王興達+曹英昆+霸婉玉+張奇+王小瑞+沈慶洲+張鐵

摘 要：為了研究不同環(huán)境因子對草履蟲種群生長的影響，培養(yǎng)出優(yōu)質的草履蟲，分別在pH梯度為：6.0、65、7.0、7.5、8.0，光照梯度為：0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx條件下培養(yǎng)草履蟲，結果表明，小白菜培養(yǎng)液培養(yǎng)草履蟲的最適pH值為7.0，并且相比于弱酸性環(huán)境，草履蟲更適宜在弱堿性環(huán)境中生長。在光照為0 lx條件下，草履蟲數(shù)量在第4天時達到最大值4 073 ind/100 mL，在光照為500～1 500 lx條件下，隨著光照度的增加，草履蟲的種群數(shù)量也隨之增加。

關鍵詞：草履蟲；pH值；光照；種群密度

1 引言

1.1 研究背景

大草履蟲（Paramecium caudatum）屬原生動物門， 纖毛亞門， 纖毛綱，體長只有80～300 μm，由一個單細胞組成，是動物學教學常用的實驗材料，也是實驗生物學的重要材料[1]。它除了應激迅速外，還具有分布廣泛，繁殖速度快，結構簡單，便于采集培養(yǎng)以及觀察的特點，在細胞生物學、分子遺傳學、分子生物學、生物信息學、仿生學等研究領域得到了廣泛的應用， 同時也是環(huán)境保護科學用來進行環(huán)境監(jiān)測和水質凈化的活性生物材料[2～3]。本文旨在探討pH值和光照對草履蟲種群密度的影響， 從而為實現(xiàn)在實驗室條件下，短時間內大量培養(yǎng)出純度高、性狀穩(wěn)定的草履蟲，以及為草履蟲在水體環(huán)境監(jiān)測中的應用提供理論依據。

1.2 研究進展

草履蟲是原生動物門的代表動物，對其采集、純化及培養(yǎng)方面的研究，隨著科研的進步，實驗條件及設備的改進而不斷發(fā)展。現(xiàn)有研究結果表明，23～27 ℃時大草履蟲的分裂生殖最為旺盛，25 ℃為最適溫度，低于10 ℃時不利于草履蟲的繁殖[4]。當培養(yǎng)液酸性較強時（pH值為3.0和4.0），草履蟲均死亡，草履蟲僅能在弱酸性條件下正常生長，對酸的耐受范圍在pH值5.0～7.0。當pH值高于9.0時，草履蟲不能正常生長，草履蟲只能在弱堿性條件下正常生長，對堿的耐受范圍在pH值7.0～9.0。

2 材料及方法

2.1 實驗材料燒杯、量筒、0～50 μL移液槍、紗布和皮筋若干、漏斗、載玻片，光學顯微鏡、電子天平、pH計、照度計等；新鮮的小白菜、氫氧化鈉、濃鹽酸等。

2.2 草履蟲的采集和純化

草履蟲通常生活在水流速度不大，深度較淺的水溝、池塘和稻田中， 并且大多積聚在有機質豐富、光線充足的水面附近。當水溫在24～27 ℃時， 繁殖最旺盛， 數(shù)目最多。草履蟲的這些習性， 是確定采集地點和方法的重要依據[5]。采集時到附近的水溝、池塘邊， 選擇沒有污染的地方， 用清潔的大燒杯沿水面采集水樣， 這樣的水中往往含有許多草履蟲，并且在距根部 10 cm處剪下并拔出處于生長狀態(tài)的蘆葦，拔出時帶有少量的泥土， 將此蘆葦根部再剪成 2～3 cm小段放于燒杯中，注入清水，放在溫暖明亮處。一周以后， 用顯微鏡檢查可見許多草履蟲。

上述采集到的草履蟲，往往含有許多其它的小型生物以及雜質，要想獲得純度較高的草履蟲，就必須經過分離純化。具體采用微量分離法，即用50 μL移液槍吸取擴大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液10 μL于干凈載玻片上，在4倍顯微鏡下鏡檢，如發(fā)現(xiàn)草履蟲及其它一些小型生物，將之轉吸到另一塊干凈載玻片上，加10 μL小白菜培養(yǎng)液（小白菜培養(yǎng)液制作過程見2.3）按照1∶1比例稀釋變成20 μL，用移液槍在同一塊載玻片上再將其分成2滴，每滴10 μL，然后鏡檢，將含有草履蟲的那一滴再加10 μL小白菜培養(yǎng)液再次按1∶1比例稀釋變成20 μL，如此重復稀釋3～5次后，直到在10倍鏡下鏡檢確認已無其他生物為止。最后，將只含有草履蟲的10 μL培養(yǎng)液吸入500 mL小白菜培養(yǎng)液中（在吸取時注意更換槍頭以免混入其它生物），放于25 ℃光照培養(yǎng)箱中純化培養(yǎng)1周，即可得到濃度較高的草履蟲。若除草履蟲外仍有較多其他生物及雜質，可重復用上述微量分離方法再次進行分離純化。

