魏忠寶，馬 蕾，劉 舒，劉志強(qiáng)，石 毅，曲曉波

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130022；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

Hela細(xì)胞增殖抑制模型結(jié)合離心超濾質(zhì)譜篩選中藥抗癌藥物

魏忠寶1，馬 蕾2，劉 舒2，劉志強(qiáng)2，石 毅3，曲曉波1

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130022；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

采用基于MTT比色法的Hela細(xì)胞增殖抑制模型評(píng)價(jià)中藥提取物的抗癌活性，并利用離心超濾質(zhì)譜方法對(duì)活性最強(qiáng)的中藥提取物中抗癌活性成分進(jìn)行篩選和鑒定。結(jié)果表明，長(zhǎng)春花提取物對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制活性最強(qiáng)，與陽(yáng)性對(duì)照藥阿霉素相當(dāng)，且抑制活性與給藥濃度呈正相關(guān)。延胡索提取物在3個(gè)不同給藥濃度下也可以顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖。三尖杉、黃連和喜樹(shù)果提取物在高濃度時(shí)能夠顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖，而刺五加提取物則沒(méi)有明顯抑制作用。利用離心超濾質(zhì)譜從長(zhǎng)春花提取物中篩選得到2種存活素基因啟動(dòng)子片段結(jié)合劑和6種鈣調(diào)蛋白結(jié)合劑，經(jīng)多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定，分別為蛇根堿、雞骨常山堿、它波寧、環(huán)氧長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和21’-氧代環(huán)氧長(zhǎng)春堿。本研究可為中藥抗癌藥物的篩選提供一種簡(jiǎn)便、快速的方法。

離心超濾質(zhì)譜；Hela細(xì)胞；中藥；篩選；抗癌

中草藥具有資源豐富、作用溫和以及抗腫瘤療效確切等特點(diǎn)，已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[1-2]。然而，中藥資源庫(kù)龐大、中藥化學(xué)成分復(fù)雜，并且其藥效的發(fā)揮往往是多個(gè)活性成分作用于不同的生物靶分子的共同結(jié)果，如何有效、快速篩選并鑒定抗癌活性成分已成為目前研究中藥抗癌藥物亟待解決的問(wèn)題之一。充分利用現(xiàn)代腫瘤學(xué)的研究成果并結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)，建立科學(xué)合理的抗腫瘤藥物篩選模型和高效可靠的方法，是研制療效好、作用機(jī)理清楚的中藥抗腫瘤新藥的唯一途徑。

質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高選擇性和應(yīng)用快捷等優(yōu)點(diǎn)，在中藥復(fù)雜體系研究中得到了廣泛應(yīng)用[3-4]，尤其與其他分離分析技術(shù)的聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥復(fù)雜體系中活性成分的快速篩選和鑒定[5]。其中，離心超濾質(zhì)譜技術(shù)常用于研究小分子藥物與生物靶分子之間的相互作用，主要原理是將藥物與生物靶分子混合，得到活性分子—生物靶分子復(fù)合物和游離的非活性小分子混合溶液，將混合溶液置于可以按分子質(zhì)量不同截留部分化合物的超濾管中，通過(guò)離心使生物靶分子及其復(fù)合物被膜擋在一側(cè)，游離態(tài)的小分子則自由通過(guò)超濾膜，實(shí)現(xiàn)活性分子與非活性分子的分離，然后，利用LC/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)這些活性分子進(jìn)行分離和鑒別。該方法應(yīng)用簡(jiǎn)單、操作便捷，可以針對(duì)與疾病相關(guān)的生物靶分子，從復(fù)雜體系中快速篩選得到活性成分，同時(shí)借助質(zhì)譜強(qiáng)大的定性能力對(duì)活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。該方法已被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系活性成分篩選研究[6-7]。

