潘劍茹，陳莉娟，何火聰，蘇穎，王香玲，李嫻，陳翠煌，吳倫巧，劉樹滔

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全長SOD2重組蛋白的可溶表達、純化、穩(wěn)定性與跨膜效應(yīng)

潘劍茹1，陳莉娟1，何火聰2，蘇穎2，王香玲1，李嫻1，陳翠煌1，吳倫巧1，劉樹滔1

1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108 2 福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室，福建福州 350014

潘劍茹, 陳莉娟, 何火聰, 等. 全長SOD2重組蛋白的可溶表達、純化、穩(wěn)定性與跨膜效應(yīng). 生物工程學(xué)報, 2017, 33(7): 1168–1177.Pan JR, Chen LJ, He HC, et al. Expression, purification, stability and transduction efficiency of full-length SOD2 recombinant proteins. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1168–1177.

超氧化物歧化酶(SOD) 家族是保護細胞免受正常代謝過程中產(chǎn)生的活性氧 (ROS) 毒性所必需的，含Mn2+離子的超氧化物歧化酶 (Mn-SOD，SOD2) 是其中最重要的一種。本研究合成了人源SOD2全基因序列，并將其插入帶有GST的原核表達載體pGEX-4T-1中，成功構(gòu)建了GST-SOD2融合蛋白表達質(zhì)粒。然后，將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，用IPTG在25 ℃下誘導(dǎo)表達融合蛋白，得到可溶性GST-SOD2融合蛋白，經(jīng)GST親和樹脂純化得到比活為1 788 U/mg的純蛋白，分子量約為46 kDa。利用凝血酶切去GST標簽后經(jīng)肝素親和柱純化得到了電泳純的SOD2重組蛋白，該蛋白分子量約為25 kDa，與SOD2全長序列的理論分子量相符，比活為2 000 U/mg。兩種重組SOD2蛋白在生理條件下都具有良好的SOD活性，且都具有顯著的跨膜能力 (<0.05)。這些工作為深入研究兩種全長重組SOD2蛋白的結(jié)構(gòu)與生物效應(yīng)建立了基礎(chǔ)。

Mn超氧化物歧化酶，構(gòu)建，融合蛋白，表達純化，穩(wěn)定性，跨膜效應(yīng)

超氧化物歧化酶 (SOD) 家族是保護氧利用細胞免受正常代謝過程中產(chǎn)生的活性氧 (ROS) 毒性所必需的。除了保護性蛋白質(zhì)，這些酶也是調(diào)節(jié)細胞生理學(xué)信號通路的關(guān)鍵組件。SOD催化反應(yīng)，然后用過氧化氫酶 (CAT) 和過氧化物酶除去過氧化氫。在哺乳動物細胞中存在3種已知形式的SOD：主要在細胞質(zhì)和細胞核中發(fā)現(xiàn)的含銅和鋅的超氧化物歧化酶 (Cu，Zn-SOD，SOD1)，在線粒體中發(fā)現(xiàn)的含錳超氧化物歧化酶 (Mn-SOD，SOD2) 和細胞外超氧化物歧化酶 (EC-SOD，SOD3)[1]。定位在線粒體的SOD2被認為是3種SOD中最重要的一個，因為線粒體是主要的ROS生產(chǎn)位點[2]。Mn-SOD不僅對所有需氧生物的存活都是必需的[3]，還被證明是一種強大的保護和治療劑，可用于抗氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如腎損傷[4]、關(guān)節(jié)炎[5]、慢性炎癥肺纖維化[5]以及電離輻射所引起的輻射損傷[6-8]。

