張欣達(dá)，張 偉，楊琳燕，李 存

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 西青 300384)

注射器微萃取的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景

張欣達(dá)，張 偉，楊琳燕，李 存

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 西青 300384)

2004年Abdel-Rehim首次提出了注射器微萃取(microextraction by packed sorbent，MEPS)技術(shù)［1］，即用最小量的溶劑反復(fù)多次萃取藥物使其達(dá)到最大回收率。MEPS就是將1 mg左右的固相吸附劑材料填充到100～250μL密閉的注射器里，或者是填充到針管與針頭之間的暗盒內(nèi)［2］。使用自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品通過(guò)注射器，當(dāng)攜帶藥物的樣品通過(guò)吸附劑的時(shí)候，由于分子間作用或免疫親和作用，藥物被填充在注射器內(nèi)的吸附劑捕獲，再經(jīng)過(guò)超純水的洗滌洗去附著的干擾雜質(zhì)，最后用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，洗脫液可直接注入分析儀器中進(jìn)行分析檢測(cè)［3］。因此，MEPS技術(shù)的核心在于吸附劑，目前應(yīng)用最廣泛的MEPS吸附劑材料是經(jīng)過(guò)改良的硅膠基質(zhì)吸附劑，特殊的吸附劑材料比如限介材料，分子印記聚合物(molecularly imprinted Polymer，MIP)或者納米材料都可以填充于 MEPS的暗盒里［4］。

1 MEPS的優(yōu)勢(shì)

MEPS和傳統(tǒng)的固相萃取(solid phase extraction，SPE)技術(shù)原理相同，比SPE更穩(wěn)定，操作更簡(jiǎn)單［5］。MEPS和SPE柱使用相同的吸附劑，與SPE技術(shù)不同的是MEPS吸附劑盒是一個(gè)整體的液體處理注射器，MEPS可以手動(dòng)或者自動(dòng)操作低體積樣品［6］。MEPS僅使用少量的固體相作為吸附劑，因此所需要的樣品體積很少，極大限度的降低了基質(zhì)效應(yīng)，用MEPS方法測(cè)定水中多環(huán)芳香烴含量使用的樣品容量很少，只用1 mL，而攪拌棒微萃取(stir bar sorptive microextraction，SBSE)用10 mL，SPME用30 mL［7］。與SPE相比，MEPS顯著減少了有機(jī)溶劑的使用，符合環(huán)境友好標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也降低了萃取時(shí)間，提高了萃取效率。Aziza E l-Beqqali等人研究發(fā)現(xiàn)同樣用GC-MS測(cè)定水中多環(huán)芳香烴含量，使用MEPS比SBSE減少30～100倍處理時(shí)間［8］。

MEPS可以實(shí)現(xiàn)完全的自動(dòng)化，包括樣品的載入、萃取、洗滌、洗脫、進(jìn)樣和清洗過(guò)程［9］。全自動(dòng)的MEPS可以設(shè)置一定的萃取和洗脫時(shí)溶劑的流速，有效降低手動(dòng)操作帶來(lái)的試驗(yàn)誤差，萃取效果穩(wěn)定，提高試驗(yàn)重現(xiàn)性，可以用于大量樣品的篩查。減少了氮?dú)獯蹈膳c復(fù)溶環(huán)節(jié)，避免了分析物的損失。全自動(dòng)的MEPS儀器精密度高并且界面簡(jiǎn)單，易于操作。

MEPS的吸附劑可以重復(fù)使用50次也不會(huì)損失其萃取性能。樣品基質(zhì)的復(fù)雜程度直接影響吸附劑的使用次數(shù)［10］。Mohamed Abdel-Rehim等人使用MEPS測(cè)定人尿液樣品中羅哌卡因及其代謝物的含量時(shí)所用的吸附劑可正常使用100次［11］。而Aziza E l-Beqqali等人使用的C18作為MEPS吸附劑檢測(cè)水相樣品中多環(huán)芳香烴的含量則可以使用超過(guò)400次［12］。

