孫穎 王蕾 楊雪 何淼

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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側(cè)金盞大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育1)

孫穎 王蕾 楊雪 何淼

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

用石蠟切片技術(shù)對早春開花植物側(cè)金盞(AdonisamurensisRegel et Radde.)大、小孢子的發(fā)生及雌、雄配子體的發(fā)育進(jìn)行了研究。結(jié)果表明： 側(cè)金盞花藥壁由外向內(nèi)分為表皮、藥室內(nèi)壁、2層中層和絨氈層，其發(fā)育方式為典型的雙子葉型；絨氈層類型為腺質(zhì)絨氈層。 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型，四分體排列方式為左右對稱形或正四面體形。 成熟花粉粒大多數(shù)為二細(xì)胞型，少數(shù)為三細(xì)胞型，具有三條萌發(fā)溝。 子房為單心皮，單室，橫生型胚珠，厚珠心，雙珠被。 大孢子母細(xì)胞由造孢細(xì)胞發(fā)育而來，多數(shù)情況下合點(diǎn)端第一個(gè)大孢子分化為功能大孢子。成熟胚囊為8細(xì)胞8核的蓼型胚囊。

側(cè)金盞；大小孢子發(fā)生；雌雄配子體發(fā)育

AdonisamurensisRegel et Radde； Mega-and microsporogenesis； Female and male gametophyte

側(cè)金盞屬于毛茛科側(cè)金盞屬(AdonisL.)，別名頂冰花、福壽草或冰涼花，是東北地區(qū)一種常見多年生草本植物。主要生長在東北山區(qū)的闊葉林下或山坡草地中，喜歡富含腐殖質(zhì)和土層深厚的土壤環(huán)境[1-2]。側(cè)金盞花色明亮艷麗、花形美觀可愛，開花時(shí)間極早，植株抗寒性極強(qiáng)，是一種不可多得的野生花卉資源。

目前，關(guān)于側(cè)金盞藥用成分[3]、生物學(xué)[4-6]、分類學(xué)[7-9]的研究報(bào)道較多，而有關(guān)側(cè)金盞的胚胎學(xué)研究卻鮮有報(bào)道。側(cè)金盞為代表性的早春類短命植物，本試驗(yàn)對側(cè)金盞大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的發(fā)育過程進(jìn)行觀察研究，能為此類植物的生殖生物學(xué)、遺傳育種等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為采自東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃的側(cè)金盞。待側(cè)金盞植株地上部分的莖葉逐漸凋亡，地下部分的根狀莖的頂端有白色的小芽冒出的時(shí)候，在2014年6月初至10月末，每3～5 d取材一次，經(jīng)FAA固定液固定，對其進(jìn)行抽氣處理，使材料整體下沉，然后轉(zhuǎn)至冰箱4 ℃冷藏保存。愛氏蘇木精整體染色12～15 d，藍(lán)化后，常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度8～12 μm，在LEICA DM2500顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)生和雄配子體的發(fā)育

2.1.1 花藥壁的發(fā)育

側(cè)金盞的花為兩性花，每朵花具70～120枚雄蕊，花藥4室(圖1A、B)。幼小花藥外側(cè)為一層原表皮，內(nèi)側(cè)為一團(tuán)分生組織(圖1C)，后其4個(gè)角隅突起，成為近四邊形(圖1D)。孢原細(xì)胞在原表皮下的第一層細(xì)胞中形成，經(jīng)平周分裂(圖1E)，形成初生壁細(xì)胞和初生造胞細(xì)胞(圖1F)。初生壁細(xì)胞經(jīng)平周分裂和垂周分裂，形成2層次生壁細(xì)胞(圖1G)。近表皮的次生壁細(xì)胞經(jīng)平周分裂，形成了藥室內(nèi)壁和中層，內(nèi)層直接分化為絨氈層。小孢子母細(xì)胞時(shí)期，花藥壁已基本分化完全，由外到內(nèi)依次為表皮、藥室內(nèi)壁、2層中層、絨氈層(圖1H)。故側(cè)金盞花藥壁的發(fā)育方式為典型的雙子葉型。