Mn-SOD在細胞中以帶有線粒體靶向信號肽的前體形式合成，通過其2 kDa的前導(dǎo)序列進入線粒體基質(zhì)，該肽隨后被切割，產(chǎn)生在線粒體內(nèi)起關(guān)鍵作用的成熟和具有酶活性的蛋白質(zhì)[9]。對人脂肪肉瘤細胞LSA中發(fā)現(xiàn)的30 kDa的人源SOD2異構(gòu)體 (LSA-type-Mn-SOD) 的系列研究結(jié)果表明，SOD2的前導(dǎo)肽還具有介導(dǎo)蛋白進入細胞的能力[10-14]。利用原核系統(tǒng)重組表達SOD2時，為了得到可溶并具有酶活的蛋白，通常會把SOD2的前導(dǎo)肽序列去掉，直接表達單體成熟的蛋白，如王峰等曾利用pET15b質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta-gami菌株中表達得到N端His標簽的可溶SOD2重組蛋白，比活為1 890 U/mg[15]。

然而，這種方法雖然可得到成熟和具有酶活性的SOD2，但失去前導(dǎo)肽的SOD2卻由于分子量的限制難以進入細胞發(fā)揮作用。因此，上述SOD2的應(yīng)用多是以轉(zhuǎn)基因的形式進行，這限制了SOD2重組蛋白的臨床應(yīng)用。

本研究合成了人源SOD2全長基因，首次將其克隆至帶有GST標簽的pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2，轉(zhuǎn)化后表達得到GST-SOD2融合蛋白，并對表達得到的GST-SOD2融合蛋白以及酶切得到的全長SOD2重組蛋白進行純化、鑒定及穩(wěn)定性等研究。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3) 均為本實驗室保存；酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Qiagen公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；GST親和柱購自生工生物工程上海(股份) 有限公司；IPTG、考馬斯亮藍R-250購自AMRESCO公司；蛋白marker購于Fermentas公司；DNA marker購自北京天根生化科技有限公司；基因合成與DNA測序由生工生物工程上海(股份) 有限公司進行。SOD和GST活力檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。牛凝血酶購自北京博爾西科技有限公司。BCA蛋白含量檢測試劑盒購自Thermo Scientific (美國)。L-02人正常肝細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

全基因合成人源全長SOD2的基因序列，在其上、下游分別引入RⅠ和Ⅰ酶切位點，將其與pGEX-4T-1質(zhì)粒均用RⅠ和Ⅰ進行雙酶切并經(jīng)膠回收純化，然后用T4 DNA連接酶將純化的SOD2基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒片段于4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進行RⅠ和Ⅰ雙酶切鑒定，并將RⅠ和Ⅰ鑒定正確的陽性克隆進行DNA測序鑒定。

1.3 GST-SOD2融合蛋白的誘導(dǎo)表達

將DNA測序正確的陽性克隆菌于37 ℃培養(yǎng)至600=0.6?0.8時，分別加入IPTG和MnSO4，誘導(dǎo)GST-SOD2融合蛋白表達，同時探索了誘導(dǎo)條件對表達量的影響。取誘導(dǎo)后的菌液，10 000 r/min離心2 min，棄上清收集菌體沉淀，一部分菌體直接加入SDS-PAGE電泳樣品處理液，用于檢測全菌蛋白；另一部分加入9倍體積的緩沖液1 (10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/L KCl，pH 7.3)，冰浴超聲破碎30 min，然后10 000 r/min離心20 min，取上清電泳。

用12.5% SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色，比較不同條件下的菌體全蛋白與超聲破碎上清中的蛋白比例，分析融合蛋白在不同條件下的表達情況，篩選較好的可溶表達條件。

1.4 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的純化

在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)GST-SOD2融合蛋白的表達，收集誘導(dǎo)后菌體超聲破碎的上清液，按照GST親和樹脂說明書進行層析，分別收集親和柱穿透峰和洗脫峰，進行12.5%的SDS-PAGE。

SOD2重組蛋白純化：將GST-SOD2吸附到親和樹脂上，用大量平衡緩沖液洗去雜質(zhì)，往親和樹脂中加入牛凝血酶(1 U/mg融合蛋白)，22 ℃孵育16 h，放出洗脫峰1。再用1×PBS沖洗柱子，收集洗脫峰2。將洗脫峰1和洗脫峰2合并，加入肝素親和樹脂，按照柱子說明書，收集肝素親和柱的穿透峰，進行12.5%的SDS-PAGE。

