婁瀟雨,童群義

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214112)

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超聲波輔助堿液-酶解法對柚皮脫苦效果的研究

婁瀟雨,童群義*

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214112)

在柚皮產(chǎn)品深加工中,為了使柚皮達(dá)到更好的脫苦效果,以柚皮脫苦率為指標(biāo),采用超聲波輔助堿液-酶解法對柚皮進(jìn)行脫苦。經(jīng)單因素和正交實驗得出超聲波輔助堿液法優(yōu)化工藝條件為:料液比1∶30 (g/mL),超聲時間20 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率120 W,所得脫苦率為75.31%。在超聲波優(yōu)化基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗對柚皮進(jìn)行柚苷酶酶解處理,其優(yōu)化條件為:酶添加量0.15%,酶解溫度52 ℃,酶解pH4.1,酶解時間36 min,所得柚皮脫苦率為90.14%。此方法與傳統(tǒng)柚苷酶酶解法相比,具有更高的脫苦效率。

超聲波，柚苷酶，柚皮，脫苦

柚子是蕓香科柑橘屬水果,因其皮厚耐藏,清香誘人,被譽為“天然的水果罐頭”。據(jù)明·李時珍《本草綱目》記載:“柚,功能消食,解酒毒,去腸胃中惡氣,長發(fā)滋燥,療妊婦不思食口淡”。柚皮占整個柚子的43%～48%[1],除含有水分、維生素和礦物質(zhì)這些人體必需的營養(yǎng)素外,還含有多種對人體健康有益的非營養(yǎng)性生理活性成分,其中含有的苦味物質(zhì)如柚皮苷和檸檬苦素,是限制柚皮加工利用的最主要因素。柚皮苷是一種黃酮類化合物,其含量高達(dá)苦味物質(zhì)的80%[2],它的存在導(dǎo)致柚皮產(chǎn)生強烈的“前苦味”[3]。目前國內(nèi)關(guān)于柚皮的脫苦方法主要有以下四種,即利用柚皮苷易溶于堿性溶液的性質(zhì)而進(jìn)行脫苦的鹽堿浸泡法、采用活性炭和大孔吸附樹脂等對苦味物質(zhì)進(jìn)行吸附的吸附脫苦法、β-環(huán)糊精包埋法和柚苷酶酶解法。其中柚苷酶酶解法因其酶解專一性強,反應(yīng)條件溫和、易于控制,對營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的影響較小[4]而得到廣泛應(yīng)用,通常脫苦時間為80～142 min[5-7]。本實驗通過采用超聲波輔助堿液-酶解法對柚皮進(jìn)行脫苦,以期縮短反應(yīng)時間,提高脫苦效率,超聲波輔助堿液-酶解法脫苦技術(shù)依次包含超聲波輔助堿液處理和柚苷酶酶解兩個階段。首先利用柚皮苷在堿性溶液下開環(huán)溶解的性質(zhì)[8],以NaHCO3溶液[9]為脫苦液,在超聲機械效應(yīng)和空化效應(yīng)下,使柚皮結(jié)構(gòu)造成一定程度的松動,加快苦味物質(zhì)的溶出,之后采用柚苷酶進(jìn)一步酶解,達(dá)到去除柚皮大部分苦味物質(zhì)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

琯溪蜜柚 原產(chǎn)地福建省平和縣;柚苷酶(酶活150 U/g) 上海寶豐生化有限公司;柚皮苷(色譜純) 上海金穗生物科技有限公司;食品級碳酸氫鈉 桐柏博源新型化工有限公司;氫氧化鈉(分析純) 江蘇常陵化學(xué)試劑廠;檸檬酸(分析純) 江蘇常陵化學(xué)試劑廠;一縮二乙二醇(化學(xué)純) 江蘇常陵化學(xué)試劑廠。

KQ3200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;HH-2k8型恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司;DZF型真空干燥箱 上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司;SF-100型不銹鋼高速粉碎機 上海船浜制藥粉碎設(shè)備廠;UV-2100紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚皮脫苦方法 柚子清洗→柚皮切片→超聲波輔助堿液法→沖洗瀝干→柚苷酶酶解法