表皮細(xì)胞在二細(xì)胞花粉期趨于解體，外壁不規(guī)則突起，具明顯角質(zhì)層結(jié)構(gòu)(圖1K)；藥室內(nèi)壁細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期開始徑向延長并液泡化(圖1I)，后細(xì)胞體積不斷增大(圖1J)，二細(xì)胞花粉期發(fā)生多數(shù)斜縱向條紋狀的“U”形纖維化加厚(圖1K)；中層為短命結(jié)構(gòu)，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期，中層細(xì)胞被藥室內(nèi)壁細(xì)胞擠壓(圖1I)，小孢子單核靠邊期，中層趨于解體(圖1J)，二細(xì)胞花粉期已完全退化，只留下一些痕跡(圖1K)；絨氈層細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期開始時(shí)逐漸解體(圖1I)。

asc.孢原細(xì)胞；end.藥室內(nèi)壁；epi.表皮；ml.中層；mmc.小孢子母細(xì)胞；tap.絨氈層；A.花藥四室；B.成熟花藥；C.幼小花藥；D.四邊形花藥；E.孢原細(xì)胞平周分裂；F.孢原細(xì)胞發(fā)育成初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞；G.初生壁細(xì)胞形成兩層次生壁細(xì)胞；H.5層花藥壁；I.小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期的花藥壁；J.小孢子單核靠邊期的花藥壁；K.二細(xì)胞花粉期的花藥壁；L.初生造孢細(xì)胞有絲分裂形成次生造孢細(xì)胞；M.小孢子母細(xì)胞；N.減數(shù)第一次分裂后期；O.減數(shù)第二次分裂后期；P.正四面體型四分體；Q.左右對稱型四分體；R.釋放到藥室中的小孢子；S.單核靠邊期小孢子;T.新形成的二細(xì)胞花粉;U.三細(xì)胞花粉(A、C、D、F-K.Bar=20 μm；B.Bar=80 μm；E、L、M、O、Q.Bar=10 μm;N、R-U.Bar=4 μm)。

圖1 花藥壁發(fā)育和小孢子的發(fā)生及雄配子體發(fā)育

2.1.2 小孢子發(fā)生

花藥壁發(fā)育的同時(shí)，初生造孢細(xì)胞經(jīng)數(shù)次的有絲分裂，形成次生造孢細(xì)胞(圖1L)，次生造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成小孢子母細(xì)胞(圖1M)。小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)第一次分裂時(shí)期(圖1N)，此次分裂沒有形成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞質(zhì)也不發(fā)生分裂。

隨后兩個(gè)子細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)第二次分裂(圖1O)，此次分裂伴隨著細(xì)胞質(zhì)的分裂，形成四分體。側(cè)金盞四分體的排列方式大多數(shù)為正四面體型(圖1P)，也有少數(shù)為左右對稱型(圖1Q)，胞質(zhì)分裂為同時(shí)型。在減數(shù)分裂過程中，小孢子母細(xì)胞的細(xì)胞壁內(nèi)逐漸積累形成胼胝質(zhì)，后來形成的四分體被胼胝質(zhì)壁所包圍，而且同一個(gè)四分體的各個(gè)小孢子也都被胼胝質(zhì)包圍。四分體胼胝質(zhì)壁隨后被溶解，四分體分開，形成單核小孢子(圖1R)，至此小孢子形成。

觀察發(fā)現(xiàn)，在同一朵花內(nèi)，不同花藥之間和同一花藥內(nèi)不同藥室中的小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂表現(xiàn)為明顯的不同步，一般相差2～4個(gè)時(shí)期，但在同一個(gè)藥室內(nèi)，小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂基本保持一致。

