郭 羽，王 洪，魏 杰，王錫巖，李曉暉，閔凡貴，岳秉飛*

(1.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100176； 2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050； 3.廣東省實驗動物監(jiān)測所,廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

微衛(wèi)星技術(shù)在NIH小鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

郭 羽1#，王 洪2#，魏 杰2，王錫巖1，李曉暉1，閔凡貴3，岳秉飛2*

(1.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100176； 2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050； 3.廣東省實驗動物監(jiān)測所,廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

目的 應(yīng)用微衛(wèi)星DNA技術(shù)對A單位NIH小鼠和B單位NIH小鼠的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析。方法 利用30個微衛(wèi)星位點對2個NIH小鼠種群進(jìn)行PCR擴(kuò)增和STR掃描，借助統(tǒng)計軟件Popgene 1.32進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果 A單位NIH群體獲得74個等位基因型，平均雜合度為0.3108，多態(tài)性信息含量為0.2637；B單位NIH群體獲得76個等位基因型，平均雜合度為0.3257，多態(tài)性信息含量為0.2777。群體間比較顯示，群體間分化系數(shù)為0.3932，遺傳一致性指數(shù)0.3971，遺傳距離為0.9235，群體差異顯著。結(jié)論 兩個NIH小鼠群體間存在嚴(yán)重的遺傳分化，形成了兩個不同的封閉群群體。

封閉群；NIH小鼠；微衛(wèi)星DNA；遺傳結(jié)構(gòu)

N:NIH小鼠(SW)，叫作NIH小鼠，也叫作NIH (BXS)小鼠，于1936年Walter Reed Army Institute of Research選取12只瑞士種小鼠育種，起初使用近交方式交配(BXS)繁殖傳代，后又封閉繁育達(dá)十年以上培育而成。NIH小鼠成為有近交歷史的封閉群動物，具有遺傳穩(wěn)定，個體差異較小的優(yōu)點。NIH(SW)為屏障環(huán)境生活的小鼠，體型小，產(chǎn)仔多，生長繁殖快，雄性好斗，飼養(yǎng)管理方便，對環(huán)境的適應(yīng)性和對疾病的抵抗力強。1977年WHO建議各國使用NIH小鼠作為百日咳菌苗和破傷風(fēng)檢定用標(biāo)準(zhǔn)動物，結(jié)合我國以KM小鼠檢定百日咳時出現(xiàn)較大結(jié)果差異的問題，衛(wèi)生部防疫司決定引進(jìn)NIH小鼠。1980年7月2日由北京生物制品研究所引入該種小鼠，在國內(nèi)繁育并推廣使用。1991年又從中國藥品生物制品檢定所(現(xiàn)已更名為：中國食品藥品檢定研究院)引進(jìn)400對NIH小鼠更新血緣，兩個NIH(H-2q型)群體生產(chǎn)至今。為降低近交系數(shù)，每群500對NIH小鼠，嚴(yán)格按照封閉群生產(chǎn)繁殖原則進(jìn)行獨立保種，閉鎖繁育。

NIH小鼠是我國用量較大的小鼠之一，我國各地區(qū)的NIH小鼠種群并不多，主要存在于國家實驗動物種子中心和部分實驗動物生產(chǎn)企業(yè)，以及生物制藥企業(yè)。NIH小鼠廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)、細(xì)菌學(xué)等領(lǐng)域，以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定工作中，還可用于制備單克隆抗體。NIH小鼠由于對病毒和細(xì)菌比較敏感，中國藥典上規(guī)定：百日咳疫苗原液效價測定、百日咳疫苗原液毒性檢查、乙型腦炎滅活疫苗(Vero細(xì)胞)免疫原性檢查、重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞)效價測定，以上四項試驗必須使用NIH小鼠進(jìn)行[1]。那么，封閉群小鼠的群體遺傳質(zhì)量必然決定應(yīng)用NIH小鼠的疫苗檢定工作的穩(wěn)定性和有效性。