本研究擬采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽比色法(MTT比色法)考察中藥提取物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用[8]，對(duì)其抗癌活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。然后，選取與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的存活素基因啟動(dòng)子DNA片段和鈣調(diào)蛋白作為靶點(diǎn)[9-12]，利用離心超濾質(zhì)譜法對(duì)抑制活性最強(qiáng)的中藥提取物進(jìn)行活性成分的進(jìn)一步篩選與鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與裝置

LTQ XLTM線性離子阱質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Waters H-Class超高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有光電二級(jí)陣列管檢測(cè)器和Empower色譜工作站；Eppendorf 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；GENios酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司產(chǎn)品；Cary50紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)：江蘇安泰公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

Hela細(xì)胞株：由中科院細(xì)胞庫(kù)提供；合成存活素基因啟動(dòng)子片段(MW 8526.5 Da)對(duì)應(yīng)的兩條單鏈DNA序列為5’-ACGCGGCGGGAGGA-3’和5’-TCCTCCCGCCGCGT-3’：大連寶生物工程有限公司合成；鈣調(diào)蛋白(MW 16 792 u)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；阿霉素單體：浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；長(zhǎng)春花、三尖杉、延胡索、黃連和刺五加：購(gòu)于同仁堂長(zhǎng)春藥店；喜樹(shù)果：中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；PRMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液：美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清：杭州四季青公司產(chǎn)品；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；24和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó)Falcon公司產(chǎn)品；YM-3超濾膜(截留分子質(zhì)量為3 ku，超濾膜材質(zhì)為再生纖維素)：美國(guó)Millipore公司Amicon Ultra-0.5系列產(chǎn)品；醋酸銨和醋酸鈣：均為色譜級(jí)，美國(guó)Fluka公司產(chǎn)品；甲醇：色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Chemical公司產(chǎn)品；純凈水：經(jīng)美國(guó)Milli-Q水處理系統(tǒng)純化。

1.3樣品制備

1.3.1中藥提取物制備 稱取2 g干燥的中藥材粉末，加入20 mL 75%乙醇-水溶液，室溫超聲提取40 min。然后，取上清液置于40 ℃水浴中，氮?dú)獯蹈?，?00 μL DMSO溶解并用水定容至5 mL，得到生藥含量為0.4 g/mL提取液。過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜制得的儲(chǔ)備液于4 ℃保存，備用。

1.3.2雙鏈DNA的合成 將單鏈DNA分子分別溶于Milli-Q水中，配制成2 mmol/L儲(chǔ)備液。分別取100 μL含兩條互補(bǔ)單鏈DNA分子的溶液于200 μL 100 mmol/L醋酸銨溶液中混合，90 ℃下保持15 min，然后緩慢冷卻至室溫并過(guò)夜，即退火形成濃度為500 μmol/L雙鏈DNA溶液。

1.3.3鈣調(diào)蛋白配制 將鈣調(diào)蛋白加少量Milli-Q水溶解，鈣調(diào)蛋白濃度通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定并調(diào)整至180 μmol/L，其濃度根據(jù)ε280nm=3 300 L·mol-1·cm-1確定，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將20 μL不含鈣離子的鈣調(diào)蛋白儲(chǔ)備液用80 μL 12.5 mmol/L醋酸鈣-62.5 mmol/L醋酸銨溶液稀釋，于25 ℃水浴中反應(yīng)10 min，得到終濃度為36 μmol/L鈣離子和鈣調(diào)蛋白(Ca2+·CaM)復(fù)合物溶液。

1.4實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：迪馬C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.5%醋酸水溶液；流動(dòng)相流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0～15 min(10%～24%A)；15～30 min(24%～100%A)；30～60 min(100%A)。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，正離子全掃描模式，掃描范圍m/z100～1 000；噴霧電壓：4.5 kV；毛細(xì)管溫度：240 ℃；鞘氣和輔助氣均為N2，流速分別為27 L/h和90 L/h；碰撞氣為He；碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)條件：串聯(lián)能量25 eV，碰撞時(shí)間30 ms；采用Thermo公司Xcalibur1.2軟件采集并處理數(shù)據(jù)。