1.2.2 柚皮苷含量測定 采用戴維斯(Davis)[10]法對柚皮中柚皮苷含量進(jìn)行測定。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 將標(biāo)準(zhǔn)柚皮苷在110 ℃干燥至恒重,稱取20.00 mg,添加20 mL 0.1 mol/L NaOH,用4 mol/L NaOH調(diào)pH至12,浸泡30 min后,再用20%檸檬酸溶液調(diào)pH至6,加水定容至100 mL,得柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液,于6支具塞試管中,分別添加試劑空白液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL,再各加5 mL 90%一縮二乙二醇和0.1 mL 4 mol/L NaOH,置于40 ℃恒溫水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min,然后立即注入1 cm比色皿中,在420 nm波長處測吸光度,以吸光值對柚皮苷濃度作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為y=0.0657x-0.0021,R2=0.9991。

1.2.2.2 脫苦前樣品處理 新鮮柚皮清洗之后,切成長20～30 mm、寬5～10 mm、厚0.5～1.0 mm的薄片,經(jīng)70 ℃烘干之后粉碎,過100目篩。取一定量的粉末,添加 0.1 mol/L NaOH 20 mL,用4 mol/L NaOH調(diào)pH至12,浸泡30 min后,用20%檸檬酸調(diào)pH至6,加水定容至100 mL。經(jīng)濾紙過濾,收集澄清液為樣液,待測。

1.2.2.3 脫苦后樣品處理 柚皮脫苦之后清洗瀝干,經(jīng)70 ℃烘干之后粉碎,過100目篩,之后步驟同1.2.2.2。

1.2.2.4 樣品測定 精確吸取樣液3 mL于2支具塞試管中,加試劑空白液至5 mL,各加5 mL 90%二甘醇,再分別加4 mol/L NaOH 0.0和0.1 mL,搖勻后以標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法進(jìn)行顯色和測定,以加堿管的吸光度減去不加堿管中的吸光值,經(jīng)查找標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得所取樣液中柚皮苷含量毫克數(shù)。

1.2.2.5 脫苦率計算 采用以下公式計算:

柚皮脫苦率(%)=(脫苦前柚皮苷含量-脫苦后柚皮苷含量)/脫苦前柚皮苷含量×100

1.2.3 超聲波輔助堿液法柚皮脫苦工藝條件優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 以柚皮脫苦率為指標(biāo),結(jié)合柚皮感官性狀,考察超聲波料液比(g/mL)、超聲時間(min)、超聲溫度(℃)和超聲功率(W)4個因素(對柚皮脫苦效果的影響,以確定后續(xù)正交實驗各因素水平。

料液比:分別稱取5.0 g切好的柚皮于5個燒杯中,分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)加入2% NaHCO3,在超聲功率105 W,超聲時間20 min,超聲溫度50 ℃下,對柚皮進(jìn)行脫苦。

超聲時間:分別稱取5.0 g切好的柚皮于5個燒杯中,添加料液比為1∶30 (g/mL),超聲功率105 W,超聲溫度50 ℃,超聲時間為別為10、20、30、40、50 min,對柚皮進(jìn)行脫苦。

超聲溫度:分別稱取5.0 g切好的柚皮于5個燒杯中,添加料液比為1∶30 (g/mL),超聲功率105 W,超聲時間20 min,超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,對柚皮進(jìn)行脫苦。

超聲功率:分別稱取5.0 g切好的柚皮于5個燒杯中,添加料液比為1∶30 (g/mL),超聲時間20 min,超聲溫度50 ℃,超聲功率分別為90、105、120、135、150 W,對柚皮進(jìn)行脫苦。

1.2.3.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用正交實驗對超聲脫苦工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表見表1。

表1 超聲波正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of ultrasonic pretreatment

1.2.4 柚苷酶酶解法條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗 柚皮經(jīng)超聲波輔助堿液法最佳工藝處理后,將柚皮沖水瀝干,進(jìn)一步運用柚苷酶酶解法進(jìn)行脫苦處理。以柚皮脫苦率為指標(biāo),結(jié)合柚皮感官性狀,考察柚苷酶添加量(%)、酶解溫度(℃)、酶解pH和酶解時間(min)4個因素對柚皮脫苦效果的影響,以響應(yīng)面優(yōu)化法確定酶解最佳工藝。