1.5 GST-SOD2融合蛋白與SOD2的鑒定

分別使用SOD和GST活力檢測試劑盒測定蛋白的相應(yīng)酶活力，結(jié)合SDS-PAGE測定的蛋白分子量，鑒定是否為目標蛋白。

1.6 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的穩(wěn)定性

取300 μL GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白，分別置于25 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、80 ℃的水浴中保溫30 min，取出，待回至室溫，取樣分別測定殘留酶活力，分析融合蛋白的熱穩(wěn)定性。

取300 μL GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白，用廣泛緩沖液分別調(diào)至pH 4、5、6、7、8，4 ℃下放置30 min，取出，待回至室溫，取樣分別測定殘留酶活力，分析融合蛋白的pH穩(wěn)定性。

1.7 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的跨膜效應(yīng)

參照文獻[16]，分別用FITC標記GST-SOD2融合蛋白和SOD2重組蛋白。

取對數(shù)生長期的L-02細胞用含15%小牛血清的細胞培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，將其接種到24孔板，每孔40 000個細胞，培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，加PBS清洗2次，往每孔中分別加入400 μL 42 μg/mL的FITC-蛋白，37 ℃作用3 h。吸去蛋白液，用PBS清洗2次，加入250 μL細胞裂解液 (0.5% Triton-X-100+0.1% SDS)，漩渦振蕩2 min，放置4 ℃冰箱15 min后，1 200 r/min離心5 min，取200 μL上清液用熒光酶標儀檢測，并以BCA試劑盒測定上清液的蛋白含量。以每μg細胞蛋白所對應(yīng)的熒光強度來比較兩種融合蛋白的跨膜效率。

每組數(shù)據(jù)3個平行孔，采用Excel軟件進行統(tǒng)計處理，作標準差計算、檢驗等。>0.05為無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T-1-SOD2原核表達載體的構(gòu)建

將合成的人源SOD2基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒均用RⅠ和Ⅰ內(nèi)切酶進行雙酶切，膠回收純化酶切后的SOD2基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒片段，通過T4 DNA連接酶將SOD2基因定向插入到pGEX-4T-1質(zhì)粒的多克隆位點中。挑單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進行RⅠ和Ⅰ酶切鑒定，結(jié)果見圖1。重組子經(jīng)酶切鑒定后得到兩條目的帶，大約為4 946 bp和669 bp，分別與pGEX-4T-1質(zhì)粒和SOD2預(yù)期分子量一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行DNA 測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期的序列一致，證明SOD2基因已經(jīng)成功插入pGEX-4T-1載體，pGEX-4T-1-SOD2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2的構(gòu)建

2.2 GST-SOD2融合蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，收集菌體進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示。

由圖2可知，與未誘導(dǎo)的菌體相比，誘導(dǎo)溫度為20 ℃時，當誘導(dǎo)時間超過5 h時，菌體超聲破碎液的上清中可溶融合蛋白的表達量變化不大。

由圖3可知，同樣誘導(dǎo)6 h，不同的誘導(dǎo)溫度對GST-SOD2融合蛋白的表達量與可溶表達有很大影響。誘導(dǎo)溫度為16 ℃，融合蛋白的表達量較低，隨著誘導(dǎo)溫度的增加，融合蛋白的表達量隨之增加。但當誘導(dǎo)溫度達到37 ℃時，菌體超聲破碎液的上清中融合蛋白量開始降低，這表明可能有部分融合蛋白形成了包涵體。由圖3可知，最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

