丁澤琴王志敏牛 義湯青林田時(shí)炳王永清楊 洋宋 明

（1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，重慶 400055）

花是植物的主要生殖器官。在植物生殖發(fā)育階段，雄性生殖發(fā)育由于涉及復(fù)雜且精細(xì)的細(xì)胞發(fā)育分子機(jī)制而成為植物發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)研究的對(duì)象?；ㄋ幾鳛樾廴镒钪匾慕M成部分，含有與花粉粒形成及釋放有關(guān)的生殖和營(yíng)養(yǎng)組織?；ㄋ庍m時(shí)開(kāi)裂，花粉才能在成熟后適時(shí)釋放進(jìn)行授粉，從而保證傳粉與受精過(guò)程的順利進(jìn)行，所以花藥開(kāi)裂是花藥發(fā)育后期的一個(gè)重要特征。當(dāng)作物花藥開(kāi)裂不完善或完全不開(kāi)裂時(shí)，就會(huì)影響傳粉作用的完成而導(dǎo)致作物減產(chǎn)。因此對(duì)花藥開(kāi)裂機(jī)理的研究不僅有利于揭示植物的雄性生殖發(fā)育過(guò)程，而且有利于通過(guò)人工控制花藥開(kāi)裂，從而在生產(chǎn)上節(jié)約育種成本，提高育種質(zhì)量?；ㄋ庨_(kāi)裂涉及花藥壁各層細(xì)胞的變化以及細(xì)胞內(nèi)的許多生理生化反應(yīng)，研究者已在擬南芥（Sanders et al.，1999）、百合（Varnier et al.，2005）、水稻（Zhu et al.，2004）、玉米（Vernoud et al.，2009）和茄科（Bonner & Dickinson，1989；Beals & Goldberg，1997）的一些植物上開(kāi)展了花藥開(kāi)裂的相關(guān)研究。除了解剖學(xué)觀察外，近年來(lái)在分子生物學(xué)研究中又發(fā)現(xiàn)了受體蛋白激酶（Mizuno et al.，2007）和多聚半乳糖醛酸酶（Gorguet et al.，2009）等幾個(gè)與調(diào)節(jié)花藥開(kāi)裂相關(guān)的功能基因。本文對(duì)近年來(lái)在植物花藥發(fā)育過(guò)程及花藥開(kāi)裂機(jī)制上的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)，從而為植物生殖發(fā)育的系統(tǒng)研究提供參考。

1 花藥發(fā)育的過(guò)程

花藥由最初的雄蕊原基形成。雄蕊原基角隅處的孢原細(xì)胞經(jīng)過(guò)平周分裂形成初生壁細(xì)胞和造孢細(xì)胞，造孢細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的有絲分裂和減數(shù)分裂形成小孢子，即后來(lái)的花粉。而初生壁細(xì)胞則經(jīng)過(guò)平周分裂形成了藥室內(nèi)壁（纖維層）、中間層和絨氈層。當(dāng)花藥成熟時(shí)，藥室內(nèi)壁細(xì)胞壁的內(nèi)切向壁和橫向壁發(fā)生帶狀加厚，從而有助于花藥的開(kāi)裂和花粉的散放。Sanders等（1999）通過(guò)對(duì)擬南芥花藥的細(xì)胞切片觀察，將從雄蕊原基發(fā)生到花藥開(kāi)裂脫落的整個(gè)過(guò)程分為15個(gè)時(shí)期，并做了詳細(xì)的描述。在1～4期中，從花藥原基開(kāi)始細(xì)胞分裂形成各層組織，逐漸形成成熟花藥的腔、壁、連接細(xì)胞和導(dǎo)管區(qū)域。第5期，具有四角結(jié)構(gòu)的花藥原基孢子體細(xì)胞逐漸分化成了內(nèi)壁層、中間層、絨氈層和小孢子母細(xì)胞。小孢子母細(xì)胞經(jīng)5～7期的減數(shù)分裂形成含有單倍體小孢子的四分體，并包裹有一層較厚的胼胝質(zhì)層。在第8期，胼胝質(zhì)酶復(fù)合體降解胼胝質(zhì)層，使得小孢子從四分體釋放出來(lái)。在9～12期，小孢子經(jīng)過(guò)2次有絲分裂形成具有三核的花粉粒。隨著花粉發(fā)育，花藥不斷增大，部分花藥特異組織降解，在12～13期裂口細(xì)胞破裂后形成兩室花藥。13期后花粉釋放，花藥逐漸衰老并脫落。