2.3 培養(yǎng)液的制備

本實驗主要采用小白菜培養(yǎng)液，取新鮮潔凈的小白菜，用剪刀剪碎，按照2 g小白菜搭配自來水1 000 mL的比例， 將小白菜和自來水放入燒杯中， 加熱煮沸10～15 min，停止加熱。待冷卻至室溫，先后用雙層紗布、濾紙各過濾一次，以免一些雜質混入培養(yǎng)液妨礙草履蟲的計數(shù)觀察。為了防止空氣中其它原生動物的包囊落入以及蚊蟲產卵， 燒杯口要用雙層紗布包好， 然后放置在溫暖明亮處進行細菌繁殖。經過24 h后，小白菜培養(yǎng)液即可用于接種使用。

2.4 接種

接種是指將擴大提純后的草履蟲轉移到培養(yǎng)液的過程。按照上述分離提純時所用的方法，接種時， 先將含有草履蟲的液滴吸到干凈的載玻片上，置于低倍顯微鏡下鏡檢， 如果發(fā)現(xiàn)液滴內只有草履蟲， 可用移液槍將草履蟲吸入到盛有小白菜培養(yǎng)液的250 mL小燒杯中進行繁殖。如果液滴內除了草履蟲還有其它小型生物，可按照1∶1比例重復稀釋3～5次后，直到液滴內只含有草履蟲，才可用于接種。

2.5 培養(yǎng)

2.5.1 不同pH梯度下的培養(yǎng)

取100 mL小白菜培養(yǎng)液于250 mL小燒杯中，按以下pH值梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 （用鹽酸和氫氧化鈉溶液調節(jié)培養(yǎng)液到相應pH值）， 配制5種培養(yǎng)液， 每種設3個重復組。在每瓶培養(yǎng)液中接種10個草履蟲， 瓶口上方加蓋雙層潔凈紗布，放在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第2天開始每隔24 h進行取樣計數(shù)，每次計數(shù)完成后調節(jié)培養(yǎng)液到相應的pH值。

2.5.2 不同光照度下的培養(yǎng)

取100 mL小白菜培養(yǎng)液于250 mL小燒杯中，設置光照梯度分別在0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx，每個光照設3個重復，每個重復接種10個草履蟲，瓶口上方加蓋雙層潔凈紗布，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第2天開始，每隔24 h進行取樣計數(shù)。

2.6 觀察計數(shù)

取樣時，先把小燒杯搖勻，然后隨機取9份樣液，每份樣液10 μL，滴在干凈的載玻片上，用顯微鏡觀察計數(shù)，即每次每組pH和光照條件下，同組3瓶各觀察9份樣液，共27份。當蟲體數(shù)量較多時，草履蟲的運動速度快，不便于計數(shù)觀察，可采用擦鏡紙纖維阻攔法，在一定程度上限制草履蟲的運動。擦鏡紙本身呈細密網絡狀， 質地薄而均勻，能很好地限制草履蟲的運動， 觀察效果極為理想。方法如下：把擦鏡紙剪成與蓋玻片等大（或略大于蓋玻片）的小方塊， 放在載玻片上， 然后將草履蟲培養(yǎng)液滴到擦鏡紙上（不可太多， 以培養(yǎng)液正好能濕潤擦鏡紙為宜）， 然后蓋上蓋玻片觀察[6]。鏡檢所有液滴內的蟲數(shù)， 把每一瓶內9滴培養(yǎng)液的蟲數(shù)相加即為90 μL的總數(shù)， 然后再計算出100 mL培養(yǎng)液中草履蟲的個數(shù)。

3 結果與分析

3.1 不同pH值對草履蟲種群密度的影響

pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的5組草履蟲的數(shù)量見表1、圖1，其中，pH7.0組草履蟲生長最好，在第3天種群數(shù)量達到最大值。第3天后，弱堿性條件下2個組（pH值分別為7.5和80）草履蟲的種群數(shù)量明顯高于弱酸性條件下2個組（pH值分別為6.0和6.5）。從第2天開始，5個組的草履蟲種群密度都在飛速上升，其中以pH值7.0組上升趨勢最快，第3天達到最大值5 555 ind/100 mL，由此可知草履蟲生長所需的最適pH值為7.0。5個組草履蟲基本上到第2～3天種群密度達到最大值，弱堿性條件下的2個組（pH值分別為7.5和8.0）在第2天開始種群增長速度要高于弱酸性條件下的2個組（pH值分別為6.0和6.5），并且在以后持續(xù)幾天內，數(shù)量變化趨勢相對平穩(wěn)，由此可知，草履蟲更適于生長在中性及弱堿性的水體環(huán)境中。

通過方差分析可得 pH值為6.0與6.5組間草履蟲的種群密度差異不顯著（P>0.05），但與其它3組差異顯著（P<0.05）；pH值7.0、7.5、80組間差異不顯著（P>0.05），pH值7.0組增長最快。

