劉博，王丹，楊維東，楊文艷，2，楊連玉，2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118；3.正大永吉實(shí)業(yè)有限公司，吉林永吉132100；4.廣澤農(nóng)牧科技有限公司，吉林長春130000）

復(fù)合微生物制劑對全混合日糧貯存時(shí)間及品質(zhì)的影響

劉博1，王丹3，楊維東4，楊文艷1，2，楊連玉1，2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118；3.正大永吉實(shí)業(yè)有限公司，吉林永吉132100；4.廣澤農(nóng)牧科技有限公司，吉林長春130000）

為研究微生物添加劑對全混合日糧（TMR）貯存時(shí)間及營養(yǎng)水平的影響，本試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理組，處理組0（對照未添加組），處理組1（TMR+0.5%米曲霉、纖維素分解菌），處理組2（TMR+0.5%酵母菌、纖維素分解菌），每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)貯存罐，發(fā)酵時(shí)間為30 d。三處理TMR的含水量均為50%，密閉保存。在第0、3、5、7、15和30天對TMR進(jìn)行感官鑒定并測定其霉菌毒素、pH、銨態(tài)氮、有氧穩(wěn)定性及養(yǎng)分含量。結(jié)果表明：（1）0～30 d，霉菌毒素含量隨著貯存時(shí)間呈上升趨勢，處理組0在第30天，黃曲霉毒素超標(biāo)，其他兩組各時(shí)間點(diǎn)均未超標(biāo)。（2）0～30 d，各處理組pH呈下降趨勢，且第7天處理組2顯著高于處理1組（P＜0.05）。（3）0～30 d，處理組2銨態(tài)氮始終高于處理組1，但差異不顯著（P＞0.05）。（4）有氧穩(wěn)定性和貯存時(shí)間呈正相關(guān)，且處理組1高于處理組0、2，處理組0有氧穩(wěn)定性最差。（5）7～30 d，處理組1、2干物質(zhì)，粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。（6）5～30 d，處理組0的酸性洗滌纖維（ADF）及中性洗滌纖維（NDF）的含量顯著低于處理組1、2（P＜0.05），處理組1、2差異不顯著（P＞0.05）。（7）揮發(fā)性脂肪酸含量與貯存時(shí)間呈正相關(guān)。3～30 d，處理組0乙酸含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），5～30 d，處理組0丙酸含量顯著低于其他兩組處理（P＜0.05）。第15天，處理組1乙酸含量較處理組0、2提高了111.08%、34.27%。（P＜0.05），處理組1、2丙酸含量較處理組0提高了365.62%、356.86%（P＜0.05）。綜上所述，TMR中添加米曲霉、酵母菌和白蟻腸道分解菌可提高飼料有氧穩(wěn)定性，延長TMR貯存時(shí)間和品質(zhì)，由pH、NDF、乙酸、丙酸等含量變化來看，米曲霉與白蟻腸道纖維菌有累加效應(yīng)。

全混合日糧；酵母菌；米曲霉；纖維素分解菌

全混合日糧（TMR）是根據(jù)反芻動物不同階段營養(yǎng)需要，將精粗飼料按一定比例均勻混合，調(diào)制成的營養(yǎng)水平相對平衡的日糧。研究表明，TMR的使用不僅可提高反芻動物的平均日采食量和消化率，還能為瘤胃微生物提供均衡穩(wěn)定的營養(yǎng)，增強(qiáng)瘤胃機(jī)能，降低反芻動物發(fā)病率（趙欽君等，2016；張廣鳳等，2014）。目前，TMR飼養(yǎng)技術(shù)已被廣泛使用，但仍存在一些制約因素。TMR日糧貯存時(shí)間很短，易發(fā)霉變質(zhì)，造成飼料浪費(fèi)（楊文艷等，2016）。因此，本研究采用微生物處理，在TMR中添加復(fù)合微生物制劑（米曲霉，酵母菌和纖維素分解菌），研究其對TMR貯存時(shí)間，有氧穩(wěn)定性及對霉菌毒素生長的影響，為TMR進(jìn)一步推廣提供實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料處理1中的復(fù)合微生物制劑由酵母菌和纖維素分解菌組成，處理2中的復(fù)合微生物制劑由酵母菌和纖維素分解菌組成（兩處理菌數(shù)均為1∶1）。其中米曲霉購自北京正農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司，活菌數(shù)≥200億/g。酵母購自安琪酵母有限公司，反芻專用活性釀酒酵母活菌數(shù)≥200億/g。白蟻腸道纖維分解菌由高云航等分離（高云航等，2013），菌落活性為≥20億/mL。黃曲霉毒素B1，玉米赤霉烯酮和赭曲霉素A檢測使用的ELISA試劑盒購自上海快靈生物科技有限公司。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)分為3組，即對照組（未添加微生物制劑），處理組1（TMR+0.5%米曲霉、白蟻腸道纖維素分解菌混合菌）和處理組2（TMR+0.5%酵母菌、纖維素分解菌混合菌），每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)貯存罐，共計(jì)18個(gè)貯存罐，室溫密閉保存。