此前，我們測定了A單位NIH小鼠群體的血液生理生化指標(biāo)和臟器系數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果與B單位的NIH小鼠群體的一些指標(biāo)存在一定的差異，研究結(jié)果表明A單位NIH小鼠已形成群體自身特有的生物學(xué)特性參數(shù)[2]。本研究將應(yīng)用微衛(wèi)星DNA技術(shù)比較分析A單位NIH群體和B單位NIH群體的遺傳結(jié)構(gòu)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

隨機選取A單位NIH小鼠30只，8周齡，SPF級，雌雄各半【SCXK(京)2015-0012】【SYXK(京)2011-0008】。隨機選取B單位NIH小鼠30只，8周齡，SPF級，雌雄各半【SCXK(京)2014-0013】【SYXK(京)2011-0008】。

1.2 試劑和儀器設(shè)備

Taq酶、50 bp DNA marker、dNTP、瓊脂糖均購自Takara公司；其余試劑均為國產(chǎn)。日本Biospec-mini紫外分光光度計，Mettler GB303電子天平，Bio-Rad MyCycler型PCR儀，Bio-Rad Model 3000Xi型電泳儀，Gel Logic 212PRO 紫外與可見光凝膠分析裝置。

1.3 DNA提取

動物安樂死后，取尾部100 mg，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。?00 mg組織加入到含有蛋白酶K的抽提緩沖液中消化過夜，酚/氯仿法提取DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測吸光度A260/A280值在1.8 ～ 2.0之間，樣品合格。取適量稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增和STR掃描

30對微衛(wèi)星引物分別以FAM、HEX、TAMRA進(jìn)行熒光標(biāo)記，由北京美吉桑格生物醫(yī)藥有限公司合成[3]。

A單位的30份NIH小鼠樣本基因組DNA和B單位的30份封閉群NIH小鼠樣本基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中：10× buffer 2 μL，上下游引物(100 pmol/μL)各1 μL，4× dNTP 100 μmol/L 1.2 μL，Taq酶0.2 μL，50 ～ 100 ng 基因組DNA 1 μL，純水(ddH2O)13.6 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min， 94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，接72℃繼續(xù)延伸8 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳150 V，30 min，拍照成相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1∶3∶5 混合。取1 μL進(jìn)行STR掃描檢測。

1.5 STR掃描結(jié)果的判讀

利用GeneMapperv4.0軟件，進(jìn)行結(jié)果分析。掃描結(jié)果出現(xiàn)兩種波形：一種為純合基因型，只有一個主波；另一種為雜合基因型，有兩個主波。根據(jù)軟件讀出波峰處的擴(kuò)增產(chǎn)物的bp數(shù)。由GeneMapperv4.0軟件讀出該群體30個樣本在每個微衛(wèi)星位點的擴(kuò)增片斷大小。每個位點的等位基因根據(jù)擴(kuò)增片斷從小到大順序排列記錄為a，b，c，d等。將所有樣本的每個微衛(wèi)星位點的基因型以ab，bb等形式輸入Popgene 1.32軟件的數(shù)據(jù)文件以供統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用Popgene 1.32軟件，分析得到在每個微衛(wèi)星位點上30個樣本的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)和平均雜合度。利用Cervus 3.0軟件計算群體平均多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。按照Nei(1978)氏法計算兩個單位NIH小鼠群體的遺傳一致性指數(shù)和遺傳距離[4]。