1.5MTT比色法考察中藥提取物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用

取100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的濃度接種到96孔培養(yǎng)皿中，過(guò)夜培養(yǎng)24 h后，分別加入80 μL阿霉素和中藥提取物，使其終濃度分別為0.75、1.5、3.0 g/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔(共6組平行實(shí)驗(yàn))。未加藥物的細(xì)胞作為對(duì)照組，培養(yǎng)基作為空白調(diào)零孔。分別培養(yǎng)24 h后，加入20 μL濃度為5 g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，舍棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，酶標(biāo)儀或者培養(yǎng)箱中低速振蕩10 min，使結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度A值。測(cè)定時(shí)，用空白孔調(diào)零。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±SD)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

1.6離心超濾質(zhì)譜篩選

離心超濾質(zhì)譜法主要通過(guò)比較靶分子加入前后，溶液中游離的藥物成分的濃度變化來(lái)推斷藥物與靶分子的結(jié)合程度。加入靶分子后，游離藥物的濃度降低程度越大，藥物與靶分子的作用力越強(qiáng)。由于色譜峰積分面積與其在溶液中的濃度成正比，故可以利用色譜峰積分面積在生物靶分子加入前后的變化程度來(lái)反映其對(duì)應(yīng)的化合物與生物靶分子的結(jié)合程度。假設(shè)對(duì)照組(不加靶分子)藥物的色譜峰積分面積為Ac，實(shí)驗(yàn)組(加入靶分子)藥物的色譜峰積分面積為Ae，則藥物與靶分子的結(jié)合強(qiáng)度可表示為：Binding Degree=(Ac-Ae)/Ac。用這種計(jì)算方法對(duì)不同的復(fù)雜體系中各組分與靶分子的相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度進(jìn)行比較。

1.6.1離心超濾質(zhì)譜篩選雙鏈DNA結(jié)合劑

用50 mmol/L醋酸銨溶液將DNA儲(chǔ)備液和長(zhǎng)春花提取物儲(chǔ)備液分別稀釋為25 μmol/L和5 g/L。實(shí)驗(yàn)組為稀釋的DNA靶分子溶液與長(zhǎng)春花提取物溶液，按照體積比4∶1混合，終體積為200 μL。將混合溶液置于25 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，吸取180 μL至超濾管中，以13 000 r/min離心30 min。然后向?yàn)V膜上方加入150 μL 50 mmol/L醋酸銨洗脫溶液，以13 000 r/min離心30 min，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥。凍干后的樣品用60 μL甲醇-水溶液(1∶1，V/V)充分溶解，待LC-MS/MS分析。對(duì)照組不加DNA靶分子，其他溶液條件和處理方法與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.6.2離心超濾質(zhì)譜篩選鈣調(diào)蛋白結(jié)合劑

用含10 mmol/L Ca2+的50 mmol/L醋酸銨溶液將長(zhǎng)春花提取物儲(chǔ)備液稀釋為5 g/L。實(shí)驗(yàn)組為Ca2+·CaM復(fù)合物溶液與長(zhǎng)春花提取物稀釋溶液，按照體積比4∶1混合，終體積為200 μL。將混合溶液置于25 ℃水浴中反應(yīng) 20 min后，吸取100 μL至超濾管中，以13 500 r/min離心30 min。然后向?yàn)V膜上方加入100 μL含10 mmol/L Ca2+的50 mmol/L醋酸銨洗脫溶液，以13 500 r/min離心30 min，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥。凍干后的樣品用40 μL甲醇-水溶液(1∶1，V/V)充分溶解，待LC-MS/MS分析。對(duì)照組不加Ca2+·CaM復(fù)合物，其他溶液條件和處理方法與實(shí)驗(yàn)組相同。