試驗(yàn)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行，將處理組1和處理組2日糧加入貯存罐中，每罐2000 g，并將其含水量調(diào)至50%，試驗(yàn)期間對貯存的TMR進(jìn)行觀察、取樣、記錄和部分測定。

1.3 試驗(yàn)日糧TMR由吉林省廣澤農(nóng)牧科技有限公司配制，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加復(fù)合微生物制劑，全混合日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 TMR日糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 樣品采集和指標(biāo)測定試驗(yàn)期第0、3、5、7、15、30天打開貯存罐，對其表面及內(nèi)部TMR進(jìn)行感官鑒定，并對試驗(yàn)樣品進(jìn)行多點(diǎn)取樣（8個(gè)部位），共計(jì)每罐取出樣品200 g。將樣品混合均勻后，分為2份，100 g/份。一份用于測定常規(guī)數(shù)據(jù)，另一份樣品置于-20℃保存，用于發(fā)酵指標(biāo)測定。

1.4.1 pH、銨態(tài)氮和霉菌毒素含量TMR樣品的pH、銨態(tài)氮和霉菌毒素均參照楊文艷等（2016）測定方法。

1.4.2 TMR營養(yǎng)成分測定測定初水，再粉碎后過40目篩。飼料中干物質(zhì)（DM）粗蛋白質(zhì)（CP）、酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）均參照楊勝（1993）的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》中的方法進(jìn)行測定。

1.4.3 揮發(fā)性脂肪酸測定參照趙紅艷（2014）的測定方法，采用Agilent Technologies 7890A氣相色譜儀進(jìn)行測定。

1.4.4 有氧穩(wěn)定性測定將采集的1 kg TMR鮮樣置于塑料皿中，使其與空氣充分接觸，處于室溫22～25℃。每隔6 h對樣品進(jìn)行記錄，當(dāng)樣品中心溫度超出室溫2℃，判定為有氧條件下不穩(wěn)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.2一般線性模型進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定由表2可知，兩處理TMR感官特征隨貯存時(shí)間的推移而發(fā)生變化。貯存時(shí)間越長，TMR中心與外周顏色差異越大，且酸味越濃。0～15 d，處理組1、2 TMR均無發(fā)霉現(xiàn)象。15 d，處理組0有外周。30 d，處理組1外周出現(xiàn)少量霉點(diǎn)。

表2 不同存放時(shí)間TMR的感官評定

2.2 不同貯存時(shí)間TMR的霉菌毒素含量由表3可知，貯存TMR在0～30 d，各處理組黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮，赭曲霉素含量呈上升趨勢。0～3 d，各處理組黃曲霉毒素變化差異不顯著（P＞0.05）。5～30 d，處理組1、2黃曲霉毒素顯著低于處理組0（P＜0.05），15～30 d，處理組2黃曲霉毒素顯著高于處理組1（P＜0.05）。3～30 d，處理組0玉米赤霉烯酮顯著高于處理組1、2（P＜0.05），3～7 d，處理組2玉米赤霉烯酮顯著高于處理組1（P＜0.05）。15～30 d，處理組1、2的玉米赤霉烯酮含量差異不顯著（P＞0.05）。5～7 d，處理組2的赭曲霉毒素顯著低于處理組0、1（P＜0.05）且處理組0、1的赭曲霉毒素含量差異不顯著（P＞0.05）。15～30 d，處理組0的赭曲霉含量急劇上升，且高于處理組1、2（P＜0.05），處理組1、2的赭曲霉毒素含量差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同貯存時(shí)間TMR霉菌毒素的變化情況