2 花藥開(kāi)裂的組織細(xì)胞學(xué)研究

花藥開(kāi)裂發(fā)生在四分體之后，主要涉及3個(gè)特殊的組織：藥室內(nèi)壁、藥隔和裂口。

2.1 藥室內(nèi)壁

Scott等（2004）發(fā)現(xiàn)藥室內(nèi)壁在花藥發(fā)育的第5階段開(kāi)始形成，第6階段開(kāi)始擴(kuò)張，第11階段由于木質(zhì)素和纖維素的沉積而加厚。在帶有肉桂酰輔酶A還原酶1（CCR1）、肉桂酰脫氫酶a（CAD）和d突變的擬南芥三突變體中，不能合成木質(zhì)素單體，其藥室內(nèi)壁未能加厚從而導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂（Thevenin et al.，2011）。Mizuno等（2007）發(fā)現(xiàn)擬南芥受體蛋白激酶rpk2突變體表現(xiàn)為雄性不育，是由于藥室內(nèi)壁未加厚而導(dǎo)致花藥未開(kāi)裂。向珣等（2007）對(duì)經(jīng)普通白菜品種矮腳黃（父本）與甘藍(lán)型油菜OguCMS（母本）雜交后，并與父本連續(xù)回交6代獲得的普通白菜矮腳黃OguCMS的花藥進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)其藥室內(nèi)壁細(xì)胞完整，卻沒(méi)有次生加厚，因而花藥未開(kāi)裂。

2.2 裂口結(jié)構(gòu)

裂口組織是一層特殊細(xì)胞構(gòu)成的單細(xì)胞層，是花藥最終開(kāi)裂的位置（Keijzer，1987）。裂口由藥室內(nèi)壁的表皮細(xì)胞分化而成，并形成了單個(gè)的細(xì)胞區(qū)域，裂口位置決定了花藥開(kāi)裂的位置。藥室內(nèi)壁次生加厚，而花粉囊之間的裂口和藥隔不加厚的方式對(duì)花藥的開(kāi)裂至關(guān)重要。Beals和Goldberg（1997）在番茄細(xì)胞消融的研究中分離了由TA35啟動(dòng)子控制的細(xì)胞毒素barnase基因，barnase基因在環(huán)形細(xì)胞簇、裂口組織和連接組織中表達(dá)，使得這些組織加速消融，從而引起花藥不開(kāi)裂。而抗細(xì)胞毒素barstar基因表達(dá)時(shí)則會(huì)保護(hù)藥室周圍的組織，僅裂口消融，花藥表現(xiàn)不開(kāi)裂，從而揭示了裂口在花藥開(kāi)裂中的重要作用。

2.3 細(xì)胞的程序性死亡（PCD）

關(guān)于花藥開(kāi)裂是由細(xì)胞程序性死亡引起的已有報(bào)道。擬南芥突變體non-dehiscence1的花藥經(jīng)歷了不正常的細(xì)胞程序性死亡，導(dǎo)致藥室內(nèi)壁脫水并間接引起裂口細(xì)胞不降解，因而花藥不開(kāi)裂，但花粉有活力（Sanders et al.，1999）。一些植物雄性不育突變體的絨氈層無(wú)法正常降解，表明絨氈層細(xì)胞的程序性死亡對(duì)花粉形成至關(guān)重要（Parish & Li，2010）。Varnier等（2005）發(fā)現(xiàn)百合花的細(xì)胞程序性死亡開(kāi)始發(fā)生在絨氈層，并向外延伸到中間細(xì)胞層、裂口組織等花藥的各個(gè)組織，最后是藥室內(nèi)壁和藥隔的降解。Senatore等（2009）在細(xì)胞程序性死亡導(dǎo)致番茄花藥開(kāi)裂的研究中，通過(guò)觀察番茄的藥隔、中間層及裂口周圍表皮組織的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這些組織都發(fā)生了正常的細(xì)胞程序性死亡，并在藥隔和裂口的表皮中發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸蛋白酶（SlCysEP），花藥裂開(kāi)時(shí)藥室周圍的小孢子體中也有SlcysEP的積累，認(rèn)為SlcysEP與花藥開(kāi)裂相關(guān)。