柚苷酶添加量:超聲法脫苦之后的柚皮,在酶解pH4.0,酶解溫度55 ℃,酶解時間40 min的條件下,分別研究0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%柚苷酶添加量對柚皮脫苦效果的影響。

酶解溫度:超聲法脫苦之后的柚皮,在柚苷酶添加量0.15%,酶解pH4.0,酶解時間40 min的條件下,分別研究45、50、55、60、65 ℃的酶解溫度對柚皮脫苦效果的影響。

酶解pH:超聲法脫苦之后的柚皮,在柚苷酶添加量0.15%,酶解溫度55 ℃,酶解時間40 min的條件下,分別研究3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的酶解pH對柚皮脫苦效果的影響。

酶解時間:超聲法脫苦之后的柚皮,在柚苷酶添加量0.15%,酶解溫度55 ℃,酶解pH4.0的條件下,分別研究20、30、40、50、60 min的酶解時間對柚皮脫苦效果的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在超聲波輔助堿液處理和酶解單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取主要影響因子,以柚皮脫苦率為響應(yīng)值,運用Design Expert 8.0軟件結(jié)合Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面分析,最終得到優(yōu)化實驗工藝參數(shù),并進(jìn)行驗證性實驗。因素水平表見表2。

表2 柚苷酶酶解Box-Behnken實驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the Box-Behnken for the hydrolysis rate of naringin

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助堿液法柚皮脫苦工藝條件優(yōu)化

2.1.1 料液比對柚皮脫苦率的影響 由圖1可知,柚皮脫苦率隨著料液比的增加而增大,當(dāng)達(dá)到1∶30 (g/mL)時,變化趨于平緩,再增加堿液的量,脫苦率變化很小,且柚皮具有明顯的堿味。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本以及柚皮感官性狀,初步選擇1∶30 (g/mL)的料液比。

圖1 料液比對柚皮脫苦率的影響Fig.1 Effect of material/liquid ratio on removal rate of naringin

2.1.2 超聲處理時間對柚皮脫苦率的影響 如圖2所示,隨著超聲處理時間的延長,柚皮細(xì)胞破壞程度增大,促進(jìn)了柚皮苷和色素的溶出,柚皮脫苦率升高,風(fēng)味變淡,色澤變淺,且堿味越來越明顯。當(dāng)達(dá)到30 min后,柚皮堿味突出,且脫苦率稍有降低,分析原因可能是長時間的超聲波劇烈振動產(chǎn)生的熱效應(yīng)導(dǎo)致溫度過高,在一定程度上減弱了超聲波的空化效應(yīng),使得脫苦率降低[11]。綜合考慮柚皮感官性狀以及脫苦效果,選擇最適超聲時間為20 min,此時所得柚皮具有獨特清香氣味,無異味,感官性狀較好。

圖2 超聲時間對柚皮脫苦率的影響Fig.2 Effect of ultrasound treatment time on removal rate of naringin

圖3 超聲溫度對柚皮脫苦率的影響Fig.3 Effect of ultrasound temperature on removal rate of naringin

2.1.3 超聲處理溫度對柚皮脫苦率的影響 如圖3所示,隨超聲溫度的升高,柚皮脫苦率增大,當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時,脫苦率達(dá)到最高值,隨著溫度的進(jìn)一步升高,脫苦率稍有降低,原因可能是在超聲波熱效應(yīng)的影響下,超聲溫度過高,氣泡中蒸汽壓增大,緩沖作用增強而使超聲波空化作用減弱,從而降低了脫苦率。所以,初步選擇超聲溫度為50 ℃。

2.1.4 超聲功率對柚皮脫苦率的影響 如圖4所示,隨超聲功率增加,超聲機械效應(yīng)增強,柚皮細(xì)胞破壞程度增大,柚皮苷溶出率增加。當(dāng)功率達(dá)到120 W時,脫苦率變化較為緩慢,能耗增加,綜合考慮,選擇超聲功率為120 W。

圖4 超聲功率對柚皮脫苦率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on removal rate of naringin