2.3 有氧穩(wěn)定性貯存TMR有氧穩(wěn)定性變化如表4所示，0～3 d，3處理樣品有氧穩(wěn)定性均為12 h。自5～15 d，處理組1、2有氧穩(wěn)定性優(yōu)于處理組0。至試驗(yàn)第30天，處理組1、2有氧穩(wěn)定都超過了168 h。

表4 不同貯存時(shí)間TMR的有氧穩(wěn)定性h

2.4 不同貯存時(shí)間TMR的pH和銨態(tài)氮的變化2.4.1pH變化由表5可知，隨著貯存時(shí)間的推移，3個(gè)處理的pH均呈下降趨勢,且在7～30 d中對照組的pH值均顯著高于處理組1、2（P＜0.05）。3個(gè)處理組的pH值都在第30天出現(xiàn)最小值，其中在第7天，處理組1的pH顯著低于處理組0、2（P＜0.05）。

2.4.2 NH3-N變化由表5可知，在3～30 d整個(gè)貯存階段，處理組0的NH3-N含量均顯著高于處理組1、2（P＜0.05），且7～15 d的NH3-N含量較其他時(shí)間段增幅度最大，處理組0、1、2第15天的NH3-N含量與第7天相比分別增加了32.01%、53.10%、55.17%。

表5 不同貯存時(shí)間TMR的pH及NH3-N的變化情況

2.5 不同貯存時(shí)間TMR營養(yǎng)成分的變化

2.5.1 DM變化由表6可知，貯存TMR DM的變化隨時(shí)間推移呈下降的趨勢。第7天，處理組1的DM含量顯著低于處理組0、2（P＜0.05）。15～30 d，處理組0 DM含量顯著低于處理組1、2（P＜0.05）。

表6 不同貯存時(shí)間TMR營養(yǎng)成分的變化情況%

2.5.2 CP變化由表6可知，各處理組的CP含量隨時(shí)間推移呈下降趨勢，處理組0的下降趨勢大于其他兩組。0～5 d各處理組CP含量差異不顯著（P＞0.05）。7～30 d，處理組0的CP顯著低于處理組1、2（P＜0.05），且處理組1、2間CP含量差異不顯著（P＞0.05）。

2.5.3 NDF及ADF變化由表6可知，各處理組的NDF及ADF隨貯存時(shí)間延長，其含量呈下降趨勢，0～3 d各處理組NDF及ADF含量差異不顯著（P＞0.05）。5～30 d，處理組0的ADF及NDF的含量顯著低于處理組1、2（P＜0.05），7～30 d，處理組1、2的NDF及ADF含量差異不顯著（P＞0.05），第30天，處理組1較處理組0 NDF下降了5%。

2.5.4 不同貯存時(shí)間TMR的乙酸和丙酸含量由表7可知，0～30 d，各個(gè)處理組乙酸含量呈上升趨勢，3～30 d，處理組1、2乙酸含量顯著高于處理組0（P＜0.05）。7～30 d，處理組1乙酸含量顯著高于其他兩處理組（P＜0.05），且第15天，處理組1對比處理組0、2分別提高了111.08%、34.27%，第30天，處理組1對比處理組0、2分別提高了91.83%、10.08%。0～3 d，各組間丙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。5～30 d，處理組1、2的丙酸含量顯著高于處理組0，（P＜0.05）。第15天，處理組1、2較處理組0分別提高了365.62%、356.86%（P＜0.05），其他時(shí)間段處理組1、2差異不顯著（P＞0.05）。