3 花藥壁組織的脫水和酶解研究

3.1 花藥壁的脫水

開(kāi)花期的最后一個(gè)階段涉及藥室內(nèi)壁和表皮細(xì)胞的脫水，引起藥室向外彎曲，繼而花藥開(kāi)裂。在花藥壁脫水期間，Bonner和Dickinson（1989）發(fā)現(xiàn)了連接組織中淀粉的流失，并且提出淀粉轉(zhuǎn)化為糖能增加花藥組織的滲透勢(shì)。Stadler等（1999）在擬南芥花藥藥隔周圍觀察到了H+-蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體AtSUC1，由于AtSUC1增加了藥隔的滲透勢(shì)而導(dǎo)致花藥周圍組織脫水。對(duì)矮牽牛花藥開(kāi)裂過(guò)程的研究表明，花藥的脫水在一定程度上是水從花藥向蜜腺中轉(zhuǎn)移而引起的。Ge等（2000）研究證實(shí)，矮牽牛NECTARY（NEC1）和NEC2基因作用于花絲和裂口細(xì)胞的上部分，因此打破了淀粉轉(zhuǎn)化為糖的平衡并調(diào)節(jié)裂口和蜜腺的水勢(shì)，最終導(dǎo)致花藥脫水。Thompson等（2010）發(fā)現(xiàn)擬南芥中黃酮轉(zhuǎn)運(yùn)因子FFT的缺乏會(huì)影響黃酮類化合物的水平，并且FFT可通過(guò)調(diào)節(jié)花藥脫水來(lái)控制花藥開(kāi)裂，在fft-1突變體中花藥不開(kāi)裂。

煙草中2種水通道蛋白PIP1和PIP2在花藥和柱頭中特異表達(dá)（Bots et al.，2005a）；花藥開(kāi)裂期間，PIP2蛋白不表達(dá)；利用RNA干擾技術(shù)使PIP2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)花藥延遲開(kāi)裂，從而發(fā)現(xiàn)水通道蛋白參與花藥脫水的過(guò)程（Bots et al.，2005b）。

3.2 隔膜的酶解

水解細(xì)胞壁的幾種酶及蛋白包括聚半乳糖醛酸酶（PGs）、β-1，4-糖苷酶和擴(kuò)展蛋白（Cho& Cosgrove，2000）等，這些酶在大量的特定細(xì)胞中表達(dá)。Torki等（2000）發(fā)現(xiàn)一組相關(guān)的PGs在花和花芽中表達(dá)，其他的PGs在營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)。Roberts等（2002）認(rèn)為花藥開(kāi)裂的過(guò)程與水解細(xì)胞間膠質(zhì)的細(xì)胞壁降解酶有關(guān)。Rhee等（2003）發(fā)現(xiàn)擬南芥中許多PGs蛋白與花粉壁的發(fā)育有關(guān)，如QRT1、QRT2和QRT3是花粉母細(xì)胞壁退化所必需的。另外，擬南芥開(kāi)裂區(qū)域多聚半乳糖醛酸酶ADPG1、ADPG2和QRT2均與花藥的開(kāi)裂有關(guān)（Ogawa et al.，2009）。有研究表明這3種PGs均受到茉莉酸的調(diào)節(jié)，其中ADPG2也受到乙烯的調(diào)節(jié)（Gonzalez-Carranza et al.，2007），QRT2則受到乙烯和脫落酸的共同調(diào)節(jié)（Ogawa et al.，2009）。Gorguet等（2009）在研究番茄花藥開(kāi)裂突變中發(fā)現(xiàn)了新的PG基因ps-2，其表達(dá)和花藥的開(kāi)裂同時(shí)發(fā)生。

4 植物激素參與花藥開(kāi)裂的調(diào)節(jié)

