余 強，劉月環(huán)，王志遠，吳舊生

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058； 2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013)

高通量測序法研究不同pH的飲用水對SPF小鼠腸道微生物的影響

余 強1,2#，劉月環(huán)2#，王志遠2，吳舊生1*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058； 2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013)

目的 研究不同pH飲用水對SPF小鼠腸道微生物多樣性的影響。方法 21日齡SPF小鼠90只隨機分成3組，每組30只，分別給予三類水，即酸化水(pH 3.0)，中性水(pH 7.0)和堿性水(pH 9.0)，并進行為期三個月的飼養(yǎng)。每組分別在飼養(yǎng)4周、8周、12周末各處死10只動物，取血清按SPF國標(biāo)項目檢測了細菌、病毒、寄生蟲，取回盲部內(nèi)容物，根據(jù)細菌16S rRNA的保守性設(shè)計引物，構(gòu)建文庫，進行高通量(Illumina)測序，獲得10 G的數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，聚類分析。結(jié)果 以pH 3.0處理的小鼠腸道微生物豐富度適中，穩(wěn)定性高。結(jié)論 在規(guī)?；曫B(yǎng)條件下，選取pH 3.0飲用水小鼠能較長時間維持腸道微生物多樣性，穩(wěn)定性達到一個平臺。本研究為長期穩(wěn)定維持動物質(zhì)量的生產(chǎn)實踐提供了理論與技術(shù)支持，也是胃腸道宏基因組學(xué)技術(shù)在動物質(zhì)量控制領(lǐng)域的一個具體應(yīng)用。

腸道微生物；16S rRNA；高通量測序；飲用水；小鼠

目前，大多數(shù)實驗動物中心都采用動物飲用水作酸化處理的辦法來解決清潔級以上實驗動物的飲水問題[1]。有些單位將飲用水高壓滅菌(121℃，25 ～ 30 min)后酸化至pH 2.5左右(pH 2.5 ～ 3.0)效果比較理想，也有一些單位使用堿化水(pH 9.0)長期飼養(yǎng)動物，效果也相對理想。最近有報道表明，動物腸道微生物對其實驗結(jié)果有相對大的影響，許多科研結(jié)果不能重復(fù)也歸咎于腸菌的影響[2]。16S rRNA是原核生物核糖體30S小亞基的組成部分，它包含10個保守區(qū)和9個高變區(qū)，其中保守區(qū)為細菌共有，而高變區(qū)則有種屬特異性，其基因序列隨著菌種間的親緣關(guān)系不同而有一定差異。所以，高變區(qū)序列是能解釋細菌物種間差異的特征核酸序列，可作為細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)。因此可按這一特征設(shè)計16S rDNA引物，并擴增、測序來鑒定樣本中的微生物種類[3]。鑒于目前還沒有酸化水對小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的影響報道，本文利用16S rRNA高通量測序技術(shù)探討了不同pH飲用水連續(xù)飼養(yǎng)三個月小鼠的腸道微生物穩(wěn)定性和多樣性，為今后動物質(zhì)量控制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與回盲部腸內(nèi)容物取樣

實驗小鼠由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供【SCXK(浙)2014-0001】，實驗在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心進行【SYXK(浙)2014-0008】。選取21日齡SPF級ICR小鼠(雌、雄鼠兼用)90只，隨機分成3組，每組30只，分別給予酸化水(pH 3.0)、中性水(pH 7.0)和堿性水(pH 9.0)，三類水進行為期三個月的飼養(yǎng)，每組分別在飼養(yǎng)4周、8周、12周末處死10只動物，取血按GB14922.2-2011進行檢測，回盲部V形剪口，滅菌牙簽挑取內(nèi)容物。

1.2 腸菌基因組提取

1.2.1 DNA質(zhì)量檢測

用常規(guī)細菌提取試劑盒分別提取90個個體基因組，同組處理內(nèi)物容混在一起組成樣本池，進行16S rRNA建庫，樣本分別標(biāo)號為I1、I4、I7、I10、I13、I16、I19、I22、I25。其中I1、I10、I19為同個pH 3.0值，I4、I13、I22為同個pH 7.0值，I7、I16、I25為同個pH 9.0值，I1、I4、I7為同個處理時間(飼養(yǎng)4周)，I10、I13、I16為同個處理時間(飼養(yǎng)8周)，I19、I22、I25為同個處理時間(飼養(yǎng)12周)。用1%瓊脂糖電泳檢測DNA樣品有無雜質(zhì)和降解；Nano Photometer分光光度計檢測DNA樣品的純度；Qubit 2.0 Flurometer檢測DNA樣品的濃度。

1.2.2 16S rDNA文庫制備

取10 ng的DNA模板，對目的區(qū)域進行擴增：根據(jù)測序區(qū)域的不同，選擇對應(yīng)區(qū)域的擴增引物：V3區(qū)引物為338F-533R，V3+V4區(qū)引物為314F-805R，V6區(qū)引物為967F-1046R；使用Takara的Ex Taq酶，確保擴增效率和準(zhǔn)確性。繼而對擴增出的目的片段進行富集，同時加入特異index序列。建庫流程見圖1。

