陳光明

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術學院淮安生物工程分院，江蘇淮安223200）

槲皮素對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化性能和乳脂合成的影響

陳光明

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術學院淮安生物工程分院，江蘇淮安223200）

為研究槲皮素對體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞抗氧化性能和乳脂合成的影響，試驗將乳腺上皮細胞分成5組，每組培養(yǎng)基中分別含有0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，然后在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結果顯示：（1）細胞培養(yǎng)24 h和72 h時，與0 μg/mL槲皮素組相比，20 μg/mL和40 μg/mL槲皮素組細胞的活性分別顯著提高了13.12%、7.48%和7.83%、29.85%（P＜0.05）。（2）與0 μg/mL槲皮素組相比，20 μg/mL和60 μg/mL槲皮素組的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）活性以及一氧化氮（NO）濃度分別升高了15.52%、19.99%，53.49%、28.23%，36.29%、13.19%和30.42%、39.78%（P＜0.05），MDA含量分別降低了19.29%和32.74%（P＜0.05）。（3）與0 μg/mL槲皮素組相比，添加10 μg/mL槲皮素組細胞的SREBP1、CD36、FAS、PPAR-γ和SCD1基因表達分別顯著降低了45.00%、46.53%、26.73%、43.00%和29.00%（P＜0.05）。結果表明，槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化性能，促進細胞的增殖；并且能夠通過抑制脂肪酸合成和轉運相關基因的表達來降低乳脂的合成。

槲皮素；奶牛；乳腺上皮細胞；乳脂

槲皮素，又稱櫟精，呈黃色針狀結晶，屬于黃酮類化合物，其廣泛存在于植物的花、葉和果實中。研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雞的日糧中添加適量的槲皮素能夠調(diào)節(jié)蛋雞蛋白質(zhì)、鈣及脂質(zhì)的代謝；提高蛋黃蛋白質(zhì)和磷脂含量，降低蛋黃膽固醇和甘油三酯含量，進而提高蛋品質(zhì)（劉紅南等2014；張琳等，2013）。另外，槲皮素能夠保護雞精原細胞免受氧化損傷；抑制雞脂肪合成代謝，進而減少肉雞脂肪沉積以及對禽流感感染有一定的防治作用（李垚等，2013；潘德敏和羅開健，2011；Mi等，2009）。歐陽文文等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過調(diào)控cAMP信號通路抑制脂肪合成相關基因的表達，進而降低脂肪沉積。王明昊等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠調(diào)節(jié)脂肪細胞內(nèi)分泌因子TNF-α、ADP和PPAR-γ的生成，從而降低脂肪細胞TG含量。以上結果說明，槲皮素具有抑制機體內(nèi)脂肪合成的作用。乳腺組織是乳脂合成的主要場所，其在乳腺上皮細胞中合成。本試驗通過細胞培養(yǎng)技術，研究槲皮素對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化性能和乳脂合成相關基因表達的影響，以此來了解槲皮素對乳脂合成的機制，為槲皮素在動物生產(chǎn)上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料槲皮素（含量≥98%）由上海源葉生物科技有限公司提供。試驗時，將槲皮素溶于二甲基亞砜（DMSO），培養(yǎng)基中DMSO含量為1‰。奶牛屠宰后，剪取乳腺組織，放入含雙抗的PBS中，帶回實驗室進行組織塊培養(yǎng)，將純化的細胞接種在含有10%胎牛血清（Gibco，美國）的DMEM/ F12（Gibco，美國）培養(yǎng)基中，在條件為37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞活性檢測細胞活性采用CCK-8法進行檢測，將細胞密度調(diào)整到8.0×104個/mL后接種到96孔板中，在基礎培養(yǎng)基中分別加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每組5個重復。細胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和72 h后，分別在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光值，然后計算細胞相對活性。