2.1.3 雄配子體發(fā)育

從四分體中釋放出的小孢子，形狀不規(guī)則，細(xì)胞壁微微的收縮，為收縮期小孢子，后細(xì)胞質(zhì)液泡化，發(fā)育為單核居中期小孢子(圖1R)。小孢子體積逐漸增大，橢球形，細(xì)胞壁加厚，中央大液泡形成且體積逐漸擴(kuò)大，將細(xì)胞核逐漸擠壓靠近細(xì)胞壁的一側(cè)，同時(shí)形成萌發(fā)溝，可見3個(gè)萌發(fā)孔，成為單核靠邊期小孢子(圖1S)。小孢子的細(xì)胞核發(fā)生有絲分裂并生成2個(gè)子核，隨后發(fā)生不均等的胞質(zhì)分裂，形成兩個(gè)細(xì)胞，大的為營養(yǎng)細(xì)胞，小的靠近花粉壁呈透鏡狀的為生殖細(xì)胞(圖1T)。隨著雄配子體的發(fā)育，兩細(xì)胞之間的細(xì)胞壁消失，生殖細(xì)胞經(jīng)有絲分裂形成2個(gè)精子。入冬前側(cè)金盞花粉發(fā)育成熟，大部分成熟花粉為二細(xì)胞型，少數(shù)為三細(xì)胞花粉。三細(xì)胞花粉外觀圓球形，3個(gè)萌發(fā)溝，營養(yǎng)細(xì)胞核位于雄配子體的一側(cè)，和兩個(gè)精細(xì)胞排列成三角形(圖1U)。在散粉前，花粉基本已是三細(xì)胞型。

2.2 大孢子的發(fā)生和雌配子體發(fā)育

2.2.1 胚珠的發(fā)育

側(cè)金盞的子房聚合在一個(gè)隆起的花托上，單心皮，單室，厚珠心，橫生型胚珠。子房壁的珠心組織發(fā)育成胚珠原基(圖2A)。珠孔端珠心表皮下的一個(gè)薄壁細(xì)胞特化成為孢原細(xì)胞，孢原細(xì)胞經(jīng)平周分裂(圖2C)生成1個(gè)周緣細(xì)胞和1個(gè)造孢細(xì)胞，周緣細(xì)胞經(jīng)1次平周分裂和數(shù)次垂周分裂，使大孢子母細(xì)胞位于珠心頂端4層細(xì)胞之下，而造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育后行使大孢子母細(xì)胞的功能(圖2D)。所以，側(cè)金盞的珠心屬于厚珠心。同時(shí)，胚珠原基的基部發(fā)生多次有絲分裂逐漸衍生出內(nèi)外2層珠被組織，外層組織由6～7層細(xì)胞組成，稱為外珠被，內(nèi)層組織由3～4層細(xì)胞組成，稱為內(nèi)珠被，內(nèi)、外珠被共同形成珠孔結(jié)構(gòu)。胚珠的基部與子房相連的部分發(fā)育為珠柄，珠柄進(jìn)入胚珠處為合點(diǎn)，在胚珠的發(fā)育過程中，由于珠柄和其他部位的生長速度不均等，使胚珠的珠心和珠被的縱軸與珠柄垂直，形成橫生型胚珠(圖2B)。

2.2.2 大孢子發(fā)生

大孢子母細(xì)胞體積增大，隨后開始進(jìn)行減數(shù)分裂，經(jīng)歷了較長時(shí)間的前期Ⅰ，后進(jìn)入中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ(圖2E)，形成二分體(圖2F)。與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的不同點(diǎn)是，在大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的末期Ⅰ中細(xì)胞核生成的同時(shí)伴隨著胞質(zhì)分裂。從其雌配子發(fā)育過程推測，一般保留位于合點(diǎn)端的第一個(gè)大孢子，并最終發(fā)育成為功能大孢子進(jìn)而發(fā)育為單核胚囊，而位于珠孔端的3個(gè)大孢子逐漸退化。

2.2.3 雌配子體發(fā)育

隨著功能大孢子的體積不斷增大，出現(xiàn)液泡，功能大孢子發(fā)育為單核胚囊(圖2G)。大孢子發(fā)育到一定程度連續(xù)進(jìn)行3次有絲分裂，第1次分裂，形成2個(gè)子核的分別向珠孔端和合點(diǎn)端方向移動(dòng)，形成二核胚囊(圖2H)。隨后每個(gè)核又進(jìn)行1次分裂，分別產(chǎn)生2個(gè)子核，形成四核胚囊(圖2J、K)。但在此發(fā)育時(shí)期也有異常情況發(fā)生，由于核分裂不同步，珠孔端的核先分裂，可能會(huì)看到一端一核、一端二核的三核胚囊(圖2I)。繼而四核胚囊的每個(gè)核又各自進(jìn)行1次有絲分裂，形成了八核胚囊(圖2L)，8個(gè)核處于共同的細(xì)胞質(zhì)中。八核胚囊停留時(shí)間較短，隨即進(jìn)入細(xì)胞化階段，各核間生成細(xì)胞壁構(gòu)成細(xì)胞。卵細(xì)胞是胚囊的核心，最初形成的卵細(xì)胞，細(xì)胞核明顯，液泡小(圖2M)。成熟的卵細(xì)胞具有明顯的極性，通常位于近合點(diǎn)端(圖2N)，但有時(shí)也會(huì)處于近珠孔端(圖2O)。2個(gè)助細(xì)胞并列分布于近珠孔端，且與卵細(xì)胞組成近“品”字形的卵器。助細(xì)胞極性明顯且與卵細(xì)胞相反(圖2P、Q)。助細(xì)胞的存活時(shí)間極短，其中一個(gè)在花粉管進(jìn)入胚囊時(shí)便已被破壞并退化，另一個(gè)在雙受精過程完成之后不久退化。兩個(gè)極核在受精之前沒有發(fā)生融合(圖2Q)其排列方式為并列分布(圖2R)或上下分布(圖2S)。3個(gè)反足細(xì)胞成"品"字形緊密的排列于胚囊合點(diǎn)端(圖2T)。