表7 不同貯存時(shí)間TMR營養(yǎng)成分的變化情況mmol/L

3 討論

TMR的感官評定是其質(zhì)量評估的重要手段。本試驗(yàn)各組TMR存放的時(shí)間越長、酸味越重，內(nèi)外顏色差異明顯，且三種霉菌毒素也呈上升趨勢。其中未處理的TMR在30 d，有部分結(jié)塊，外周白色絲狀量霉點(diǎn)，已檢測出黃曲霉毒素超標(biāo)，與Woolford（1990）研究結(jié)果相似，說明米曲霉毒素及啤酒酵母均可抑制霉菌毒素。徐丹等（2012）通過共培養(yǎng)體系證實(shí)米曲霉對產(chǎn)毒黃曲霉有降解作用。Joannis等（2011）研究表明，啤酒酵母細(xì)胞壁能夠不同程度的吸附玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素。

國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道，TMR中添加復(fù)合微生物制劑能夠提高其發(fā)酵后的有氧穩(wěn)定性，降低pH值，延緩銨態(tài)氮上升。其機(jī)制可歸結(jié)如下:（1）有益微生物在TMR厭氧發(fā)酵時(shí)，其代謝物中有機(jī)酸的分泌促使pH下降，抑制不耐酸有害菌繁殖。此外，非酸類代謝物如釀酒酵母分泌的乙醇等也能夠抑制有害菌增殖（林麗芳，2010）。（2）TMR在耗氧環(huán)境時(shí)，一般認(rèn)為酵母菌＞1×105cfu/g·FM時(shí)，經(jīng)過梭菌等有害微生物對乳酸等有機(jī)酸和可溶性碳水化合物為底物發(fā)酵，釋放二氧化碳和能量，致使TMR腐敗變質(zhì)（Filya和Sucu，2010），而復(fù)合微生物可與有害微生物競爭底物，降低不利影響從而延長TMR穩(wěn)定性（張莉，2012）。（3）復(fù)合微生物的添加能降解、吸附發(fā)酵初期有害菌的代謝物（Kankaanp??等，2010），這可能是減少有害菌發(fā)酵的誘導(dǎo)因素之一。TMR在pH接近4，銨態(tài)氮含量不超過干物質(zhì)10%條件下，其發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性均較好（王慧麗，2015；Weinberg等，2003）。本試驗(yàn)添加米曲霉、酵母菌和白蟻腸道分解菌達(dá)到了上述效果。其原因可能是一方面纖維降解菌可為米曲霉和啤酒酵母提供可溶性碳水化合物從而促進(jìn)發(fā)酵，另一方面米曲霉代謝物曲酸、酵母菌代謝物乙醇可抑制梭菌對蛋白的降解。

DM、CP、ADF、NDF為TMR的重要營養(yǎng)指標(biāo)，研究表明，TMR短期發(fā)酵，DM和CP較貯前低，這可能是微生物分泌蛋白酶在降解植物蛋白時(shí)還能將一部分真蛋白降解為有益非蛋白氮，如氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也可將營養(yǎng)物質(zhì)水解，進(jìn)一步導(dǎo)致DM下降（管武太等，2002；吳彥奇等，1995）。本試驗(yàn)7～30 d，添加復(fù)合微生物制劑的TMR中DM、CP呈下降趨勢，且都顯著高于對照未添加組。這與Kim等（2011）研究結(jié)果一致，王啟芝等（2016）利用米曲霉對桂閩引象草進(jìn)行青貯發(fā)酵，其DM、CP含量也顯著高于未添加米曲霉的對照組。導(dǎo)致這樣結(jié)果可能是米曲霉和酵母菌抑制了有害菌對蛋白的降解，同時(shí)添加復(fù)合菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的菌體蛋白減緩了總CP、DM的降解。本研究證實(shí)，米曲霉和白蟻腸道纖維降解菌組合可更有效的降解纖維素、半纖維素。馬光和郭繼平（2010）、Wang等（2010）與本研究結(jié)果一致。米曲霉和白蟻腸道纖維降解菌分別是降解纖維的真菌和細(xì)菌，一方面其代謝產(chǎn)生的纖維酶更加多元化，能更好的促進(jìn)纖維酶的協(xié)同效應(yīng)（Kim等，2011），另一方面酵母菌的有氧呼吸能迅速消耗氧氣從而為纖維素分解菌的發(fā)酵提供有利的厭氧環(huán)境。