4.1 茉莉酸

對(duì)擬南芥花藥開(kāi)裂突變體的研究表明，茉莉酸有助于調(diào)控花藥的開(kāi)裂、花絲的伸長(zhǎng)和花粉活力（Scott et al.，2004），與茉莉酸代謝途徑相關(guān)的基因有DAD1、FAD、LOX、AOS、AOC、OPR。DAD1編碼參與茉莉酸合成途徑中的磷脂酶A1，dad1突變體的花藥不開(kāi)裂。AOS基因編碼一種叫丙二烯氧化合酶的羥脂通道酶，突變體aos的花粉發(fā)育正常，但是花藥不開(kāi)裂，從而導(dǎo)致雄性不育。OPR編碼12-氧植二烯還原酶，該酶催化茉莉酸反應(yīng)途徑中最關(guān)鍵的一步。

擬南芥突變體dde1（延遲開(kāi)裂）和opr3，其茉莉酸生物合成的途徑中缺乏12-氧植二烯還原酶，導(dǎo)致裂口不正常脫水和花藥延遲開(kāi)裂（Sanders et al.，2000）。對(duì)擬南芥突變體coil、opr3和dad1的花藥形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在茉莉酸調(diào)控途徑各個(gè)階段中的缺陷都會(huì)導(dǎo)致花絲變短、花藥不開(kāi)裂（Ishiguro et al.，2001）。

4.2 生長(zhǎng)素

研究表明其他植物激素也參與了花藥開(kāi)裂。生長(zhǎng)素在花的發(fā)育、器官形成和花粉發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，并且在協(xié)調(diào)花粉成熟和花藥開(kāi)裂之間也起主要作用（Cheng et al.，2006）。根癌農(nóng)桿菌基因rolB的定向表達(dá)增加了生長(zhǎng)素的敏感性，轉(zhuǎn)基因煙草中生長(zhǎng)素水平的增加導(dǎo)致花藥延遲開(kāi)裂（Cecchetti et al.，2007）。通過(guò)對(duì)擬南芥生長(zhǎng)素受體突變體的分析，證實(shí)了生長(zhǎng)素對(duì)花藥發(fā)育的調(diào)節(jié)作用；在tir1、afb1、afb2、afb3生長(zhǎng)素受體多突變中，存在花藥提前開(kāi)裂和花粉提前成熟的現(xiàn)象，在絨氈層退化之前發(fā)生藥室內(nèi)壁木質(zhì)化，藥隔和裂口同時(shí)且不連續(xù)降解；生長(zhǎng)素誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，導(dǎo)致花粉提前進(jìn)行有絲分裂，并且花絲延長(zhǎng)率降低（Cecchetti et al.，2008）。生長(zhǎng)素的累積導(dǎo)致了棉花花藥不開(kāi)裂，主要是由于細(xì)胞骨架的改變以及藥室內(nèi)壁增厚方向從縱向向橫向的轉(zhuǎn)變（Yasuor et al.，2006）。Nagpal等（2005）從T-DNA插入突變的擬南芥群體中，篩選到與花藥開(kāi)裂后期、花絲和花瓣均較野生型短的突變體，從突變體中分離到了一類轉(zhuǎn)錄因子，生長(zhǎng)素影響因子ARF，通過(guò)研究arf6-2和arf8-3單突變體及二者的雙突變體，發(fā)現(xiàn)其花藥延遲開(kāi)裂。

近期的研究表明，生長(zhǎng)素并不是獨(dú)立調(diào)節(jié)花藥開(kāi)裂的，而是通過(guò)影響其他植物激素如茉莉酸來(lái)調(diào)控花藥開(kāi)裂。擬南芥dad1突變體中，生長(zhǎng)素受體因子ARF6和ARF8的缺失影響了茉莉酸的形成，因此導(dǎo)致了花藥延遲開(kāi)裂、花絲變短和花瓣伸長(zhǎng)（Tabata et al.，2010），通過(guò)噴灑外源茉莉酸，這些特征得到了明顯的改善（Cecchetti et al.，2007）。Tabata等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素受體因子ARF6和ARF8有激活DAD1表達(dá)和調(diào)節(jié)茉莉酸合成的作用。

4.3 赤霉素

通過(guò)對(duì)5個(gè)擬南芥C19-GA2-氧合酶突變體的研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素對(duì)花器官發(fā)育的協(xié)調(diào)性和同步性是必需的（Rieu et al.，2008）。在絨氈層降解前和花藥開(kāi)裂初期檢測(cè)到GA3ox3和GA3ox4基因的最大表達(dá)量，表明絨氈層是產(chǎn)生赤霉素的主要位置（Hu et al.，2008）。HvGAMYB是一類轉(zhuǎn)錄因子，受到GA的上游調(diào)節(jié)，Murray等（2003）研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中HvGAMYB的過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂。