2 結(jié)果與討論

2.1中藥提取物對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

分別將長(zhǎng)春花、延胡索、三尖杉、喜樹(shù)果、黃連和刺五加等6種中藥提取物在0.75、1.5和3.0 g/L濃度下對(duì)Hela細(xì)胞作用24 h。結(jié)果表明，均對(duì)Hela細(xì)胞增殖有不同程度的抑制作用。其中，長(zhǎng)春花提取物對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制活性最強(qiáng)，濃度為3.0 g/L時(shí)的抑制率為45%，與陽(yáng)性對(duì)照藥阿霉素接近(3.0 g/L時(shí)的抑制率為48.8%)，且抑制活性與給藥濃度呈正相關(guān)；延胡索提取物在3個(gè)不同濃度下也可以顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖；三尖杉、黃連和喜樹(shù)果提取物在高濃度時(shí)能夠顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖；而刺五加提取物則沒(méi)有明顯地抑制作用，結(jié)果示于圖1。

2.2長(zhǎng)春花提取物中雙鏈DNA結(jié)合劑的離心超濾質(zhì)譜篩選

2.2.1離心超濾質(zhì)譜篩選 長(zhǎng)春花提取物與目標(biāo)DNA反應(yīng)，用離心超濾方法將與雙鏈DNA結(jié)合的藥物和未結(jié)合的藥物分離，分別進(jìn)行LC/MSn分析。長(zhǎng)春花提取物與雙鏈DNA作用后的和不加雙鏈DNA對(duì)照組的液相色譜圖示于圖2。當(dāng)提取物中的成分與雙鏈DNA發(fā)生特異性結(jié)合后，對(duì)應(yīng)化合物的峰面積將小于其對(duì)照組。結(jié)果表明，共檢測(cè)到2種化合物可以與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合率分別為40.38%和47.73%。

紫外吸收數(shù)據(jù)顯示，這2種化合物具有類似的紫外吸收峰，即均在247 nm和306 nm有最大紫外吸收，說(shuō)明這2種化合物可能具有相似的母核結(jié)構(gòu)。

注：*代表P<0.05 vs對(duì)照組，**代表P<0.01 vs對(duì)照組圖1 6種中藥提取物在3種濃度下對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制率 (Mean±SD,n=6)Fig.1 Inhibition rates of 6 kinds of Chinese herbal extracts on Hela cell proliferation at three different concentrations (Mean±SD, n=6)

圖2 長(zhǎng)春花提取物經(jīng)過(guò)雙鏈DNA結(jié)合劑篩選之后的液相色譜圖Fig.2 Ultrafiltration HPLC chromatogram of the extracts from Catharanthus roseus

2.2.2活性成分的LC/MSn鑒定 在電噴霧質(zhì)譜正離子掃描模式下，化合物1的全掃描質(zhì)譜圖、m/z349二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖、m/z317和m/z263三級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖3?；衔?和 2的準(zhǔn)分子離子均為m/z349，由此判斷，這2個(gè)化合物互為同分異構(gòu)體，且根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量信息，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，初步判定它們可能分別為蛇根堿和雞骨常山堿[11]。為了確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，分別對(duì)這2個(gè)化合物進(jìn)行了串聯(lián)質(zhì)譜研究。結(jié)果顯示，它們具有相同的碎裂規(guī)律。m/z349離子在串聯(lián)質(zhì)譜中得到的主要碎片離子為m/z317和m/z263，即準(zhǔn)分子離子峰丟失質(zhì)量數(shù)為32 u(CH4O)和86 u(C4H6O2)的碎片。繼續(xù)對(duì)碎片離子m/z317和m/z263進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，m/z317離子碎裂主要產(chǎn)生m/z289、263、271、247等碎片離子。m/z263離子碎裂主要產(chǎn)生m/z261、235、205等碎片離子。根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜分析，推測(cè)化合物1和2分別為蛇根堿和雞骨常山堿。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛇根堿和雞骨常山堿在液相色譜中難以分離，且相比之下，蛇根堿的出峰時(shí)間較早。因此，化合物1可能為蛇根堿，化合物2可能為雞骨常山堿[13]?；衔?可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖4。

圖3 化合物1的全掃描質(zhì)譜圖(a)、m/z 349二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖(b)、m/z 317(c)和m/z 263(d)三級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 Full mass spectrum of compound 1 (a), MS2 spectrum of m/z 349 (b), MS3 spectrum of m/z 317 (c) and m/z 263 (d)

