陳克研，董婉維

(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽 110001)

富氫液通過PI3K通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

陳克研，董婉維

(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽 110001)

目的 探討富氫液對(duì)大鼠腦缺血再灌注致海馬神經(jīng)元凋亡及PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路表達(dá)的影響。方法 采用線栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈，建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)模型，SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham 組)、缺血/再灌注組(I/R組)和富氫液處理組(HRS組)，每組 10只；各組于再灌注后24 h，ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子IL-6、TNF-α及IL-1β的變化；HE染色觀察海馬變化，TUNEL 法觀察腦組織細(xì)胞凋亡情況；Western blot法檢測(cè)海馬p-PI3K、Akt、caspase-3和FoxO1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與Sham組相比，I/R組錐體細(xì)胞排列疏松，大量錐體細(xì)胞死亡，海馬凋亡細(xì)胞增多，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、表達(dá)顯著增加(P< 0.05)，腦組織中p-PI3K、Akt、caspase-3表達(dá)顯著升高，F(xiàn)oxO1蛋白降低，兩組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組炎癥因子顯著降低；p-PI3K、Akt、caspase-3表達(dá)水平均顯著降低，，F(xiàn)oxO1蛋白升高(P< 0.05)。結(jié)論 富氫液可以減輕缺血再灌注導(dǎo)致的腦損傷，其機(jī)制可能與PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)。

富氫液；缺血再灌注；PI3K；FoxO1；細(xì)胞凋亡

對(duì)缺血腦組織進(jìn)行及時(shí)再灌注是治療腦卒中的有效措施之一，在腦缺血再灌注時(shí)，缺血局部組織會(huì)釋放大量炎癥因子，這些激活的炎癥細(xì)胞會(huì)浸潤到局部組織，并激活相關(guān)的炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織發(fā)生更嚴(yán)重的炎癥性損傷[1-3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷會(huì)伴隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且細(xì)胞凋亡會(huì)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，凋亡在缺血/再灌注損傷的病理過程中的作用不容忽視[4]。目前認(rèn)為，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和凋亡與磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)及其下游蛋白AKT信號(hào)通路的激活息息相關(guān)[5]。氫氣通過特殊加壓方式溶到生理鹽水而獲得的富氫液(hydrogen rich saline，HRS)是很好的抗氧化物，集高氫量、弱堿性、負(fù)電位、小分子水為一體，平衡身體酸堿度，可有效防止多種疾病[6，7]。已有報(bào)道顯示HRS在肝臟、腸缺血再灌注中對(duì)相應(yīng)臟器有保護(hù)作用，而有關(guān)HRS在腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)中是否具有器官保護(hù)作用、其機(jī)制是否與抗炎性反應(yīng)有關(guān)尚缺少相關(guān)研究。本研究通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，采用富氫液進(jìn)行預(yù)處理，探討富氫液對(duì)缺血再灌注大鼠腦損傷和PI3K通路蛋白表達(dá)的影響，闡明富氫液對(duì)腦組織損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制，旨在為富氫液治療大腦缺血/再灌注損傷提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD大鼠40只，250 ～ 300 g，源于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部【SCXK(遼)2013-0001，SYXK(遼)2013-0007)】。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)，缺血/再灌注組(I/R組)，富氫液處理組(HRS組)。H組大鼠于再灌注開始靜脈泵注富氫水5 mL/(kg·h)至灌注結(jié)束；模型組動(dòng)物注射等量的生理鹽水；假手術(shù)組組動(dòng)物在麻醉后僅動(dòng)脈分離手術(shù)。

1.2 富氫水的制備

參照文獻(xiàn)[8]制備富氫水溶液，將醫(yī)用注射液軟包裝袋，用低壓艙0.8個(gè)大氣壓減壓處理24 h，常壓下置12 h，將飽和部分的氣體析出；將包裝袋置于4℃冰箱冷卻；取預(yù)冷的生理鹽水，取總體積的15%，注入同體積的純氫氣；將注入氫氣后的鹽水放入加壓艙，4℃下持續(xù)加壓24 h，使氫氣充分溶入注射液，取出后置4℃保存。