圖2 誘導(dǎo)時間對GST-SOD2融合蛋白可溶表達量的影響

圖3 誘導(dǎo)溫度對GST-SOD2融合蛋白可溶表達量的影響

由圖4可知，Mn2+濃度對GST-SOD2融合蛋白的可溶表達量影響不大 (圖4A)，但它會影響GST-SOD2融合蛋白的活性 (圖4B)。隨著Mn2+濃度的增加，GST-SOD2融合蛋白的活性逐漸增加，當Mn2+濃度達到1.5 mmol/L時，融合蛋白的活性達到最大值，隨著Mn2+濃度的繼續(xù)增加 (1.5?3.0 mmol/L)，融合蛋白的活性基本不變，但當Mn2+濃度繼續(xù)加大時，融合蛋白的活性反而隨Mn2+濃度的加大而減小。為此，將最佳Mn2+濃度定為1.5 mmol/L。

圖4 Mn2+濃度對GST-SOD2融合蛋白表達量和活性的影響

2.3 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的純化與鑒定

GST-SOD2表達菌超聲破碎后，收集上清，使用GST親和柱純化后，最終得到純化的GST-SOD2融合蛋白，將吸附在GST親和柱上的GST-SOD2融合蛋白經(jīng)牛凝血酶柱上酶切及肝素柱去凝血酶后，得到純化的SOD2重組蛋白，結(jié)果如圖5所示。

GST-SOD2融合蛋白和SOD2重組蛋白的理論分子量分別為51 kDa和25 kDa左右，圖5中GST-SOD2融合蛋白和SOD2重組蛋白的實際分子量分別約為46 kDa和25 kDa。由于GST-SOD2融合蛋白是由SOD2和GST兩種抗氧化酶融合而得的獨特蛋白，同時具有SOD和GST活力，因此我們進一步使用SOD和GST檢測試劑盒分別測定了該蛋白的酶活力。結(jié)果表明，純化所得的GST-SOD2融合蛋白的SOD活力為1 788 U/mg，GST活力為150 U/mg，純化所得的SOD2重組蛋白的SOD活力為2 000 U/mg。綜合分子量與活性分析的結(jié)果，可確認GST-SOD2融合蛋白得到正確表達，其酶切所得SOD2重組蛋白為預(yù)期的蛋白。

圖5 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的純化

2.4 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的穩(wěn)定性

由圖6-A可以看出，溫度對兩種蛋白的SOD活力影響都很大。隨溫度的升高，GST-SOD2融合蛋白的SOD活力幾乎是直線下降，當熱處理溫度達到60 ℃時，SOD活力基本完全喪失。與GST-SOD2相比，SOD2重組蛋白的熱穩(wěn)定性相對較高，在熱處理溫度小于40 ℃時，其活性變化不大，但當熱處理溫度超過40 ℃時，隨溫度的升高，SOD2重組蛋白的酶活開始迅速下降，在60 ℃水浴30 min后，活力僅余約9%，在80 ℃水浴30 min后，活力接近于0。

圖6 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的穩(wěn)定性

由圖6-B可以看出，pH對兩種蛋白的酶活也有很大影響。GST-SOD2融合蛋白的SOD活力在pH≤7的范圍內(nèi)隨pH的降低而降低，在pH 7?8的范圍內(nèi)活力緩慢增加，當pH超過8后，活性隨pH的升高而降低。pH對SOD2重組蛋白酶活的影響趨勢與GST-SOD2融合蛋白的相似，但SOD2重組蛋白在pH 7?8的范圍內(nèi)活力基本不變，且其整體的pH穩(wěn)定性高于GST-SOD2融合蛋白。

2.5 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的跨膜效應(yīng)

為檢測兩種蛋白是否能進入細胞，將它們進行FITC標記后通過細胞內(nèi)熒光強度的變化檢測其對正常人肝細胞株L-02的跨膜效果，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，與正常對照相比，兩種融合蛋白都有顯著的跨膜能力 (<0.05)，在42 μg/mL的劑量下，SOD2重組蛋白比GST-SOD2融合蛋白的跨膜效果略強一些，約為后者的1.1倍，但二者之間沒有顯著差異。

圖7 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的跨膜效應(yīng)