圖4 化合物1可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathways of compound 1

2.3長(zhǎng)春花提取物中鈣調(diào)蛋白結(jié)合劑的離心超濾質(zhì)譜篩選

2.3.1離心超濾質(zhì)譜篩選 利用離心超濾質(zhì)譜技術(shù)考察長(zhǎng)春花提取物中各組分與蛋白靶分子之間的相互作用。提取物與鈣調(diào)蛋白作用后和不加鈣調(diào)蛋白對(duì)照組的液相色譜圖示于圖5。當(dāng)提取物中的成分與靶分子發(fā)生特異性結(jié)合后，對(duì)應(yīng)的化合物峰面積將小于對(duì)照組。結(jié)果表明，共檢測(cè)到6種化合物可以與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，其結(jié)合率分別為32.32%、34.41%、17.95%、3.13%、20.04%和46.00%。

2.3.2活性成分的LC/MSn鑒定 在電噴霧質(zhì)譜正離子掃描模式下，這6種化合物按照出峰順序?qū)?yīng)的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z349、349、337、810、825和823。為確定化合物結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行了串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果列于表1。

化合物1和2的鑒定參照2.2.2節(jié)。化合物3在串聯(lián)質(zhì)譜中丟失32 u和60 u產(chǎn)生m/z305(100%)和m/z277特征碎片離子，分別對(duì)應(yīng)丟失中性分子CH3OH和HCO2CH3。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，這與它波寧的串聯(lián)質(zhì)譜規(guī)律是一致的，因而推測(cè)該化合物可能為它波寧[14]。

在電噴霧正離子掃描模式下，化合物4、5和6的準(zhǔn)分子離子峰均為[M+H]+和[M+K]+離子。串聯(lián)質(zhì)譜中均存在丟失最小分子質(zhì)量18 u的碎片離子，即丟失1分子的H2O，說(shuō)明它們均含有-OH基團(tuán)。同時(shí)，其丟失60 u產(chǎn)生的碎片離子豐度最高，即丟失HCO2CH3，對(duì)應(yīng)的碎片離子分別為m/z749、765、763，說(shuō)明它們均含有-OCOCH3基團(tuán)。最為重要的是，化合物4、5和6在串聯(lián)質(zhì)譜中均存在開(kāi)環(huán)碎裂(碎片離子分別為m/z540、556、554)和丟失一分子吲哚生物堿(碎片離子分別為m/z353、355、367)的特征碎片離子，示于圖6。這種特征碎片離子與其母核結(jié)構(gòu)和取代基密切相關(guān)。由串聯(lián)質(zhì)譜規(guī)律可知，這3個(gè)化合物有類似的母核結(jié)構(gòu)，其差別在于取代基。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，推測(cè)化合物4、5和6分別為環(huán)氧長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和21’-氧代環(huán)氧長(zhǎng)春堿[14]。

圖5 長(zhǎng)春花提取物經(jīng)過(guò)鈣調(diào)蛋白結(jié)合劑篩選之后的液相色譜圖Fig.5 Ultrafiltration HPLC chromatograms of the extracts from Catharanthus roseus

表1 長(zhǎng)春花提取物中鈣調(diào)蛋白結(jié)合劑的質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectrometry information of calmodulin binders screened from Catharanthus Roseus extract

圖6 化合物4 (a), 5 (b)和6 (c)的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖及特征離子碎裂途徑Fig.6 MS2 spectrum and fragmentation pathways of compound 4 (a), 5 (b) and 6 (c)