1.3 腦缺血/再灌注動(dòng)物模型的制備

腦缺血/再灌注動(dòng)物模型的制備參照文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。大鼠經(jīng)腹腔注射 2% 戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，結(jié)扎右側(cè)翼腭動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。在大鼠頸外動(dòng)脈距結(jié)扎處約0.5 cm處用注射器針頭刺一小口，將尼龍線栓經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn) 18 ～ 20 mm 感到輕微阻力時(shí)，即已阻斷大腦中動(dòng)脈。阻斷 2 h 后，拔出尼龍線并扎緊動(dòng)脈殘端，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血/再灌注損傷模型。

1.4 標(biāo)本采集

各組于缺血再灌注術(shù)后24 h處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)頸內(nèi)靜脈采血3 mL離心法分離血漿，采用ELISA試劑盒(美國 USCN)檢測(cè)血漿中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β；另取右側(cè)海馬組織，置于福爾馬林液中，常規(guī)石蠟包埋，HE染色觀察組織學(xué)變化，TUNEL染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況；另一部分置液氮中，Western blot技術(shù)檢測(cè)p-PI3K、Akt、caspase-3和FoxO1蛋白表達(dá)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 富氫液對(duì)缺血再灌注大鼠海馬形態(tài)學(xué)改變的影響

Sham組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，排列規(guī)則、胞質(zhì)均染，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，未見明顯病變；I/R組大鼠海馬區(qū)域細(xì)胞排列紊亂，核固縮、溶解，神經(jīng)元細(xì)胞及錐體細(xì)胞死亡，細(xì)胞數(shù)量明顯減少；HRS組大鼠可見海馬區(qū)域細(xì)胞紊亂程度減輕，變性/壞死的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少(圖1)。

2.2 富氫液對(duì)血漿中炎癥因子表達(dá)的影響

與sham組相比，I/R組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、和TNF-α的表達(dá)顯著升高，差異有顯著性(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低，差異有顯著性(P< 0.05)(表1)。

2.3 富氫液對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL陽性細(xì)胞呈棕黃色，細(xì)胞核著色。與sham組比較，I/R組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，差異有顯著性(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組腦組織海馬區(qū)域TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P< 0.05)(圖2)。

2.4 富氫液對(duì)大鼠凋亡蛋白p-PI3K、Akt、caspase-3和FoxO1蛋白表達(dá)的影響

與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中p-PI3K、Akt、caspase-3表達(dá)顯著升高，F(xiàn)oxO1蛋白降低，兩組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組大鼠腦組織p-PI3K、Akt、caspase-3表達(dá)顯著降低，F(xiàn)oxO1蛋白升高，差異有顯著性(P< 0.05)(圖3)。

圖1 大鼠海馬的組織學(xué)改變(HE染色)Fig.1 Histological changes of hypocampal neurons in the rats (HE staining)

指標(biāo)/分組Index/Group假手術(shù)組Shamgroup缺血/再灌注組I/Rgroup富氫液處理組HRSgroupS100?β/ng/L3687±0．9111296±1．45a6842±1．30abTNF?α/μg/L7554±10．2119651±30．31a11847±10．14abIL?6/ng/L2097±2．386869±3．39a4536±5．14ab

注：與Sham組相比，aP< 0.05；與HRS組相比，bP< 0.05。

Note. Compared with the sham group,aP<0.05; Compared with the HRS group,bP<0.05.

圖2 海馬神經(jīng)元的凋亡狀況(TUNEL染色)Fig.2 Apoptosis in the hypocampal neurons in the rats (TUNEL staining)

圖3 Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織中 多種基因蛋白表達(dá)的比較Fig.3 Changes of expressions of p-PI3K, Akt, caspase-3, FoxO1, and GAPDH in the rats detected by Western blot assay

3 討論

本研究通過建立大鼠局灶性缺血再灌注腦損傷模型，采用HE染色、TUNEL、ELISA和Western blot等技術(shù)，觀察富氫液對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3、炎癥因子和PI3K/Akt/FoxO1通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，富氫液可以減少缺血再灌注導(dǎo)致的大腦海馬區(qū)形態(tài)學(xué)改變，降低炎癥因子表達(dá)、減少細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。此外，研究發(fā)現(xiàn)，富氫液可以降低缺血再灌注導(dǎo)致的PI3K、Akt和FoxO1通路蛋白表達(dá)，結(jié)果提示富氫液可以減輕缺血再灌注導(dǎo)致的大鼠腦損傷，其機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt/FoxO1通路來實(shí)現(xiàn)。