MEPS有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)全自動(dòng)化，提高重現(xiàn)性;(2)使用有機(jī)溶劑少，符合環(huán)境友好前處理標(biāo)準(zhǔn);(3)操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，降低了篩查成本; (4)使用樣品體積小，降低了基質(zhì)效應(yīng);(5)減少了分析時(shí)間，提高效率;(6)MEPS吸附劑可以重復(fù)使用，節(jié)約成本。

2 MEPS技術(shù)應(yīng)用的局限性

MEPS因其特異性強(qiáng)，選擇性高，靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，日漸成為樣品前處理方法的主流。然而，隨著MEPS在各領(lǐng)域的使用，一些限制也漸漸突出。有些基質(zhì)例如血漿、尿液等，成分復(fù)雜，雜質(zhì)分子量大，可能會(huì)造成吸附劑的堵塞，降低吸附性能。有些雜質(zhì)粘附性強(qiáng)，當(dāng)洗滌不充分時(shí)，會(huì)殘留到洗脫液中，進(jìn)入儀器中分析增加噪音［13］。洗脫次數(shù)，洗脫不完全不僅可以造成本次萃取不充分，還會(huì)影響下一次萃取過(guò)程造成不完全吸附，降低MEPS的性能。一個(gè)完整的MEPS萃取周期，不僅包括萃取解吸過(guò)程還應(yīng)包括清洗程序，因?yàn)镸EPS中的吸附劑是可重復(fù)使用的，所以清洗不充分可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性情況，造成誤差。

MEPS的應(yīng)用有如下幾個(gè)限制因素:(1)基質(zhì)的復(fù)雜性;(2)洗滌效果;(3)洗脫次數(shù);(4)清洗溶液的選擇。

3 提高M(jìn)EPS性能的方法

由于一些使用限制，降低了MEPS的性能，影響了MEPS的推廣與使用，但這些限制不是不可避免的。對(duì)于復(fù)雜的基質(zhì)通常用稀釋的方法降低其濃度，這個(gè)步驟增加了MEPS吸附劑的使用次數(shù)［14］。粘附在注射器內(nèi)的雜質(zhì)，若不能及時(shí)的除去，可能會(huì)進(jìn)入洗脫液中增加基質(zhì)效應(yīng)，因此需要用水多次洗滌，將蛋白質(zhì)等雜質(zhì)洗去，保證吸附劑的可吸附面積。大多數(shù)的吸附劑吸附藥物的原理是疏水鍵和離子間的相互作用，使用有機(jī)溶劑可以破壞疏水鍵，達(dá)到解吸藥物的目的，但由于離子間的相互作用力很大，因此需要反復(fù)洗脫，破壞其離子間的相互作用，使分析物完全洗脫下來(lái)，以提高M(jìn)EPS性能。每萃取一次樣品后，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┓磸?fù)清洗MEPS吸附劑，避免藥物和基質(zhì)殘留。徹底的清洗可以有效的避免本次樣品中的各種物質(zhì)殘留于吸附劑中，提高 MEPS的使用壽命和下次使用的性能［15］。

4 MEPS的應(yīng)用

MEPS技術(shù)不僅可以應(yīng)用于生物樣品(例如人的尿液、唾液、血液、血漿和血清等)前處理還可以萃取環(huán)境樣品(如工業(yè)廢水、土壤)以及食品樣品(如肉、蛋、奶)。MEPS在不同樣品中的應(yīng)用見(jiàn)表1。