細胞相對活性=（As-Ak）/（Ac-Ak）×100。

式中:As為試驗組（細胞+培養(yǎng)基+槲皮素）；Ac為對照組（細胞+培養(yǎng)基）；Ak為空白組（培養(yǎng)基）。

1.2.2 抗氧化指標的檢測將細胞密度調(diào)整到1.0×105個/mL后接種到12孔板中，在基礎培養(yǎng)基中分別加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每組4個重復，培養(yǎng)72 h后，收集細胞上清液進行抗氧化酶類如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量的檢測。所有指標根據(jù)南京建成提供的試劑盒中的方法進行檢測。

1.2.3 細胞總RNA的提取和Real Time-PCR條件取密度為2.5×105個/mL細胞接種到6孔板中，在基礎培養(yǎng)基中分別加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每組4個重復，培養(yǎng)72 h后，收集細胞，然后進行RNA提取，提取方法參照天根生化科技有限公司提供的試劑盒中的說明書。RNA的濃度和純度經(jīng)過測定后，根據(jù)Takara試劑盒中說明書進行反轉錄。根據(jù)試劑盒說明書在冰上配制PCR反應液，然后進行RT-PCR反應，其反應條件為: 95℃預變性30 s；95℃、5 s，60℃、20 s，循環(huán)40次；65℃、15 s。

1.2.4 引物設計根據(jù)Gene Bank中的基因序列，采用Primer 5.0軟件設計引物，引物由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理基因相對表達量采用2-△△Ct方法進行計算，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 21.0進行單因素方差分析（ANOVA），LSD法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 槲皮素對細胞活性的影響從圖1和圖2可知，奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)24 h時，添加20 μg/mL和40 μg/mL槲皮素組的細胞相對活性分別較0 μg/mL槲皮素組顯著升高13.12%和7.48%（P＜0.05）；細胞培養(yǎng)72 h時，與0 μg/mL槲皮素組相比，槲皮素組的細胞相對活性分別顯著升高了7.83%、20.35%、29.85%和12.13%（P＜0.05），其中40 μg/mL組細胞活性最高。結果表明，槲皮素能夠提高細胞活性，促進細胞增殖。

圖1 槲皮素對培養(yǎng)24 h細胞活性的影響

圖2 槲皮素對培養(yǎng)72 h細胞活性的影響

2.2 槲皮素對細胞抗氧化指標的影響從表2中可知，與0 μg/mL槲皮素組相比，20 μg/mL和 60 μg/mL槲皮素組的SOD、CAT和GSH-Px活性以及NO濃度分別升高了15.52%、19.99%，53.49%、28.23%，36.29%、13.19%和30.42%、39.78%（P＜0.05），MDA含量分別降低了19.29%和32.74%（P＜0.05）。結果表明，槲皮素能夠提高細胞的抗氧化能力，進而可以促進細胞的生長。

表2 槲皮素對細胞抗氧化指標的影響

2.3 槲皮素對乳脂合成相關基因表達的影響從表3中可知，與0 μg/mL槲皮素相比，添加10 μg/mL槲皮素組細胞的SREBP1、CD36、FAS、PPAR-γ和SCD1基因表達分別顯著降低了45.00%、46.53%、26.73%、43.00%和29.00%（P＜0.05）。結果表明，槲皮素能夠降低與脂肪合成相關基因的表達，進而影響乳脂的合成。

表3 槲皮素對乳脂合成相關基因表達的影響

3 討論

陳靜（2012）研究發(fā)現(xiàn)，添加12.5～50 μmol/L槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細胞存活率，而添加100～200 μmol/L槲皮素則細胞的存活率降低。說明槲皮素能夠促進細胞的增殖，但添加劑量過高則會對細胞增殖有抑制作用。在本試驗中，細胞培養(yǎng)24 h和72 h，槲皮素添加劑量在40 μg/mL之內(nèi)能夠提高細胞活性，而超過該劑量則細胞活性有所下降。本結果與陳靜研究結果相似。槲皮素添加劑量過高會降低細胞活性的原因可能是槲皮素發(fā)揮了抗雌激素的作用所致。