氫氣本身就是一種最佳天然抗氧化劑，所以加入氫氣的水具有很強(qiáng)的還原功能，可以中和身體血液和細(xì)胞里的自由基。將氫氣溶于生理鹽水制備富氫液很容易進(jìn)入細(xì)胞通道，參與新陳代謝，從而促進(jìn)細(xì)胞排毒，增加了細(xì)胞的水合作用，提升人體的免疫力[10，11]。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，人或動(dòng)物引用HRS后，對(duì)心、肝臟、肺臟和腸等缺血再灌注引發(fā)的相應(yīng)器官損傷有明顯的抑制作用，可以減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)和過度氧化，對(duì)臟器有保護(hù)作用[12，13]。研究發(fā)現(xiàn)，富氫液對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷進(jìn)行干預(yù)，它可以有效減少肺和支氣管肺泡灌洗液的蛋白濃度、降低肺濕/干重比，顯著抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1α、VCAM-1 mRNA表達(dá)，結(jié)果表明，富氫液在臨床上可用于有效治療急性肺損傷的抗炎劑[14]。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)富氫液可以降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清LDH、ALP、IL-1β、TNF-α和MPO 水平，而增加前列腺素E2和IL-10水平，結(jié)果提示富氫液可用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，為富氫液的臨床抗炎應(yīng)用提供了直接證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，富氫液顯著降低缺血再灌注大鼠腦組織促炎因子IL-1β、IL-6、和TNF-α的表達(dá)。此外，富氫液還可以顯著降低缺血再灌注導(dǎo)致促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)，提示富氫液對(duì)缺血再灌注大鼠腦損傷有保護(hù)作用，這種作用是通過抗炎和抗凋亡實(shí)現(xiàn)的。

既往的研究證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路參與了腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡，內(nèi)在通路和外部的炎癥激活時(shí)均可驅(qū)動(dòng)AKT介導(dǎo)的細(xì)胞存活通路，激活磷脂酰肌醇3激酶連接AMPA受體的胞內(nèi)C末端，可激活其下游激酶Akt ser473殘基磷酸化，誘導(dǎo)下游蛋白FoxO1向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，磷酸化Ser9導(dǎo)致FoxO1失活，磷酸化β連環(huán)蛋白促進(jìn)細(xì)胞生存。同時(shí)抑制下游蛋白caspase-3激活，從而抑制促炎因子釋放，發(fā)揮抗炎、抗凋亡、減少腦損傷作用[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，缺血再灌注大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 和p-FoxO1蛋白表達(dá)均顯著增加，而經(jīng)過富氫液預(yù)處理后大鼠腦組織p-PI3K、p-Akt 和p-FoxO1表達(dá)顯著降低，結(jié)果提示，富氫液可能通過激活PI3K/Akt/FoxO1通路，對(duì)缺血再灌注大鼠腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上，富氫液可以減少缺血再灌注導(dǎo)致的大腦海馬區(qū)形態(tài)學(xué)改變，降低炎癥因子表達(dá)、減少細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，其機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt/FoxO1通路來實(shí)現(xiàn)。

[1] 王斌, 曹慧, 沈甜, 等. 麝香、冰片對(duì)大鼠腦缺血-再灌注急性期和恢復(fù)早期炎性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J]. 中藥材, 2015, 38(10): 2139-2143.

[2] Yang SI, Yuan Y, Jiao S, et al. Calcitonin gene-related peptide protects rats from cerebral ischemia/reperfusion injury via a mechanism of action in the MAPK pathway[J]. Biomed Rep, 2016, 4(6): 699-703.

[3] 曾兆祿, 韓繼超, 薛云, 等. 針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 26(2): 62-66.

[4] Diaz-Ruiz A, Roldan-Valadez E, Ortiz-Plata A, et al. Dapsone improves functional deficit and diminishes brain damage evaluated by 3-Tesla magnetic resonance image after transient cerebral ischemia and reperfusion in rats[J]. Brain Res, 2016,1646: 384-392.

[5] Tang Y, Liu X, Zhao J, et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance is associated with Drp1 inhibition in cerebral ischemia-reperfusion injury of mice[J]. Brain Res, 2016,1646: 73-83.

[6] 潘震華 趙悅 于宏穎，等. 飽和氫鹽水對(duì)心肌缺血再灌注老年大鼠心肌細(xì)胞自噬的影響 [J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 95(25): 2022-2026.

[7] Tao B, Liu L, Wang N, et al. Effects of hydrogen-rich saline on aquaporin 1, 5 in septic rat lungs [J]. J Surg Res, 2016, 202(2): 291-298.