表1 MEPS在樣品分析中的應(yīng)用

4.1 生物樣品 生物樣品，含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類(lèi)、氨基酸等化合物，成分復(fù)雜，含量豐富，這些化合物的存在會(huì)嚴(yán)重干擾分析物的檢測(cè)、降低響應(yīng)值還會(huì)對(duì)分析儀器造成污染降低其使用壽命。因此，將分析物從復(fù)雜的生物樣品中分離出來(lái)成為分析檢測(cè)中重要的環(huán)節(jié)。MEPS已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)生物樣品如血漿，尿液中局麻藥，抗癌藥物，抗抑郁藥物及其代謝物的含量。Susheela Rani等人建立了注射器微萃取耦合LC和GC-MS定量檢測(cè)血漿和尿液樣品中抗抑郁藥物含量的方法［16］。采用粒徑為45 nm的二氧化硅-C18作為吸附劑，萃取前先用100μL甲醇和超純水活化吸附劑，然后對(duì)樣品進(jìn)行萃取，萃取周期為10次，萃取后用100μL的超純水進(jìn)行清洗去除蛋白質(zhì)等干擾雜質(zhì)，最后用30μL甲醇洗脫目標(biāo)分析物直接進(jìn)樣分析，在1～500 ng/mL分析物具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R均大于0.981。這些抗抑郁藥物的檢測(cè)區(qū)間在0.088 ng/mL～0.285 ng/mL之間，定量限在0.268 ng/mL～0.608 ng/mL之間，尿液和血漿中加入不同水平的抗抑郁藥的平均回收率是77%～99%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于6.2%。Mohamed Abdel-Rehim等人使用MEPS偶聯(lián)LC-MS/MS量化測(cè)定了人尿液樣品中羅哌卡因及其代謝物的含量。樣品的吸附劑使用的是平均粒徑為50 nm的聚苯乙烯聚合物，檢測(cè)線是5 nmol/L，在5～2 000 nmol/L濃度時(shí)尿液中羅哌卡因呈良好線性關(guān)系，回歸相關(guān)系數(shù)大于0.999，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在1.9%～11%之間。Habib Bagheri等人建立了使用銀納米顆粒-聚苯胺納米復(fù)合材料作為MEPS的吸附劑來(lái)萃取尿液中利尿劑呋塞米的方法［17］。呋塞米濃度為15～750μg/L時(shí)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99，在最優(yōu)化的條件下相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于8.8%。檢測(cè)線和定量限分別是7μg/L和 15μg/L。Mohamed Abdel-Rehim使用MEPS連接LC-MS檢測(cè)人血漿種羅哌卡因及其代謝產(chǎn)物并比較了使用不同的吸附劑的吸附效果，結(jié)果顯示，C2作為吸附劑時(shí)，目標(biāo)分析物的回收率最大可達(dá)60%，其次是C8和C18，以聚合物作為吸附劑時(shí)回收率僅有40%。