fu.珠柄；ii.內(nèi)珠被；mec.孢原細(xì)胞；nu.珠心；oi.外珠被；vb.維管束;ant.反足細(xì)胞；ec.卵細(xì)胞；pn.極核；sy.助細(xì)胞；A.胚珠原基；B.胚珠縱切面；C.孢原細(xì)胞有絲分裂；D.大孢子母細(xì)胞；E.大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂；F.二分體；G.單核胚囊；H.二核胚囊；I.珠孔端細(xì)胞先分裂；J.四核胚囊中位于合點(diǎn)端的2個(gè)核；K.四核胚囊中位于珠孔端的兩個(gè)核；L.八核胚囊(示七核)；M.剛分化的卵細(xì)胞；N.核位于合點(diǎn)端的卵細(xì)胞；O.核位于珠孔端的兩個(gè)細(xì)胞；P.卵器；Q.上下排列的極核和2個(gè)助細(xì)胞；R.左右排列的極核和卵細(xì)胞；S.上下排列的極核和卵細(xì)胞；T.3個(gè)反足細(xì)胞(A、B.Bar=20 μm;C-T.Bar=10 μm)。

圖2 胚珠發(fā)育和大孢子發(fā)生與雌配子發(fā)育

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)觀察到側(cè)金盞的花藥為4室，花藥壁由外向內(nèi)分為表皮、藥室內(nèi)壁、2層中層和絨氈層5層，絨氈層類型為腺質(zhì)絨氈層。宋萍[10]在毛茛科川陜金蓮花(Trolliusbuddae)和驢蹄草(Calthapalustris)中觀察到的絨氈層也為腺質(zhì)絨氈層。有相關(guān)研究認(rèn)為，絨氈層細(xì)胞通過自溶為迅速發(fā)育的花粉提供營養(yǎng)物質(zhì)[11]，在側(cè)金盞的花粉粒發(fā)育過程中，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期起，絨氈層開始解體，至花藥成熟時(shí)完全退化。由此可見，側(cè)金盞絨氈層活動(dòng)狀態(tài)與小孢子、雄配子發(fā)育對營養(yǎng)物質(zhì)的要求相一致。根據(jù)Davis[12]對花藥壁發(fā)育方式的劃分，側(cè)金盞花藥壁的發(fā)育方式為典型的雙子葉型。

毛茛科胞質(zhì)分裂在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中為同時(shí)型，四分體為四面體形、左右對稱形或交叉形[13]。側(cè)金盞小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂為同時(shí)型，四分體排列方式有左右對稱形或正四面體形兩種類型。而劉萍[14]對鐵筷子(Helleborusthibetanus)和宋萍[10]對驢蹄草(C.palustris)和川陜金蓮花(T.buddae)的研究結(jié)果均顯示四分體排列方式只有四面體形一種。

側(cè)金盞成熟花粉多數(shù)為二細(xì)胞型，少數(shù)為三細(xì)胞型。二細(xì)胞型花粉在毛茛科是很普遍的，Tamura[13]報(bào)道在毛茛科21屬中兩細(xì)胞花粉較常見，極少觀察到三細(xì)胞花粉。