[8] Sun Q, Cai J, Zhou J, et al. Hydrogen-rich saline reduces delayed neurologic sequelae in experimental carbon monoxide toxicity [J]. Crit Care Med, 2011,39(4): 765-769.

[9] Li YH, Qiao LJ, Lin XY. Mechanism of low molecular weight GTP binding protein RAC1 in injury of neural function of rats with cerebral ischemia reperfusion [J]. Asian Pac J Trop Med, 2016, 9(5): 474-477.

[10] Tian Y, Guo S, Zhang Y, et al. Effects of hydrogen-rich saline on hepatectomy-induced postoperative cognitive dysfunction in old mice [J]. Mol Neurobiol, 2017, 54(4): 2579-2584.

[11] Qin L, Tao Y, Wang L, et al. Hydrogen-rich saline as an innovative therapy for cataract: a hypothesis [J]. Med Sci Monit, 2016, 22: 3191-3195.

[12] Shi Q, Chen C, Deng WH, et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute hepatic injury in acute necrotizing pancreatitis by inhibiting inflammation and apoptosis, involving jnk and p38 mitogen-activated protein kinase-dependent reactive oxygen species[J]. Pancreas, 2016, 45(10): 1424-1431.

[13] Du H, Sheng M, Wu L, et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy[J]. Transplantation, 2016, 100(3): 563-570.

[14] Meng X, Chen H, Wang G, et al. Hydrogen-rich saline attenuates chemotherapy-induced ovarian injury via regulation of oxidative stress[J]. Exp Ther Med, 2015,10(6): 2277-2282.

[15] Huang SL, Jiao J, Yan HW. Hydrogen-rich saline attenuates steroid-associated femoral head necrosis through inhibition of oxidative stress in a rabbit model[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(1): 177-182.

[16] 薛金龍, 孫芳玲, 劉婷婷, 等. 莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠Wnt7a和APC表達(dá)的影響[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(9): 9-13.

[17] 劉志輝. 立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡及PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的影響 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 26(3): 58-63.

[18] Tsai WH, Wu CH, Yu HJ, et al. l-Theanine inhibits proinflammatory PKC/ERK/ICAM-1/IL-33 signaling, apoptosis, and autophagy formation in substance P-induced hyperactive bladder in rats [J]. Neurourol Urodyn, 2017, 36(2): 297-307.

Hydrogen-rich saline reduces cerebral ischemia-reperfusion injury in ratsvia PI3K pathway

CHEN Ke-yan， DONG Wan-wei

(Department of Laboratory Animal Science, China Medical University, Shenyang 110001, China)

Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline on apoptosis in hippocampal neurons induced by cerebral ischemia-reperfusion in rats and PI3K/Akt/FoxO1 signaling pathway. Methods The rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by thread-occlusion of the middle cerebral artery in rats. SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham group), ischemia-reperfusion group (I/R group) and hydrogen-rich saline treatment group (HRS group), 10 rats in each group. At 24 h after reperfusion, the serum levels of IL-6, TNF-a and IL-1β were detected by ELISA. Histological changes of the hippocampus were observed by pathology using HE staining. Apoptosis in brain tissues was observed by TUNEL staining. The expression changes of p-PI3K, Akt, caspase-3 and FoxO1 proteins were detected by Western blot assay. Results Compared with the sham group, pyramidal cells were arranged loosely in the I/R group and a large number of pyramidal cells were necrotized, and the amount of apoptotic hippocampal cells was increased. The levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly increased (P< 0.05), as well as the expression of p-PI3K, Akt and caspase-3 in the brain tissue. However, the expression of FoxO1 protein was decreased. There were significant differences between the two groups (P< 0.05). Compared with the I/R group, the inflammatory factors were significantly decreased in the HRS group. The expressions of p-PI3K, Akt and caspase-3 were also significantly decreased, while the expression of FoxO1 protein was increased (P< 0.05). Conclusions Hydrogen-rich saline can reduce brain injury caused by ischemia-reperfusion, and its mechanism may be related to PI3K/Akt/FoxO1 signaling pathway.

Hydrogen rich saline; Ischemia reperfusion; PI3k; FoxO1; Apoptosis

國家自然青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31201758)；中國醫(yī)科大學(xué)新教師基金項(xiàng)目(XZR20160036)。

陳克研(1983-)，男，博士，講師，從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究。 E-mail: chenkeyan888@163.com

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0013-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.003

2017-01-05