4.2 環(huán)境樣品 MEPS還可以作為環(huán)境樣品的前處理方法，例如河水、地下水和土壤等。環(huán)境樣品的來(lái)源復(fù)雜，因其不確定性增加了分離的難度，因而要選擇特異性強(qiáng)的前處理方法。Habib Bagheri等人建立了以聚吡咯納米網(wǎng)狀物作為吸附劑填充到注射器中來(lái)測(cè)定河水中乙草胺的方法［18］。先將0.91 g的十六烷基三甲基溴化銨、0.85 g的檸檬酸和0.27 mL的吡咯溶于125 mL去離子水中在15℃下攪拌3 h，再加入過(guò)硫酸銨水溶液在15℃下攪拌4 h，所得產(chǎn)物用蒸餾水和甲醇重復(fù)洗滌，最后在40℃下干燥24 h制備出聚吡咯吸附劑。取2 mg制備好的聚吡咯裝入1 mL注射器內(nèi)制成注射器微萃取裝置，用該聚吡咯注射器微萃取對(duì)河水內(nèi)的乙草胺進(jìn)行萃取，在萃取周期為25次，流速為10μL/s，洗脫溶劑為150μL的乙腈時(shí)，這種方法的檢出限為0.02～0.05 ng/mL，在乙草胺的濃度為5 ng/mL時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是7% ～10%，日間變異系數(shù)為10%～12%。乙草胺的濃度在0.5～500 ng/mL范圍顯示出良好的線性關(guān)系。Aziza El-Beqqali等人研發(fā)了一種快速靈敏的MEPS與在線GC連接測(cè)定水中的多環(huán)芳香烴含量的方法［19］。以二氧化硅－C8為吸附劑，萃取周期為60次，洗脫溶液為30μL甲醇，萃取時(shí)間僅為2min。當(dāng)濃度5～1 000 ng/L范圍內(nèi)顯示出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) R大于0.998，回收率為 70%，該檢測(cè)方法的精確度在90%～113%之間，日間變異系數(shù)8%～16%。這個(gè)方法對(duì)其他化合物比如農(nóng)藥、除草劑酚類(lèi)藥物也有效用。Jakub Schurek等人建立了一種應(yīng)用MEPS偶聯(lián)GC-TOF-MS檢測(cè)廢水中溴化阻燃劑的方法，該方法是將1 mg二氧化硅－C18填充到注射器中作為吸附劑，萃取周期為50次最后用15μL的異辛烷洗脫直接注入到GC中進(jìn)行檢測(cè)分析［20］。該方法的檢測(cè)限范圍是0.5～9.5 ng/L，定量限為100 ng/L，回收率為70%。

4.3 食品樣品 在提出MEPS的十多年里，僅有少數(shù)的幾次將MEPS應(yīng)用于食品的檢測(cè)。MEPS曾被用于測(cè)定葡萄和葡萄制品(葡萄汁和葡萄酒等)中褪黑激素和其他吲哚、酚類(lèi)抗氧化劑的含量［21］。Wei Du等人報(bào)道了用分子印記聚合物作為MEPS的吸附劑連接HPLC檢測(cè)豬肉樣品中鹽酸克倫特羅(clenbuterol，CLB)的含量的方法。通過(guò)溶膠-凝膠方法將硅膠粒子合成分子印記聚合物，取4 mg填充到1 mL胰島素注射器中，兩端用聚乙烯篩板填充即制成注射器微萃取裝置［22］。使用前先用2 mL的甲醇和2 mL的水活化吸附劑，然后以50μL/s的速率反復(fù)抽吸300μL CLB標(biāo)準(zhǔn)液25次，隨后用300μL的洗滌液(乙腈∶水=1∶1)洗滌，用500μL洗脫液(甲醇∶鹽酸=90∶10)進(jìn)行洗脫。取洗脫液用氮?dú)獯蹈珊蠹?0μL流動(dòng)相復(fù)溶進(jìn)樣檢測(cè)。方法的定量限和檢測(cè)限分別是0.02μg/kg和0.009μg/kg，3個(gè)水平加標(biāo)樣品的平均回收率在86.5% ～91.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.3%。使用后的注射器用300μL洗脫液清洗吸附劑6次，以達(dá)到注射器重復(fù)使用的目的。

5 展望

MEPS現(xiàn)在主要應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境水樣品中的藥物、農(nóng)藥和污染物的含量［23］。另外，還廣泛用于生物樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物的定性定量分析，比如血漿、唾液、尿液和頭發(fā)等［24］。隨著對(duì)各種類(lèi)型吸附劑深入研究，研發(fā)出更多靈敏度高，吸附能力強(qiáng)的吸附劑如MIPs材料、ENV+材料、限介材料成為主流。未來(lái)，隨著MEPS技術(shù)的不斷發(fā)展，可以應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、法醫(yī)學(xué)、動(dòng)物源性食品等研究領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。

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R197．39

A

0529-6005(2017)06-0080-04

2016-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372482)

張欣達(dá)(1992-)，女，碩士生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究，E-mail:zhangxinda0502@163．com

李存，E-mail:hhlicun@163．com