2.1.5 超聲波輔助堿液法正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用L9(34)進(jìn)行正交實驗,其結(jié)果如表3所示。正交實驗結(jié)果和極差R分析表明,影響柚皮脫苦率的主次因素依次是料液比(A)>超聲時間(B)>超聲功率(D)>超聲溫度(C)。由K值優(yōu)選超聲波脫苦最佳工藝條件為A2B3C3D2,即料液比1∶30 (g/mL),超聲時間20 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率120 W,所得柚皮脫苦率為75.31%。

表3 超聲波正交實驗結(jié)果Table 3 Experimental results for the optimization of ultrasonic pretreatment

2.2 柚苷酶酶解法脫苦工藝條件優(yōu)化

2.2.1 柚苷酶添加量對柚皮脫苦率的影響 由圖5可知,柚苷酶添加量在0.05%～0.15%范圍內(nèi),隨著柚苷酶含量的增加,柚皮脫苦率顯著增大,當(dāng)添加量達(dá)到0.15%時,隨著添加量的進(jìn)一步增加,柚皮脫苦率變化趨于平緩,說明柚苷酶在0.15%時已經(jīng)接近飽和,再增加柚苷酶含量,對柚皮苷含量影響不大,所以從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā),選擇0.15%的柚苷酶添加量。

圖5 柚苷酶添加量對柚皮脫苦率的影響Fig.5 Effect of naringinase concentration on removal rate of naringin

2.2.2 酶解溫度對柚皮脫苦率的影響 由圖6可知,隨著溫度的升高,柚皮脫苦率明顯升高,50 ℃時脫苦率達(dá)到最高值,隨著溫度的進(jìn)一步升高,脫苦率呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由柚苷酶本身蛋白質(zhì)的特性決定的,溫度過高時,會降低柚苷酶的活性,導(dǎo)致脫苦率降低。所以選擇柚苷酶最適酶解溫度為50 ℃。

圖6 酶解溫度對柚皮脫苦率的影響Fig.6 Effect of enzymatic temperature on removal rate of naringin

2.2.3 酶解pH對柚皮脫苦率的影響 如圖7所示,隨著酶解pH的增加,柚皮脫苦率呈現(xiàn)增大的趨勢,當(dāng)pH為4.0時,脫苦率達(dá)到最大值,隨著pH的進(jìn)一步增加,脫苦率開始降低。這是因為pH的變化改變了柚苷酶的空間構(gòu)象而活性降低,從而導(dǎo)致脫苦率下降。所以選擇柚苷酶最適酶解pH為4.0。

圖7 酶解pH對柚皮脫苦率的影響Fig.7 Effect of enzymatic pH on removal rate of naringin

2.2.4 酶解時間對柚皮脫苦率的影響 如圖8所示,隨著酶解時間的增加,柚皮脫苦率逐漸升高,40 min時達(dá)到最大值,在此之后,隨著時間的延長,脫苦率升高緩慢,說明已經(jīng)基本酶解完全,所以選擇最佳酶解時間為40 min。

圖8 酶解時間對柚皮脫苦率的影響Fig.8 Effect of enzymatic time on removal rate of naringin

2.2.5 柚苷酶脫苦法響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.5.1 實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理,綜合單因素實驗結(jié)果,選取柚苷酶添加量(X1)、酶解pH(X2)、酶解溫度(X3)和酶解時間(X4)四個因素,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法,以柚皮脫苦率為響應(yīng)值(Y),共29個實驗點,其中24個為析因點,5個為中心點重復(fù)實驗,以估計誤差。實驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design arrangement and experimental results

表5 方差分析Table 5 Variance analysis for the yield of naringin with various conditions

注:**p<0.01極顯著;*p<0.05顯著。2.2.5.2 回歸模型建立及方差分析 運用Design-expert8.0軟件對表4實驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,建立二次多項式回歸模型。以柚皮脫苦率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程為:

Y=-232.08167-356.33333X1+7.59167X2+64.55667X3+1.095X4+6X1X2+80X1X3+0.21X2X3-0.022X2X4+0.44X3X4-918.66667X12-0.083967X22-11.89667X32-0.029967X42

