金毅然，馬曉娜，馬海濱，劉 婷，梁雪云

·論 著·

慢性缺氧對成年小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響

金毅然，馬曉娜，馬海濱，劉 婷，梁雪云

目的 通過觀察慢性缺氧對成年小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響，探討腦卒中導(dǎo)致的血管性癡呆的發(fā)病機制。方法 利用海馬區(qū)神經(jīng)干細胞慢性缺氧模型，通過神經(jīng)干細胞形態(tài)變化觀察及直徑測量、TUNEL染色和免疫細胞化學染色等方法，評價慢性缺氧對神經(jīng)干細胞形態(tài)、增殖能力、分化能力及凋亡的影響。結(jié)果 隨著缺氧時間延長，低氧組神經(jīng)干細胞球結(jié)構(gòu)破壞明顯，增長停滯。神經(jīng)干細胞球直徑測量結(jié)果顯示：正常組與第0天直徑(130.30±5.74)μm相比，第3天直徑(195.62±20.18)μm、第7天直徑(247.43±32.97)μm及第12天直徑(298.97±39.59)μm均明顯增長(P<0.05)；而低氧組神經(jīng)干細胞球直徑在不同時間點差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧組神經(jīng)干細胞有明顯TUNEL陽性表達。免疫細胞化學染色結(jié)果顯示：缺氧組中，偶見神經(jīng)干細胞表達Nestin蛋白，而GFAP蛋白表達明顯增強。結(jié)論 慢性缺氧影響成年小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，這可能是腦卒中血管性癡呆的發(fā)病機制之一。

慢性缺氧；體外模型；神經(jīng)發(fā)生

隨著腦卒中的發(fā)病率持續(xù)增加，血管性癡呆(VD)可能會成為老年期癡呆的第一大病因[1]。VD是指由腦血管病變引起的或與腦血管病變有關(guān)的一種獲得性的慢性進行性智力損害綜合征[2]。目前VD的發(fā)病機制還不清楚，臨床缺乏有效的治療手段。研究已證明，海馬DG區(qū)的神經(jīng)發(fā)生與人類認知能力相關(guān)[3]。關(guān)于腦缺血對海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響及機制目前仍無定論，探明腦缺血對海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響及機制必將有利于臨床VD的治療。本實驗通過建立體外海馬區(qū)神經(jīng)干細胞慢性缺氧模型，探討慢性缺氧對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：本實驗于2014-2016年在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院寧夏人類干細胞研究所開展。Neurobasal-A 培養(yǎng)基(GIBCO公司)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Peprotech公司)，(EGF，Peprotech公司)，無血清細胞培養(yǎng)添加劑B27(GIBCO公司)，青鏈霉素(GIBCO公司)，山羊血清，TritonX-100,Nestin抗體(Santa Cruz公司)，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗(Santa Cruz公司),NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)(stemcell公司)，Enzymatic Dissociation of Adult Mouse and Rat CNS Tissue(Stemcell 公司)。

1.2 方法

1.2.1 海馬區(qū)神經(jīng)干細胞培養(yǎng)：取8周成年C57BL/6小鼠，斷頸處死后，無菌條件下取出大腦，仔細剝離海馬組織齒狀回，DMEM漂洗2次后，盡可能剪碎組織，以上操作均在冰上進行。將剪碎組織移入離心管，加入1 mL Tryple，37 ℃水浴，30 min。消化結(jié)束后，1 200 r/,om,離心5 min。棄上清液后，加入Neurobasal-A /B27培養(yǎng)液，充分吹打均勻后，調(diào)整細胞數(shù)，入培養(yǎng)箱，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。每隔3 d，半量換液1次。

1.2.2 氧-葡萄糖剝奪(OGD)模型：將細胞培養(yǎng)液換為無糖型培養(yǎng)基后，置于低氧(5% O2)處理3、7、12 d，根據(jù)細胞生長狀態(tài)，篩選出適宜的低氧處理時間。

1.2.3 TUNEL染色：按說明書，將細胞換入固定液固定后，加入TUNEL試劑，37 ℃孵育1 h。PBS清洗后，熒光倒置顯微鏡觀察陽性細胞。

1.2.4 免疫細胞化學染色：細胞經(jīng)固定后，滴加Nestin或GFAP抗體，4 ℃孵育過夜，加入熒光標記的IgG,室溫孵育1 h。PBS清洗后，熒光顯微鏡觀察陽性細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，多組間比較采用單因素方差分析，同一時間點低氧組和正常組比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對神經(jīng)干細胞形態(tài)變化影響：與正常組相比，低氧組神經(jīng)干細胞球在3 d后中心陰影明顯，結(jié)構(gòu)松散，神經(jīng)干細胞球增長停滯，在低氧培養(yǎng)12 d后細胞球明顯萎縮。分別在培養(yǎng)3、7、12 d測量神經(jīng)干細胞球直徑，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，正常組與第0天直徑(130.30±5.74)μm相比，第3天直徑(195.62±20.18)μm、第7天直徑(247.43±32.97)μm及第12天直徑(298.97±39.59)μm均明顯增長(P<0.05)，見表1。