3 討論

超氧陰離子是引起機體氧化損傷特別是放射副作用的主要原因之一，SOD是唯一一種可以清除超氧陰離子的天然酶，在抗氧化損傷方面具有重要應(yīng)用價值。人源的3種SOD中，SOD2最為重要，因為其在ROS的發(fā)源地線粒體中發(fā)揮效用[2]，該蛋白在細胞中以前體形式合成，通過其信號肽進入線粒體基質(zhì)后，去除信號肽，折疊成成熟蛋白質(zhì)發(fā)揮功能[9]。現(xiàn)有的體外重組人源SOD2基本都去除了前導(dǎo)肽片段以得到成熟有活性的酶，但失去前導(dǎo)肽的SOD2是無法進入細胞發(fā)揮作用的，故此，SOD2功能研究雖多，但多是以轉(zhuǎn)基因的方式進行，臨床應(yīng)用頗有不便。

本研究選用pGEX-4T-1質(zhì)粒載體，利用載體自帶的GST，融合全長人源SOD2，構(gòu)建得到GST-SOD2融合蛋白。實驗結(jié)果表明，在N端融合的GST的幫助下，GST-SOD2融合蛋白實現(xiàn)了可溶表達，其可溶表達量受誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度影響。經(jīng)過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，最終確定在25 ℃時，往培養(yǎng)基中添加1.5 mmol/L Mn2+，然后利用IPTG誘導(dǎo)得到可溶的GST-SOD2融合蛋白。經(jīng)GST親和樹脂純化得到的純GST-SOD2融合蛋白比活為1 788 U/mg，比王峰等所得到的重組成熟SOD2蛋白的活性[15]略低一些。但其分子量幾乎是SOD2蛋白的2倍，因此，在同樣的摩爾濃度下，GST-SOD2的酶活為重組成熟SOD2蛋白2倍左右。在此基礎(chǔ)上，我們進一步通過超聲破碎、GST親和柱吸附、凝血酶柱內(nèi)酶切及肝素親和柱去除凝血酶得到了電泳純的SOD2重組蛋白，該蛋白分子量與SOD2全長序列的理論分子量相符，比活為2 000 U/mg，比王峰等所得到的重組成熟SOD2蛋白的活性[15]還略高一些。

在順利得到兩種具有酶活性的全長SOD2蛋白后，本研究對兩種蛋白的溫度和pH穩(wěn)定性進行了研究。結(jié)果表明，溫度和pH對兩種蛋白都有比較大的影響，但在生理條件 (37 ℃，pH 7.0) 下，GST-SOD2融合蛋白分別持有73.7%和91.6%的酶活性，去除GST標簽后，SOD2重組蛋白的溫度和pH穩(wěn)定性均有所增強，在37 ℃下，該蛋白具有95.7%酶活性，在pH 7?8的范圍內(nèi)，該蛋白基本保持100%酶活性。

GST是一個高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性及其在大腸桿菌中的表達量。作為常用的重組標簽之一，GST天然分子量為26 kDa，與His標簽要大得多，可能會對融合在一起的外源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。本研究中兩種蛋白穩(wěn)定性的差異表明GST標簽的融合對SOD2重組蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，這可能也是使GST-SOD2融合蛋白表觀分子量和理論分子量有所差別以及兩種具有全長序列的SOD2重組蛋白同時具有酶活性但比活又有差異的原因。