2 結(jié)果

2.1 A單位NIH小鼠群體的測定結(jié)果

A單位NIH小鼠微衛(wèi)星測定結(jié)果見表1。在30個微衛(wèi)星位點共檢測出74個等位基因，各基因座等位基因數(shù)1 ～ 5個不等，其中5個基因座(D5Mit48、D10Mit12、D15Mit5、D12Nds11、D14Mit3)呈現(xiàn)單態(tài)性，只有1個等位基因，平均等位基因數(shù)為2.4667。平均雜合度為0.3108。Hardy-Weinberg遺傳平衡P值中，有17個位點P> 0.05。利用Cervus 3.0軟件統(tǒng)計得到A單位NIH群體的30個微衛(wèi)星位點的平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.2637。剔除5個單態(tài)性位點，剩余25個位點的平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.3165。

注：P> 0.05表示該位點處于遺傳平衡；P< 0.01 表示該位點處于遺傳分化。

Note.P> 0.05 indicates the genetic equilibrium in the loci;P< 0.01 indicates the genetic differentiation in the loci.

2.2 B單位NIH小鼠群體的測定結(jié)果

B單位NIH小鼠微衛(wèi)星測定結(jié)果見表2。在30個微衛(wèi)星位點共檢測出76個等位基因，各基因座等位基因數(shù)1～6個不等，其中5個基因座(D10Mit12、D15Mit5、D12Nds11、D13Mit3、D14Mit3)呈現(xiàn)單態(tài)性，只有1個等位基因，平均等位基因數(shù)為2.5333。平均雜合度為0.3257，Hardy-Weinberg遺傳平衡P值中，有20個位點P>0.05。利用Cervus 3.0軟件統(tǒng)計得到B單位NIH群體的30個微衛(wèi)星位點的平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.2777。剔除5個單態(tài)性位點，剩余25個位點的平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.3365。

表2 B單位NIH小鼠在30個微衛(wèi)星位點上的基因頻率、平均雜合度、多態(tài)性信息含量Tab.2 Gene frequency, average heterozygosity and polymorphism information content of 30 microsatellite loci in the NIH mice from Unit B

注：P> 0.05表示該位點處于遺傳平衡；P< 0.01 表示該位點處于遺傳分化。

Note.P> 0.05 indicates the genetic equilibrium in the loci;P< 0.01 indicates the genetic differentiation in the loci.

表3 兩個NIH小鼠群體的遺傳參數(shù)Tab.3 Genetic parameters of the two NIH mice populations

2.3 兩個群體遺傳相似性比較

將A單位NIH小鼠微衛(wèi)星檢測結(jié)果與B單位的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)等位基因數(shù)、平均雜合度、PIC等相關(guān)指標(biāo)有一定的差異，B單位的結(jié)果略高于A單位的結(jié)果。兩個群體的PIC值均位于0.25 ～ 0.5，屬于中等程度的多態(tài)性。在測定的30個位點中，兩個群體均有5個單態(tài)性位點，其中4個位點(D10Mit12、D12Nds11、D14Mit3、D15Mit5)一致。

進(jìn)一步分析兩個群體的群間分化系數(shù)(F-statistics，F(xiàn)st)、遺傳一致性指數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見表3，群間分化系數(shù)為0.3932，遺傳一致性指數(shù)為0.3971，遺傳距離為0.9235。