表1 不同時間點正常組與低氧組神經(jīng)干細胞球直徑測量

注:*與正常組第0天相比，P<0.05；#與同一時間點正常組相比，P<0.05。

2.2 缺氧對神經(jīng)干細胞增殖能力影響：隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，正常組神經(jīng)干細胞球體積增長明顯，而低氧組神經(jīng)干細胞球無明顯增長。

2.3 缺氧對神經(jīng)干細胞凋亡影響：在培養(yǎng)12 d后，2組神經(jīng)干細胞球染色結(jié)果顯示，正常組細胞偶有TUNEL陽性細胞(3個±1個/視野)，而低氧組TUNEL陽性細胞數(shù)目明顯增多(16個±4個/視野)，2組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 缺氧對神經(jīng)干細胞分化能力影響：在培養(yǎng)12 d后，神經(jīng)干細胞標志Nestin染色結(jié)果顯示，正常組細胞Nestin陽性細胞較多，而低氧組Nestin陽性細胞數(shù)目明顯減少；相反，膠質(zhì)細胞標志GFAP在正常組表達較少，而在低氧組表達明顯較多。

3 討論

海馬齒狀回是成人大腦神經(jīng)干細胞存在的主要腦區(qū)之一[4]。在正常情況下，成人海馬區(qū)齒狀回的神經(jīng)前體細胞增殖轉(zhuǎn)化為成神經(jīng)細胞，不成熟的成神經(jīng)細胞移行到齒狀回內(nèi)顆粒細胞層，接著分化為齒狀回顆粒細胞，幾天內(nèi)，新生的神經(jīng)元向分子層伸出突起，把軸突投射到CA3區(qū)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷造成神經(jīng)元退行性變的同時，也促進了神經(jīng)再生[6]。神經(jīng)發(fā)生可以替代損傷或者死亡的神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞。相對于胚胎期神經(jīng)干細胞，成人神經(jīng)干細胞的增殖能力較為低下，這和成人腦內(nèi)神經(jīng)干細胞的微環(huán)境改變有關(guān)。腦內(nèi)微環(huán)境改變，直接影響干細胞的分化及遷移路線，進而影響大腦功能[7]。

細胞生存微環(huán)境的改變可以導(dǎo)致神經(jīng)元細胞的凋亡甚至死亡，同時也可能是導(dǎo)致生發(fā)中心神經(jīng)干細胞增殖和分化的重要因素[8-10]。本實驗結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，正常組神經(jīng)干細胞球體積增長明顯，而低氧組神經(jīng)干細胞球無明顯增長，說明低氧會抑制神經(jīng)干細胞的增殖。同時我們發(fā)現(xiàn)，正常組神經(jīng)干細胞偶有TUNEL陽性的凋亡細胞，而低氧組TUNEL陽性的凋亡細胞數(shù)目明顯增多，說明腦缺血的低氧條件會促進海馬區(qū)神經(jīng)干細胞的凋亡。

神經(jīng)干細胞可以分化為不同類型的膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元[11]。在癡呆患者大腦中，膠質(zhì)細胞增生活躍，而神經(jīng)元變性、壞死[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血引起的神經(jīng)發(fā)生，大多數(shù)神經(jīng)干細胞增殖分化為膠質(zhì)細胞，沒有或鮮有分化為神經(jīng)元。本實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)12 d后，神經(jīng)干細胞標志NESTIN染色正常組Nestin陽性細胞較多，而低氧組Nestin陽性細胞數(shù)目明顯減少；相反，膠質(zhì)細胞標志GFAP在正常組表達較少，而在低氧組表達明顯較多。本結(jié)果表明，慢性缺氧可以導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞干性降低且具有向膠質(zhì)細胞分化的傾向。

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The effects of chronic ischemia on hippocampal neurogenesis of adult mice

JIN Yiran,MA Xiaona,MA Haibin,LIU Ting,LIANG Xueyun.

The Ningxia Human Stem Cell Research Institution,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

LIANG Xueyun,Email:liangxy2104@hotmail.com

Objective To explore the possible mechanisms of ischemia induced vascular dementia by evaluating the affection of chronic ischemia on hippocampal neurogenesis of adult mice.Methods Chronic ischemia model were setting up in vivo,the morphology of the neurosphere was observed,the proliferation ability of the neurosphere was evaluated by diameter measure;the apoptosis of the neurosphere was test by TUNEL staining;the differentiation ability of the neurosphere was examined by immune-cytostaining.Results Compared with the neurosphere in the normal control group,the neurosphere in the ischemic group seemed stopped to proliferation and its structure was destroyed.The TUNEL positive cell number was more in ischemic group than that in normal control group.The expression of nestin was lower in ischemic group than that in normal control group,but the expression of GFAP was more in ischemic group than that in normal control group.Conclusion Chronic ischemia may has effects on hippocampal neurogenesis of adult mice,which might be one of the mechanisms of ischemia induced vascular dementia.

Chronicischemia;Invivochronicischemiamodel;Neurogenesis

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0582

國家自然科學基金項目(81460186)；寧夏自然科學基金項目(NZ 14130)

寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院寧夏人類干細胞研究所，寧夏 銀川 750004

金毅然(1987-),女，回族，本科，技師，主要從事干細胞研究工作。

梁雪云，Email:liangxy2104@hotmail.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0844.006.html

R363

A

2016-12-06 [責任編輯]馬興忠