4.4 乙烯

Rieu等（2003）在2個(gè)煙草乙烯不敏感突變體etr1轉(zhuǎn)基因煙草植株和使用乙烯受體抑制劑1-甲基-環(huán)丙烯（MCP）處理的野生型煙草的研究中，發(fā)現(xiàn)其花藥均延遲開(kāi)裂；用乙烯處理后花藥提前開(kāi)裂。矮牽?；ǖ囊蚁┦荏wPhETR2的反義抑制作用使得裂口在減數(shù)分裂前脫水，且花藥提前開(kāi)裂（Wang & Kumar，2007）。這些研究表明乙烯可能是作為一種信號(hào)分子調(diào)節(jié)煙草和矮牽牛的花藥開(kāi)裂。

5 轉(zhuǎn)錄因子與花藥開(kāi)裂

各種轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控藥室內(nèi)壁次生加厚來(lái)控制花藥開(kāi)裂。在擬南芥MYB26突變體中，花藥的發(fā)育最初是正常的，減數(shù)分裂之后絨氈層和中間層細(xì)胞開(kāi)始降解；然而在野生型花藥中存在藥室內(nèi)壁的擴(kuò)張和次生加厚，突變體中卻未見(jiàn)藥室內(nèi)壁加厚（Steiner-Lange et al.，2003），從而導(dǎo)致花藥不能正常開(kāi)裂引起雄性不育。Yang等（2007）研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中因AtMYB24過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致藥室內(nèi)壁無(wú)纖維狀加厚，因而花藥未開(kāi)裂。水稻中AID1（花藥開(kāi)裂）基因編碼1個(gè)與花藥發(fā)育相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)花粉成熟階段的細(xì)胞程序性死亡和次生代謝物的沉積，從而影響花粉成熟和花藥開(kāi)裂，該基因的突變體由于花藥開(kāi)裂推遲而導(dǎo)致部分不育（Zhu et al.，2004）。

Mitsuda等（2005）研究發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子（次生壁加厚促進(jìn)因子）中的NST1和NST2的抑制表達(dá)可引起藥室內(nèi)壁不加厚，進(jìn)而導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂。在擬南芥ucl1突變體中，MYB26、NST1和NST2通過(guò)下游調(diào)控UCL1（HD-ZIP亮氨酸拉鏈蛋白的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)可導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂（Li et al.，2007）。玉米的插入型突變體中HD-ZIP IV轉(zhuǎn)錄因子OCL4基因的表達(dá)抑制藥室內(nèi)壁增厚，進(jìn)而導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂 （Vernoud et al.，2009）。對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)基因植物SAF1-OX的研究表明，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，SAF1-OX與野生型相比，其形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)正常，在生殖生長(zhǎng)階段，80%的植株表現(xiàn)為部分不育或者完全不育，其不育程度與SAF1基因的表達(dá)量有關(guān)；在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察，SAF1-OX的花藥和野生型花藥的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SAF1-OX的花藥不開(kāi)裂，且藥室內(nèi)壁未加厚，這也證實(shí)了F-box蛋白有阻礙藥室內(nèi)壁加厚，從而導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂的作用（Yun et al.，2012）。

6 展望

隨著對(duì)顯花植物花藥開(kāi)裂機(jī)理研究的深入，從細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、降解和程序性死亡等組織細(xì)胞的觀察，到生理生化變化以及分子水平的基因調(diào)控研究，都為不斷揭示植物生殖發(fā)育中前期花的生長(zhǎng)發(fā)育奠定了一定的基礎(chǔ)。然而，關(guān)于花藥開(kāi)裂過(guò)程的研究還有很多值得探索的內(nèi)容，比如關(guān)于花藥的藥室內(nèi)壁增厚的精確定位、裂口的調(diào)節(jié)、隔膜的形成以及花藥中水運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程等。相信通過(guò)對(duì)花藥開(kāi)裂過(guò)程調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入研究，在生產(chǎn)上將有助于加快雄性不育材料的創(chuàng)造及雜種優(yōu)勢(shì)育種的進(jìn)程。

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