3 討論

3.1 平均雜合度、多態(tài)性信息含量和遺傳平衡

雜合度或群體平衡狀態(tài)是群體遺傳結(jié)構(gòu)分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度值應(yīng)介于0.5 ～ 0.7之間。本研究中A單位NIH小鼠群體的平均雜合度是0.3108，B單位的NIH小鼠群體的平均雜合度是0.3257。B單位的雜合度略高于A單位的雜合度。顯然，兩個群體的雜合度都沒有達(dá)到0.5 ～ 0.7之間，都不是理想的封閉群小鼠群體。多態(tài)性信息含量是表示微衛(wèi)星座位多態(tài)性高低的一個指標(biāo)。當(dāng)微衛(wèi)星座位PIC > 0.5時，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態(tài)性座位;當(dāng) 0.25 < PIC < 0.5時，表明該遺傳標(biāo)記能夠較為合理的提供遺傳信息，為中度多態(tài)性座位; 當(dāng) PIC < 0.25時，表明該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差，為低度多態(tài)性座位。本研究中A單位NIH小鼠群體的平均多態(tài)性信息含量為0.2637，B單位的NIH小鼠群體的平均多態(tài)性信息含量為0.2777。兩個群體的多態(tài)性信息含量均介于0.25 ～ 0.5之間，為中度多態(tài)性群體，但是兩個群體的PIC值均瀕臨0.25，已經(jīng)出現(xiàn)趨于低度多態(tài)性群體的趨勢。本研究結(jié)果提示保種機構(gòu)有必要采取有效措施提高群體的平均雜合度和多態(tài)性信息含量。本研究中應(yīng)用的微衛(wèi)星方法曾用于封閉群KM小鼠群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析[3],得到上海KM小鼠群體的平均雜合度為0.5342，平均多態(tài)性信息含量為0.4735。說明上海KM小鼠群體是較理想的封閉群小鼠群體,也說明該方法用于封閉群小鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的有效性。

Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果顯示，A單位NIH小鼠有10個位點出現(xiàn)遺傳分化(P< 0.01)，高于B單位NIH小鼠，后者僅有5個位點(P< 0.01)。B單位NIH小鼠群體的遺傳多態(tài)性更為豐富。在各機構(gòu)封閉繁育過程中，由于群體規(guī)模的限制，造成基因多態(tài)性的遞減，逐步形成了不同NIH小鼠群體的平均雜合度、多態(tài)性信息含量和遺傳平衡狀態(tài)不完全一致的狀況。

3.2 群間分化系數(shù)、遺傳一致性指數(shù)和遺傳距離

群間分化系數(shù)Fst是測定群體間遺傳分化的主要參數(shù)，F(xiàn)st < 0.05時，表示群體間有輕度遺傳分化；0.05 ≤ Fst < 0.15時，表示群體間有中度遺傳分化；0.15 ≤ Fst < 0.25時，表示群體間有中重度遺傳分化；Fst ≥ 0.25時，表示群體間有重度遺傳分化，群體差異顯著[5]。本研究中兩個NIH小鼠群體的群間分化系數(shù)為0.3932，大于0.25，表明兩個群體間產(chǎn)生了重度的遺傳分化，兩個群體差異顯著。遺傳一致性指數(shù)與遺傳距離是反映群體遺傳相似性的兩個指標(biāo)，兩者呈負(fù)對數(shù)關(guān)系，其中，遺傳距離為顯性函數(shù)，且當(dāng)遺傳距離大于0.2時，認(rèn)為兩個群體為同屬不同種；在0.03 ～ 0.2之間時為同屬同種[6]。本研究中兩個NIH小鼠群體的遺傳一致性指數(shù)偏低，為0.3971；遺傳距離超過了0.2，為0.9235，表明這兩個群體已經(jīng)不屬于同一品(種)系的動物。依據(jù)本研究應(yīng)用的30個微衛(wèi)星位點提供的多態(tài)性信息可初步判定，該兩個群體NIH小鼠間存在嚴(yán)重的遺傳分化，形成了兩個不同的封閉群群體?；诖耍緳C構(gòu)將保種的NIH小鼠命名為A單位NIH小鼠，符合遺傳學(xué)要求。

3.3 生化標(biāo)記檢測法與微衛(wèi)星DNA檢測法的比較

幾年前，魏杰等[7]分析了同樣兩個封閉群NIH小鼠群體基于14個生化標(biāo)記位點的多態(tài)性差異，顯示群間分化系數(shù)和遺傳距離均非常小，遺傳一致性指數(shù)高。與本研究中應(yīng)用30個微衛(wèi)星位點得到的群體遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)大相徑庭。主要原因有兩個方面：一方面是因為兩種方法的測定時間不同，存在群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化的可能。另一方面，生化標(biāo)記方法與微衛(wèi)星DNA方法選取的位點數(shù)量和涵蓋的染色體數(shù)目都有很大的差異，導(dǎo)致兩種方法得到不同的結(jié)果。通過兩種評價方法獲得的研究結(jié)果均可以為封閉群動物的保種和繁育提供必要的參考。