細胞在正常代謝情況下，會產(chǎn)生活性氧（ROS），而體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)ROS水平，進而使細胞免受ROS的損傷。如果細胞清除ROS能力下降，就會發(fā)生氧化應激，造成細胞損傷（楊麗娟和游育紅，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細胞和小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)的SOD活性和降低MDA含量（陳靜，2012；李云峰等，2007）。另外，在過氧化氫刺激下，槲皮素能夠提高心肌細胞和PC12細胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px活性和降低MDA含量，進而提高細胞活性（劉紅亮等，2014；楊雷等，2006）。本試驗所得結果與以上研究結果相似，說明槲皮素能夠提高細胞的抗氧化能力，進而提高細胞的生長。NO能夠調(diào)節(jié)上皮細胞正常功能和營養(yǎng)物質(zhì)的代謝等。乳腺上皮細胞分泌的NO能夠增加乳腺血管中血流量，促進泌乳（Vasudevan等，2016）。本試驗結果看，添加適量槲皮素可能會增加NO的分泌來促進細胞的增殖。然而，NO含量過高，會對細胞造成損傷。本試驗結果表明，添加60 μg/mL槲皮素細胞的NO濃度最高，而抗氧化酶類活性有所下降。說明NO濃度升高，可能會使細胞產(chǎn)生氧化損傷。

乳脂合成主要有兩部分，一是由乳腺上皮細胞所吸收的瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、β-羥丁酸等脂肪酸前體物質(zhì)在各種酶的催化下合成，另一個是乳腺從血液中獲取的脂肪酸。脂肪酸合成酶（FAS）能夠通過催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成甘油三酯，進而調(diào)控長鏈脂肪酸的合成（羅建學等，2011）。硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）是多不飽和脂肪酸合成過程中的限速酶，通過敲除該基因發(fā)現(xiàn)，在高能日糧條件下小鼠采食增加，但體脂的沉積卻降低（張蕊等，2013）。分化抗原簇36（CD36）是一種跨膜糖蛋白，能與多種配基相結合，是長鏈脂肪酸的轉運蛋白，其在乳腺細胞攝取脂肪酸方面起到非常重要的作用。固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（SREBP）和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是調(diào)控脂質(zhì)代謝的轉錄因子。SREBP1高表達可導致FAS、ACC和PPAR-γ等基因的高表達（許會芬，2012）。敲除PPAR-γ可降低奶山羊乳腺上皮細胞中SCD、SREBP1、FAS等基因表達量（Shi等，2013）。在本試驗中，槲皮素降低了SCD1、SREBP1、FAS、CD36和PPAR-γ mRNA的表達。說明槲皮素可能通過抑制SREBP1和PPAR-γ的表達來降低SCD1和FAS的表達，進而降低脂肪酸的合成；另外，槲皮素可抑制CD36的表達，降低脂肪酸的轉運，進而降低乳脂的合成。

4 結論

槲皮素能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力，進而提高細胞活性；另外，還可通過抑制脂肪酸合成酶和轉運蛋白的表達，降低乳脂的合成。

[1]陳靜.槲皮素對奶牛乳腺上皮細胞的生物學效應研究：[碩士學位論文] [D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2012.

[2]李垚，趙偉，歐陽文文，等.槲皮素對肉雞脂肪細胞脂質(zhì)代謝作用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2013，44（3）：58～65.

[3]李云峰，郭長江，韋京豫，等.槲皮素對小鼠腹腔巨噬細胞氧化應激反應與功能的影響[J].解放軍預防醫(yī)學雜志，2007，25（3）：160～163.

[4]劉紅亮，胡磊，王靖凱，等.槲皮素對H2O2損傷PC12細胞的保護效果與機制[J].中國藥理學通報，2014，30（3）：373～377.