本試驗(yàn)中TMR未檢測出丁酸，證明米曲霉和酵母菌分別與白蟻腸道纖維降解菌的組合效應(yīng)對酪酸菌等腐敗菌產(chǎn)丁酸有抑制所用。陳雷等（2015）、趙政等（2009）、Taylor等（2002）均研究表明，添加微生物制劑對TMR產(chǎn)丁酸有抑制作用。Shao等（2002）研究表明，青貯飼料隨貯存時(shí)間延長乙酸、丙酸含量呈上升趨勢，本試驗(yàn)中，添加復(fù)合微生物可增加乙酸丙酸的積累（15 d較復(fù)合微生物組乙酸含量高出0.7倍以上，丙酸含量高出3.5倍以上）可能是因?yàn)榍噘A貯存早期好氧微生物發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸和丙酸。在TMR貯存后期，飼料原料中的異型乳酸發(fā)酵逐漸占主導(dǎo)優(yōu)勢從而生成部分乙酸、丙酸，其原因是米曲霉及白蟻腸道纖維分解菌能分泌多種纖維分解酶，將纖維降解為葡萄糖，為飼料初始原料中的異型乳酸菌提供更多底物和碳源。

4 結(jié)論

TMR中添加米曲霉、酵母菌和白蟻腸道纖維分解菌可提高飼料有氧穩(wěn)定性，延長TMR貯存時(shí)間。從黃曲霉毒素B1、pH、NH3-N及NDF變化看，米曲霉與白蟻腸道纖維分解菌有累加效應(yīng)。

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The aim of this study was to investigate the influence of total mixed ration（TMR）supplied compound microbial on its storage period and nutrition level.According to the different compound microbial supplied，3 treatment groups were designed（with 6 replicates in each groups and 1 tanker of diet per replicate）.Treatment 0 was basal TMR，treatment 1 was TMR with 0.5%compound microbial supplement（Saccharomyces cerevisiae and Fiber decomposing bacteria），treatment 2 was TMR with 0.5%supplement（Aspergillusoryzae and Fiber decomposing bacteria）.The addition ratio of two probiotics was 1∶1.This experiment lasted for 30 days.The water content of three treatments was 50%and airtight preservation. Samples obtained at 0，3，5，7，15 and 30 d.Organoleptic investigation，mycotoxins，pH，ammonium nitrogen，aerobic stability and nutrient content were determined and analyzed.The results showed as follows:（1）During the 0～30 d period，the content of mycotoxins showed an upward trend and aflatoxin of treatment 0 exceeded and other groups were not exceeded at each time.（2）In 0～30 d，pH value was decreased，the pH value of 7 d in treatment 2 was significantly higher than treatment 1（P＜0.05）.（3）In the whole experiment period，ammonium nitrogen content of treatment 2 was higher than treatment 1（P＞0.05）.（4）Aerobic stability and storage time were positively correlated，the aerobic stability of treatment 1 was better than other treatments.（5）During the process of 7～30 d，the dry matter content of treatment 2 was significantly higher than treatment 1（P＜0.05）.（6）The contents of acid detevgent fibre（ADF）and neutral detevgent fibre（NDF）of treatment 0 was significantly lower than other treatments（P＜0.05），and there was no significant difference between treatment 1 and 2（P＞0.05）.（7）The content of volatile fatty acid was also positively correlated with storage time.In 3～30 d，compared with the treatment 1 and 2，acetic acid content of treatment 0 descended significantly（P＜0.05），5～30 d，the propanoic acid content in treatment 0 was significantly lower than the others two groups（P＜0.05）.The day of 15th，compared with the treatment 0，2，the acetic acid content in treatment 1 were increased by 111.08%，34.27%（P＜0.05），and compared with the treatment 0，the propionic acid in treatment 1，2 were increased by 365.62%，356.86%.In conclusion，supplementation of Aspergillusoryae，Saccharomyces cerevisiae and Termite intestinal decomposing bacteria could improve the aerobic stability and nutritional quality of TMR.By analyzed pH，NH3-N，NDF，acetic acid and propionic acid，Aspergillusoryae and Termite intestinal decomposing bacteria showed accumulated effect.

total mixed ration；Aspergillusoryae；Saccharomyces cerevisiae；Fiber decomposing bacteria

S816.9

A

1004-3314（2017）13-0027-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171307

*通訊作者