綜上，本研究結(jié)果提示，源于不同保種機構(gòu)的封閉群NIH小鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征存在一定差異，應(yīng)為兩個NIH小鼠群體補充新的血緣，提高封閉群小鼠的群體雜合度，改善封閉群小鼠的遺傳質(zhì)量。同時，保種機構(gòu)有必要定期進(jìn)行遺傳質(zhì)量監(jiān)測，建立本機構(gòu)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，從而為其繁育與應(yīng)用提供有益的參考。

致謝：本論文的研究內(nèi)容得到了首都醫(yī)科大學(xué)陳振文教授的指導(dǎo)，特此表示感謝！

[1] 國家藥典委員會編，中華人民共和國藥典2015版，中國醫(yī)藥科技出版社。

[2] 郭羽，魏杰，王錫巖，等. Tiantanbio: NIH小鼠血液生理生化和臟器指標(biāo)的測定分析[J]. 實驗動物科學(xué)，2016, 33(6): 45-49.

[3] 王洪，杜小燕，徐平，等. 上海KM小鼠種子群體遺傳狀況分析[J]，中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24(12): 27-32.

[4] Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals [J]. Genetics，1978，89(3): 583-590.

[5] Ballous F, Lugon-Moulin N. The estimation of population differentiation with microsatellite markers[J]. Mol Ecol, 2002, 11(2): 155-165.

[6] Thorpe JP. The molecular dock hypothesis: biochemical evolution, genetic differentiation and systematics[J]. Annu Rev Ecol Syst, 1982, 13: 139-168.

[7] 魏杰, 王洪, 李芳芳, 等. 兩個封閉群NIH小鼠群體的遺傳監(jiān)測結(jié)果的比較分析[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(5): 33-36.

Application of microsatellite technology in the genetic structure analysisof NIH mice

GUO Yu1#， WANG Hong2#， WEI Jie2， WANG Xi-yan1， LI Xiao-hui1， MIN Fan-gui3， YUE Bing-fei2*

(1.Beijing Tiantan Biological Product Co. Ltd., Beijing 100176, China； 2.National Institutes for Food AndDrug Control, Beijing 100050； 3.Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial KeyLaboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663)

Objective To compare and analyze the genetic structure of NIH mice bred in Unites A and B, using microsatellite technology. Methods Thirty SPF 8-week old outbred NIH mice (half male and half female) of each population were randomly chosen from the Units A and B, respectively. PCR amplification and STR scan were performed to determine the genetic characteristics of two outbred populations using microsatellite loci, and the population genetic structure was analyzed with statistical software Popgene 1.32. Results In the NIH mouse population form the Unit A, 74 alleles were obtained, with an average heterozygosity of 0.3108 and polymorphism information content of 0.2637. In the NIH mouse population from the Unit B, 76 alleles were obtained, with an average heterozygosity of 0.3257 and polymorphism information content of 0.2777. The inter-population comparison showed that genetic differentiation coefficient Fst was 0.3932, the genetic identity was 0.3971, and the genetic distance was 0.9235. The population difference was significant. Conclusions There is serious genetic differentiation between the two NIH mice populations, resulting in the formation of two different closed populations.

Outbred population; NIH mice; Microsatellites DNA; Genetic structure

郭羽(1980-)，男，工程師，大學(xué)，研究方向：比較醫(yī)學(xué)研究；王洪(1977-)，女，副研究員，碩士，研究方向：實驗動物質(zhì)量控制。#共同第一作者

岳秉飛(1960-)，男，研究員，博士，研究方向：動物遺傳學(xué)。Email: y6784@126.com

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0087-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.016

2016-12-06