由表5回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知,柚苷酶酶解脫苦法的工藝參數(shù)中,影響脫苦率的因素按主次順序排列:酶解時間(X4)>酶解溫度(X2)>酶添加量(X1)>酶解pH(X3),其中一次項X2和X4達(dá)到極顯著水平(p<0.01),X1為顯著水平;二次項X22、X32為極顯著水平(p<0.01),其余項均不顯著。

根據(jù)所得回歸方程計算出最優(yōu)工藝條件為:酶添加量0.15%、酶解溫度51.93 ℃、酶解pH4.13、酶解時間35.64 min,在此條件下,柚皮最大脫苦率為92.77%。

2.2.5.3 驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面法Box-Benhnken中心組合實驗優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗證實驗,考慮到實際操作的便利,將最佳工藝條件修正為酶添加量0.15%、酶解溫度52 ℃、酶解pH4.1、酶解時間36 min,在此條件下進(jìn)行3次平行實驗,得柚皮平均脫苦率為90.14%,而回歸方程所得的柚皮脫苦率理論預(yù)測值為92.77%,兩者相對誤差為2.83%,說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)是可靠得,能真實地反映各因素對柚皮脫苦率的影響。

2.3 超聲波輔助堿液-酶解法與傳統(tǒng)柚苷酶脫苦法比較研究

參考前人關(guān)于柚苷酶酶解的實驗研究成果,并在本實驗的基礎(chǔ)上,設(shè)置傳統(tǒng)柚苷酶酶解法的工藝參數(shù)為:酶添加量為0.15%、酶解溫度52 ℃、酶解pH4.1,酶解時間為80 min,并與超聲波輔助堿液-酶解法進(jìn)行脫苦比較,其結(jié)果如圖9所示。由圖可知,酶解80 min后的柚皮,其脫苦率為71.65%,要小于超聲波輔助堿液-酶解法的脫苦率90.14%。實驗表明超聲波輔助堿液-酶解法在柚皮脫苦中的應(yīng)用,可以顯著提高柚皮的脫苦率,比傳統(tǒng)的單一柚苷酶酶解法脫苦效果更好。

圖9 不同脫苦方法比較Fig.9 Comparison of different debittering methods

3 結(jié)論

通過單因素和正交實驗確定超聲波輔助堿液脫苦法的優(yōu)化工藝條件為:料液比1∶30 (g/mL),超聲時間20 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率120 W,所得柚皮脫苦率為75.31%。在此基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗進(jìn)行柚苷酶酶解處理,其優(yōu)化工藝條件為:酶添加量0.15%,酶解溫度52 ℃,酶解pH4.1,酶解時間36 min,柚皮脫苦率為90.14%。超聲波輔助堿液-酶解法與傳統(tǒng)柚苷酶酶解法相比,顯著提高了柚皮脫苦率,縮短了反應(yīng)時間,有利于柚皮產(chǎn)品的深加工。

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Study on effect of debittering shaddock peelby ultrasound-assisted alkaline solution-enzymolysis method

LOU Xiao-yu,TONG Qun-yi*

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214112,China)

The ultrasound-assisted alkaline solution-enzymolysis method,which used removal rate of naringin as the index,was studied to get better debittering effect in the further-processing product of shaddock peel. By single factor experiment and orthogonal experiment,the results showed that the optimum treatment conditions of ultrasound-assisted alkaline solution were obtained as follows:material-to-liquid ratio 1∶30 (g/mL),ultrasonic treatment time 20 min,ultrasonic temperature 55 ℃,ultrasonic power 120 W. Under these optimum conditions,the removal rate of naringin was 75.31%.On this basis,by response surface design,the results showed that 90.14% removal rate of naringin was achieved through the use of naringinase at 0.15%,dosage for 36 min,pH4.1 and 52 ℃. The results of this study indicated that the ultrasound-assisted alkaline solution-enzymolysis method was more effective compared with the traditional naringinase enzymolysis method.

ultrasound;naringinase;shaddock peel;debittering

2016-12-23

婁瀟雨(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：碳水化合物，E-mail:lxy910428@126.com。

*通訊作者:童群義(1963-)，男，博士，教授，研究方向：碳水化合物，E-mail:tqyjn@163.com。

TS255.1

B

1002-0306(2017)13-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.039