Mancini等從人脂肪肉瘤細胞LSA中發(fā)現(xiàn)一種具有SOD2酶活性的蛋白 (LSA-type-Mn-SOD)，30 kDa的LSA-type-MnSOD的序列與正常的人SOD2幾乎完全相同，但其N端帶有完整的信號肽[10-11]。已在大腸桿菌中生產(chǎn)得到該蛋白的重組蛋白，并已證實這種形式的SOD2可通過N端信號肽的介導(dǎo)進入細胞，其在清除內(nèi)部和細胞外自由基以及改善與增加的氧化應(yīng)激相關(guān)的病理狀況方面非常有效[12-14]。本研究得到的SOD2重組蛋白，N端帶有完整的信號肽，具有成熟SOD2的酶活性，還有顯著的跨膜能力，與LSA-type-MnSOD十分相似，可知其在防護氧化損傷方面具有很大的潛力。在GST-SOD2融合蛋白中，SOD2的信號肽位于兩種蛋白的中間，具有成熟SOD2的酶活性，也有顯著的跨膜能力，這表明該信號肽的介導(dǎo)跨膜能力可能像TAT穿膜肽一樣，不受其在蛋白中所處的位置影響，這有待進一步的實驗來證明。

GST在增加重組蛋白的可溶性之余，本身是一種在解毒過程中具有重要作用的轉(zhuǎn)移酶，具有抗氧化活性，可催化親核性的谷胱甘肽與自由基的結(jié)合反應(yīng)，起到解毒作用[17-18]。

本所前期實驗證實將Cu、Zn-SOD (SOD1)和TAT融合在一起后可以進入細胞，預(yù)防細胞內(nèi)的自由基過量導(dǎo)致的氧化損傷[19]。由于造成細胞損傷的自由基通常不只1種，我們進一步證實了將GST、穿膜肽和SOD1融合在一起得到的GST-TAT-SOD1融合蛋白比SOD1-TAT融合蛋白具有更好的放射防護效果[16]，可知復(fù)合抗氧化酶的應(yīng)用潛力強于單功能抗氧化酶。

與SOD2重組蛋白相比，GST-SOD2融合蛋白還具有GST活力，屬于可跨膜的復(fù)合抗氧化酶。二者的SOD比活相近，但分子量相差近1倍，在相同的摩爾濃度下后者的SOD活力比前者高出近1倍。因此，GST-SOD2融合蛋白可能具有比SOD2重組蛋白更強的抗氧化損傷方面的潛力。未來將進一步對本研究中兩種全長SOD2蛋白進行結(jié)構(gòu)及生物效應(yīng)的研究，以揭示其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

REFERENCES

[1] McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 1969, 244(22): 6049–6055.

[2] Genova ML, Ventura B, Giuliano G, et al. The site of production of superoxide radical in mitochondrial Complex I is not a bound ubisemiquinone but presumably iron-sulfur cluster N2. FEBS Lett, 2001, 505(3): 364–368.

[3] Gregory EM, Fridovich I. Oxygen toxicity and the superoxide dismutase. J Bacteriol, 1973, 114(3): 1193–1197.

[4] Damiano S, Trepiccione F, Ciarcia R, et al. A new recombinant MnSOD prevents the cyclosporine A-induced renal impairment. Nephrol Dial Transplant, 2013, 28(8): 2066–2072.

[5] Parizada B, Werber MM, Nimrod A. Protective effects of human recombinant mnsod in adjuvant arthritis and bleomycin-induced lung fibrosis. Free Radic Res Commun, 1991, 15(5): 297–301.

[6] Epperly MW, Gretton JE, Sikora CA, et al. Mitochondrial localization of superoxide dismutase is required for decreasing radiation-induced cellular damage. Radiat Res, 2003, 160(5): 568–578.

[7] Robbins MEC, Zhao W. Chronic oxidative stress and radiation-induced late normal tissue injury: a review. Int J Radiat Biol, 2004, 80(4): 251–259.

[8] Zhao W, Diz DI, Robbins ME. Oxidative damage pathways in relation to normal tissue injury. Br J Radiol, 2007, 80 Spec No 1: S23–S31.

[9] Del Maestro R, McDonald W. Subcellular localization of superoxide dismutases, glutatione peroxidase and catalase in developing rat cerebral cortex. Mech Ageing Dev, 1989, 48(1): 15–31.

[10] Mancini A, Borrelli A, Schiattarella A, et al. Tumor suppressive activity of a variant isoform of manganese superoxide dismutase released by a human liposarcoma cell line. Int J Cancer, 2006, 119(4): 932–943.