3.2 不同光照度對草履蟲種群密度的影響

草履蟲體內不含有葉綠體，不能進行光合作用，目前沒有光照與草履蟲種群數(shù)量變化關系方面的相關研究。作者認為光照可能會在某一程度上影響草履蟲的晝夜活動規(guī)律以及營養(yǎng)攝食。本試驗中4種不同光照下各組草履蟲的具體統(tǒng)計數(shù)量及變化見表2、圖2。在光照為0 lx的條件下，草履蟲的長勢良好，從第2天開始草履蟲的種群密度快速上升，并在第5天時達到最大值5 184 ind/100 mL。與有光照條件的其它3個組比較，無光照條件下的草履蟲生長狀況良好，并在第5天達到所有組的最大值，可見，光照的有無并不是制約草履蟲生長繁殖的必要條件。在有光照的條件下， 1 500 lx組的草履蟲數(shù)量在第3天為1 581 ind/100 mL，低于其它兩組，但從第3天開始，草履蟲大量分裂生殖，到第4天達到最大值4 073 ind/100 mL，其后兩天均高于1 000 lx與500 lx 組。1 000 lx組與500 lx組相比無明顯差異，但在第4天兩組草履蟲數(shù)量都達到最大值2 962 ind/100 mL以后， 1 000 lx組草履蟲數(shù)量下降趨勢平穩(wěn)，表明1 000 lx比500 lx更有利于草履蟲生長，在500～1 500 lx條件下，草履蟲的種群密度隨著光照的增強而增大。

通過方差分析可得，500 lx、1 000 lx和1 500 lx組間均無顯著性差異（P>0.05）；0 lx與1 500 lx組間無顯著性差異（P>0.05），但與其他三組差異顯著（P<0.05）。在弱光條件下（低于1 500lx），草履蟲的種群密度隨光照的增強而增大；0 lx與500 lx，1 000 lx，1 500 lx三組相比差異顯著（P<0.05），在無光條件（0 lx）下，草履蟲的長勢良好，最早達到最大生長密度。

4 討論

pH值對動植物的生長有很大影響。何新華、張秋平等人在研究pH值對南美白對蝦蝦苗成活率的影響時發(fā)現(xiàn)pH值對白對蝦蝦苗影響非常大。水體環(huán)境的pH值為7.0～9.0時，蝦苗的應激性較小，蝦苗的存活率較高，為蝦苗的適宜環(huán)境。在pH值為7.0以下及9.0以上時，蝦苗的應激性非常大，蝦苗不適應此環(huán)境[7]。不同動植物對pH值的耐受范圍存在差異。有的生物對pH值的適應范圍非常廣，有的相對較窄，只適宜生活在特定的酸堿度下。甘志凱、張燕[8]認為在相當大的pH范圍內（5.0～10.0）草履蟲均能正常生長， 由此可見草履蟲對酸堿的耐受范圍很大、耐受性較強， 能夠適應較為惡劣的生存環(huán)境；黃正一和蔣正揆[9]認為草履蟲適宜在微堿性環(huán)境中生長，與本實驗結果相近。本實驗的研究結果表明，草履蟲在pH值為7.0的條件下長勢最好，并且相對于弱酸性條件（pH 6.0～7.0），草履蟲更適宜在弱堿性條件（pH 7.0～8.0）下生長。

在水生動物生存的環(huán)境中，光是一個復雜的生態(tài)因子，它有多方面的生態(tài)作用，直接或間接地影響動物的趨光性、晝夜活動節(jié)律、群集活動、攝食以及生長發(fā)育等[10]。草履蟲在數(shù)量較少時有一定的趨光性，即吸一滴帶有草履蟲的培養(yǎng)液于載玻片上，草履蟲會趨于水滴向光的邊緣帶運動。草履蟲體內不含有葉綠體，不能進行光合作用。作者認為光照不是影響草履蟲種群生長的主要因素，但可能會在晝夜活動節(jié)律以及營養(yǎng)攝食等方面起到一些限制作用。所以作者設置4種光照條件，初步探索光照與草履蟲種群生長的關系。實驗結果表明，在光照為0 lx的條件下，草履蟲的長勢良好，在弱光條件下（低于1 500 lx），草履蟲的種群密度隨著光照的增強而增大。

參考文獻：

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[9] 黃正一，蔣正揆.動物學實驗方法[M].上?？萍汲霭嫔纾?981：8-10

[10] 舒建英.淺議環(huán)境因子對水生動物的影響[J].寧夏農林科技.2009（06）：169-170

（收稿日期：2017-03-01；修回日期：2017-07-04）

Abstract：In order to study the influence of different environmental factors on the paramecium population growth， and provide a theoretical basis for the acquisition paramecium culture and environment monitoring， respectively， at pH gradient： 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， light gradient： 0 lx， 500 Training under lx， 1 000 lx， 1 500 lx paramecium condition， results showed that cabbage broth culture paramecium optimum pH of 7.0， as compared to the acidic environment， paramecium more suitable for growing in a weak alkaline environment . In the light of the conditions under 0 Lx， Paramecium quantity in 4 days to reach a maximum 4 073 ind/100 mL， in the 500～1 500 lx illu mination conditions， light intensity increases， the number of paramecium population also increases.

Key words：paramecium； pH； light；population density