對側(cè)金盞觀察發(fā)現(xiàn)，在同一朵花內(nèi)，不同花藥之間和同一花藥內(nèi)不同藥室中的小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂表現(xiàn)為明顯的不同步，一般相差2～4個(gè)時(shí)期，但在同一個(gè)藥室內(nèi)，小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂基本保持一致。Heslop-Harrison[15]認(rèn)為，胞間連絲的存在使同一藥室內(nèi)的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂同步化，但在試驗(yàn)過程中并未發(fā)現(xiàn)側(cè)金盞存在胞間連絲結(jié)構(gòu)。

側(cè)金盞子房為單心皮，單室，橫生型胚珠，厚珠心，雙珠被。側(cè)金盞的由珠心表皮下的薄壁細(xì)胞特化而來的1個(gè)孢原細(xì)胞并不直接分化出大孢子母細(xì)胞，而是先經(jīng)過平周分裂形成1個(gè)周緣細(xì)胞和1個(gè)造孢細(xì)胞，造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育行使大孢子母細(xì)胞的功能，這與Tamura[13]對毛茛科植物大孢子母細(xì)胞起源的描述一致，劉萍[14]在對鐵筷子(H.thibetanus)的研究中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。但現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料中也記載了特殊情況，毛茛科驢蹄草屬的驢蹄草(C.palustris)的孢原細(xì)胞不發(fā)生分裂，直接起大孢子母細(xì)胞的作用[10]。側(cè)金盞的厚珠心來源于珠心表皮細(xì)胞的分裂和周緣細(xì)胞的共同分裂，而王自芬[16]在對毛茛科驢蹄草(C.palustris)胚珠的厚珠心來源于珠心表皮的分裂。

側(cè)金盞的功能大孢子經(jīng)單核胚囊、二核胚囊、四核胚囊發(fā)育成為8核8細(xì)胞胚囊；但在四核胚囊形成期，由于核分裂不同步，偶見一端有一核，一端有二核的三核胚囊。觀察還發(fā)現(xiàn)側(cè)金盞的助細(xì)胞存活時(shí)間極為短暫，其中一個(gè)在花粉管進(jìn)入胚囊時(shí)便已退化，另一個(gè)在受精完成后不久退化，這種現(xiàn)象在棉花(Gossypiumhirsutum)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、針茅(Stipacapillata)中廣泛存在[11]。

側(cè)金盞的果實(shí)為聚合瘦果，每個(gè)果實(shí)上有50～60枚種子。有研究發(fā)現(xiàn)，無論在野生還是引種狀態(tài)下，側(cè)金盞種子都存在一定的“空籽”，即種胚敗育[4]。通過對大量不同時(shí)期的花芽材料進(jìn)行切片觀察，并未發(fā)現(xiàn)側(cè)金盞大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育過程中存在發(fā)育不良的情況，可見側(cè)金盞的“空籽”形成原因與后期的傳粉受精過程有密切的關(guān)系，需要進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)研究。

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孫穎，女，1979年10月生，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，副教授。E-mail:littlesuning@126.com。

何淼，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，副教授。E-mail:hemiao_xu@126.com。

2017年2月8日。

S681.7;Q944.4

Megasporogenesis, Microsporogenesis and Development of Male and Female Gametophytes ofAdonisamurensisRegel et Radde//Sun Ying, Wang Lei, Yang Xue, He Miao(Northeast Forestry University, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(7)：61-65.

1)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572017CA13)。

責(zé)任編輯：任 俐。

We studied the megasporogenesis and development of female and male megasporogensis ofAdonisamurensisRegel et Radde, which blooms in early spring, by paraffin wax. The development of the anther wall belongs to a dicotyledonous type. The wall of anther consists of epidermis, endothecium, two middle layers and tapetum from out to inside, and tapetum cell is of glandular tepetum. Successive cytokinesis in microspore mother cell accompanies meiosis to produce tetrahedral tetrad as well as medianly zygomorphic tetrad. Mature pollen grains, with three germ pores, most are 2-cell type, while a few are 3-cell type. The ovary ofA.amurensishas 1 carpel, 1 loculuses with amphitropous ovule which is crassinucellate and bitegmic. Megasporocyte developes from sporogenous cell. In most cases, the first chalazal megaspore differentiates into functional megaspore. The mature embryo sacs has 8 cells with 8 nucleis, and belongs to polygonum type embryo-sac.