[5]劉紅南，滕楠，李垚，等.飼糧添加槲皮素對蛋雞蛋品質(zhì)和蛋組分的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2014，26（8）：2246～2252.

[6]羅建學，李春風，初曉輝，等.脂肪酸合成酶基因的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（6）：118～122.

[7]歐陽文文，李垚，趙偉，等.槲皮素對肉雞脂肪細胞環(huán)腺苷酸信號通路的作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（13）：2769～2776.

[8]潘德敏，羅開健.槲皮素對禽流感病毒感染試驗雞的防治作用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2011，36（4）：37～39．

[9]王明昊，李垚，趙偉，等.槲皮素對肉雞脂肪細胞內(nèi)分泌因子水平的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2013，25（3）：587～594.

[10]許會芬.西農(nóng)薩能羊乳腺上皮細胞SREBP1基因的過表達及干擾研究：[碩士學位論文][D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2012.

[11]楊麗娟，游育紅.細胞受到氧化應激后損傷的檢測方法[J].醫(yī)學綜述，2010，16（6）：924～927.

[12]楊雷，郭青榜，盧艷，等.槲皮素對過氧化氫所致體外心肌細胞損傷的保護作用[J].中國臨床康復，2006，10（3）：60～62.

[13]占今舜，邢月騰，張彬.細胞培養(yǎng)技術的應用研究進展[J].飼料博覽，2013，1：8～11.

[14]張琳，李垚，馮香安，等.槲皮素對蛋雞生產(chǎn)性能及脂類代謝的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（1）：89～92.

[15]張蕊，張宜輝，邵丹，等.硬脂酰輔酶A去飽和酶基因的功能與調(diào)控[J].生命科學，2013，25（4）：378～382.

[16]Mi Y，Zhang C，Li C M，et al.Quercetin protects embryonic chicken spermatogonial cells from oxidative damage intoxicated with 3-methyl-4-nitrophenol in primary culture[J].Toxicology Letters，2009，190：61～65．

[17]Shi H，Luo J，Zhu J，et al.PPAR γ regulates genes involved in triacylglycerol synthesis and secretion in mammary gland epithelial cells of dairy goats[J]. Ppar Research，2013，6：1～10.

[18]Vasudevan D，Bovee R C，Thomas D D.Nitric oxide，the new architect ofepigenetic landscapes[J].Nitric oxide，2016，59：54～62.■

The objective of this study was to examine the effects of quercetin on antioxidant properties and milk fat synthesis of bovine mammary epithelial cell cultured in vitro.The bovine mammary epithelial cells were divided into 5 groups and cultured in medium with 0，10，20，40 and 60 μg/mL of quercetin，respectively.The cells of each group were cultured in a cell incubator of 37℃，5%CO2.The results showed as follows:（1）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the activity of cells cultured for 24 h and 72 h in the groups of 20 μg/mL and 40 μg/mL quercetin were increased by 13.12%，7.48%and 7.83%，29.85%，respectively（P＜0.05）.（2）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the activity of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），gluta thione peroxidase（GSH-Px）and the NO concentration in the groups of 20 μg/mL and40 μg/mL quercetin were increased by 15.52%，19.99%；53.49%，28.23%；36.29%，13.19%and 30.42%，39.78%，respectively（P＜0.05），the malonaldehyde（MDA）content were decreased by 19.29%and 32.74%，respectively（P＜0.05）.（3）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the relative express of SREBP1，CD36，F(xiàn)AS，PPAR-γ and SCD1 in the group of 10 μg/mL quercetin were decreased by 45.00%，46.53%，26.73%，43.00%and 29.00%，respectively（P＜0.05）.In conclusion，quercetin could increase the antioxidant ability of cells and promote cell proliferation，decrease the milk fat synthesis by inhibiting the expression of gene on the synthesis and transport of fat acid.

quercetin；dairy cow；mammary epithelial cell；milk fat

S816.7

A

1004-3314（2017）13-0016-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171304