雜株，包括5種雜株類型（圖2B），其中，3種雜株類型是含有母本帶型和不同于父本帶型的串粉雜合帶型（數(shù)字指紋分別為4/6、3/6和1/6），一種雜株類型是僅具有母本帶型的自交種帶型（數(shù)字指紋為6/6），一種雜株類型是不含有母本帶型的機械混雜帶型（數(shù)字指紋為1/5）；結(jié)合RM224和RM336兩個標記共檢測到63個雜株，包括了15種雜株類型（表2），其中，RM336標記檢測到的60個雜株中包含RM224標記檢測到的32個雜株中的29株，但未檢測到RM224標記檢測出的另外3個雜株（1-84、1-86和1-91），此外，RM336檢測到的3個母本帶型的單株（1-67、1-90和1-78），在RM224位點為正常雜交種帶型或混雜帶型，而RM224檢測到的10個母本帶型的單株（1-36、2-3、2-10、2-33、2-69、2-77、2-81、2-63、1-84和1-86），在RM336位點為正常雜交種帶型或混雜帶型，說明這13個雜株為串粉或機械混雜種而非自交種，而在RM224和RM336標記位點均為母本帶型的4個雜株（1-87、2-1、2-14和2-70）是否為自交種，需要檢測更多標記位點進行驗證。由此可見，標記RM336較RM224對豐兩優(yōu)四號檢測樣中雜株的鑒別力更強，但2個標記結(jié)合對雜株類型鑒別更準確。

3 結(jié)論與討論

DNA指紋能從本質(zhì)上反應(yīng)生物個體差異，具有較高的多態(tài)性，繪制的品種指紋圖譜具有個體特異性，能在避免外界環(huán)境干擾的情況下快速、準確、穩(wěn)定的鑒定品種，成本低并且能鑒定表型難以鑒定的品種[7，8]。本研究利用農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標準《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標記法》（NY/T 1433-2014）中推薦的48個SSR標記，構(gòu)建了豐兩優(yōu)四號標準樣的DNA指紋圖譜，為其品種權(quán)保護和真實性鑒定、打擊假冒偽劣種子提供了重要依據(jù)。

有效利用DNA分子標記技術(shù)建立當(dāng)前雜交稻主要栽培種的DNA指紋圖庫及品種特有的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，也是解決雜交稻純度鑒定的有效途徑之一[9]。研究結(jié)果表明SSR標記法與田間正季純度鑒定結(jié)果基本一致，最大相差11.2%，其平均差距為0.9%，而海南異地小區(qū)種植純度鑒定結(jié)果與田間正季純度鑒定結(jié)果差異較大，最大相差44.0%，其平均差距為3.6%[10，11]。本研究依據(jù)指紋圖譜，篩選到適合豐兩優(yōu)四號雜交種純度鑒定的引物15個，均能區(qū)分父本或母本混雜；通過純度快速鑒定實踐，發(fā)現(xiàn)RM224和RM336為豐兩優(yōu)四號的特征引物，能區(qū)分父母本混雜的同時，還能鑒別串粉和機械混雜等因素造成的多種異品種，從而為該品種純度的快速、準確鑒定提供了技術(shù)保障。

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（責(zé)編：張宏民）