3 結(jié)論

本研究基于MTT比色法，采用Hela細(xì)胞增殖抑制模型，并結(jié)合離心超濾質(zhì)譜方法，建立了中藥抗癌藥物的篩選及其活性成分鑒定方法。結(jié)果顯示，在篩選的6種中藥提取物中，長(zhǎng)春花提取物抑制Hela細(xì)胞增殖的活性最強(qiáng)。利用離心超濾質(zhì)譜方法對(duì)長(zhǎng)春花提取物中的抗癌活性成分進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定，結(jié)果表明，長(zhǎng)春花中含量較高的2種成分——蛇根堿和雞骨常山堿與存活素基因啟動(dòng)子片段和鈣調(diào)蛋白均有較強(qiáng)的作用。該結(jié)果有助于探討長(zhǎng)春花提取物的抗癌活性成分及可能的作用機(jī)制。本研究方法的建立，不僅可以對(duì)中藥資源庫(kù)中具有抗癌活性的中藥進(jìn)行快速篩選，并且有助于發(fā)現(xiàn)其中主要的活性成分和可能的作用機(jī)制，為中藥抗癌藥物的篩選提供了一種簡(jiǎn)便、快速的方法。

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InvitroScreeningofAnti-CancerAgentsfromTraditionalChineseMedicineUsingtheHelaCellProliferationInhibitionModelCoupledwithCentrifugalUltrafiltrationMassSpectrometry

WEI Zhong-bao1, MA Lei2, LIU Shu2, LIU Zhi-qiang2, SHI Yi3, QU Xiao-bo1

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China; 2.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China; 3.SchoolofPharmaceuticalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China)

The Traditional Chinese medicine (TCM) has the characteristics of abundant resources, mild effect, and good anti-cancer effect, so research and development of anti-cancer drugs from TCM has become a hot spot. However, because the TCM extract has complex components and the pharmacological effects of TCM are usually a result of the cooperation of the multiple bioactive components binding to different biological targets, it was difficult to clarify the mechanism and foundation of the bioactivities of TCM. In this study, the Hela cell proliferation inhibition model coupled with centrifugal ultrafiltration mass spectrometry was established to screen the anti-cancer agents from TCM. Firstly, the antiproliferative effect of TCM extracts on the Hela cell lines was investigated by the MTT colorimetric method. And then, the promoter DNA of survivin gene and the protein calmodulin were selected as the cancer-related biological targets and the centrifugal ultrafiltration mass spectrometry method was used to screen and identify active components acting on the selected targets from strongest active extracts. The results showed thatCatharanthusRoseusextract had the strongest inhibitory activity on Hela cell proliferation and the inhibitory activity was positively correlated to the concentration.RhizomaCorydalisextract also had significant inhibitory activity on Hela cell proliferation at three different concentrations.FoliumetRamulusCephalotaxi,RhizomaPicrorhizaeandFructusCamptothecaeAcuminataeextracts could significantly inhibit the Hela cell proliferation at high concentrations, whileAcanthopanaxSenticosusextract had no significant inhibitory effect on the Hela cell proliferation. Two binders of promoter DNA of survivin gene were screened fromCatharanthusRoseusextract by centrifugal ultrafiltration mass spectrometry, and they were identified as serpentine and alstonine by multiple tandem mass spectrometry. Six binders of protein calmodulin were screened fromCatharanthusRoseusextract and identified as serpentine, alstonine, tabersonine, leurosine, vincristine and 21’-oxo-leurosine. This study demonstrated the promising application of centrifugal ultrafiltration mass spectrometry in the screening of active components from TCM. The results could not only provide scientific references to the mechanism of the anti-cancer effects of the chemical components or the TCM extracts but also provide a rapid, sensitive and powerful platform for screening the bioactive components from TCM by using centrifugal ultrafiltration mass spectrometry.

centrifugal ultrafiltration mass spectrometry; Hela cell lines; traditional Chinese medicine; screen; anti-cancer

2017-01-05;

2017-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21073178)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目——自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101077JC)資助

魏忠寶(1978—)，男(漢族)，吉林敦化人，博士研究生，中藥學(xué)專業(yè)。E-mail: 781639055@qq.com

曲曉波(1955—)，女(漢族)，吉林人，教授，從事中藥學(xué)研究。E-mail: quxiaobo0504@hotmail.com

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0494-09

10.7538/zpxb.2017.0006