[11] Mancini A, Borrelli A, Schiattarella A, et al. Biophysical and biochemical characterization of a liposarcoma-derived recombinant MnSOD protein acting as an anticancer agent. Int J Cancer, 2008, 123(11): 2684–2695.

[12] Borrelli A, Schiattarella A, Mancini R, et al. A recombinant MnSOD is radioprotective for normal cells and radiosensitizing for tumor cells. Free Radic Biol Med, 2009, 46(1): 110–116.

[13] Rahman NA, Mori K, Mizukami M, et al. Role of peroxynitrite and recombinant human manganese superoxide dismutase in reducing ischemia-reperfusion renal tissue injury. Transplant Proc, 2009, 41(9): 3603–3610.

[14] Borrelli A, Schiattarella A, Mancini R, et al. The leader peptide of a human rec. MnSOD as molecular carrier which delivers high amounts of cisplatin into tumor cells inducing a fast apoptosis. Int J Cancer, 2011, 128(2): 453–459.

[15] Wang F, Shao M, Yang WJ, et al. High-level soluble expression of recombinant human manganese superoxide dismutase in, and its effects on proliferation of the leukemia cell. Protein Expr Purif, 2011, 77(1): 46–52.

[16] Pan JR, He HC, Su Y, et al. GST-TAT-SOD: cell permeable bifunctional antioxidant enzyme—a potential selective radioprotector. Oxid Med Cell Longev, 2016, 2016: 5935080.

[17] Douglas KT. Mechanism of action of glutathione-dependent enzymes. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1987, 59: 103–167.

[18] Leaver MJ, George SG. A piscine glutathione-transferase which efficiently conjugates the end-products of lipid peroxidation. Mar Environ Res, 1998, 46(1/5): 71–74.

[19] Pan JR, Su Y, Hou XJ, et al. Protective effect of recombinant protein SOD-TAT on radiation-induced lung injury in mice. Life Sci, 2012, 91(3/4): 89–93.

(本文責編 陳宏宇)

Expression, purification, stability and transduction efficiency of full-length SOD2 recombinant proteins

Jianru Pan1, Lijuan Chen1, Huocong He2, Ying Su2, Xiangling Wang1, Xian Li1, Cuihuang Chen1, Lunqiao Wu1, and Shutao Liu1

1 College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, Fujian, China 2 Laboratory of Radiation Oncology and Radiobiology, Fujian Cancer Hospital & Fujian Medical University Cancer Hospital, Fujian Key Laboratory of Tumor Translational Cancer Medicine, Fuzhou 350014, Fujian, China

Superoxide dismutase (SOD) family is necessary to protect cells from the toxicity of reactive oxygen species produced during normal metabolism. Among SODs, manganese-containing superoxide dismutase (Mn-SOD, SOD2) is the most important one. The DNA fragment containing the full nucleotide of full-length human SOD2 was synthesized and inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with tag GST. DNA construct was then transformed intoBL21 (DE3) and expression was induced with IPTG at 25 ℃. The recombinant fusion protein GST-SOD2 (46 kDa) was purified from the bacterial lysate by GST resin column affinity chromatography. GST tag was cleaved with thrombin, and a crude SOD2 recombinant protein (25 kDa) was obtained and further purified by heparin affinity chromatography. Activities of the two SOD2 proteins were 1 788 and 2 000 U/mg, respectively. Both SOD2 proteins were stable under physiological condition and cell-penetrating (<0.05). Our findings open the possibility to study the structure and effects of two full-length recombinant SOD2 proteins.

Mn-SOD, construction, fusion protein, expression and purification, stability, transduction efficiency

January 7, 2017; Accepted:March 10, 2017

Jianru Pan. Tel: +86-591-83732462; E-mail: panjr@fzu.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81472907).

國家自然科學(xué)基金(No. 81472907) 資助。