圖1 小鼠腸菌16S rDNA文庫建立流程圖Fig.1 A diagram of construction of the mouse intestinal bacteria 16S rDNA library

1.2.3 庫檢

庫檢流程：構(gòu)建文庫 → Qubit 2.0進行初步定量 → 稀釋文庫至1 ng/μL → Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預(yù)期后 → Bio-Rad CFX 96熒光定量PCR儀，Bio-Rad KIT iQ SYBR GRN進行QPCR，對文庫的有效濃度進行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。

1.2.4 測序

檢測合格的文庫，采用Hiseq進行測序，測序策略為PE250。其實驗流程如下：DNA提取 → 高變區(qū)擴增及產(chǎn)物純化 → 目的片段富集及產(chǎn)物純化 → 末端修復(fù)，加接頭 → 文庫庫檢 → 上機測序。

1.3 信息分析流程

測序所得序列應(yīng)去除問題序列，如低質(zhì)量堿基、接頭污染序列等并完成數(shù)據(jù)過濾，得到目標(biāo)序列用于分析。過濾后的序列稱為Clean Reads。首先，將雙端測序的相應(yīng)的Read1(5’端測序所得序列片段)與Read2(3’端測序所得序列片段)利用序列拼接方法PEAR[4]進行拼接；然后，對拼接后的序列利用軟件QIIME 1.8.0版本進行分析[5-7]，信息分析流程如下：原始下機序列 → 質(zhì)控 → 序列拼接 → 參考庫對比 → OTUs分析 → 多樣性分析 → 聚類熱圖分析。

2 結(jié)果

2.1 回盲部腸菌原始序列數(shù)據(jù)

Illumina高通量測序結(jié)果最初以原始圖像數(shù)據(jù)文件的存在，經(jīng)CASAVA軟件進行堿基識別(base calling)后，轉(zhuǎn)為原始測序序列(raw data)，其結(jié)果以FASTQ(簡稱為fq)文件的形式存儲。FASTQ文件信息的內(nèi)容包含了所測序列的名稱、堿基序列及相對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。在FASTQ格式文件中，每個堿基對應(yīng)一個堿基質(zhì)量字符，每個堿基質(zhì)量字符對應(yīng)的ASCII碼值減去33(Sanger質(zhì)量值體系)，即為該堿基的測序質(zhì)量得分。

2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與質(zhì)控

首先去除接頭污染(接頭污染是指由于插入片段過短而導(dǎo)致部分read序列中含有測序引物序列，對于雙端測序，若一端受到接頭污染，則去掉兩端的reads)；然后去除低質(zhì)量的reads(reads中質(zhì)量值Q ≤ 19的堿基占總堿基的30%以上，對于雙端測序，若一端為低質(zhì)量reads，則會去掉兩端reads)；最后去除含N比例大于5%的reads(對于雙端測序，若一端含N比例大于5%，則會去掉兩端reads)。Q值是Phred Quality Score的簡稱；N堿基是指未知堿基。結(jié)果見表1。

2.3 序列拼接

對過濾后的序列，采用PEAR[4]序列拼接算法將雙末端測序序列根據(jù)末尾的重疊情況合并成一條序列，再進行下一步分析。PEAR程序可以合并來自可變長度靶片段的原始Illumina雙端reads。它通過統(tǒng)計檢驗來減少假陽性結(jié)果的數(shù)量。各個樣本的拼接成功比例均大于98%(橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示拼接成功序列占總數(shù)的百分比。結(jié)果見圖2。

表1 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計結(jié)果Tab.1 Results of data filtering statistics

注：(1)Raw Q30 Bases Rate (%)：Raw Reads中測序質(zhì)量值大于30(錯誤率小于0.1%)的堿基占總堿基(Raw Reads)的比例。(2)Filter Q30 Bases Rate (%)：Filter Reads中測序質(zhì)量值大于30(錯誤率小于0.1%)的堿基占總堿基(Filter Reads)的比例。

Note. (1) Raw Q30 B base rate (%): raw reads percentage of base (raw reads) with a base value greater than 30 (error rate less than 0.1%). (2) Filter Q30 base rate (%): filter read percentage of base (filter reads) with a mass value greater than 30 (error rate less than 0.1%).

2.4 OTUs分析

2.4.1 OTUs統(tǒng)計及分布

OTUs，即分類操作單元，它代表的是一類相似序列的集合，默認(rèn)將序列相似度大于97%的Tags歸為一類OTUs，認(rèn)為它們具有相同的物種來源，從中選出代表序列可以簡化數(shù)據(jù)集，以便進行下一步的分析，本實驗得到的序列與參考數(shù)據(jù)庫中的OTUs序列進行比對，挑選相似度大于97%的序列歸為一類OTUs。物種的識別是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中各物種相應(yīng)的識別序列與我們挑選的OTUs進行比對的結(jié)果。剔除所有樣品中的序列數(shù)小于2條的OTUs。結(jié)果見表2。

表2 OTUs數(shù)目Tab.2 Number of OTUs

圖2 序列拼接百分率(紅色虛線表示拼接比例 為90%)Fig.2 Percentage of sequence splicing (red dotted line indicates 90% splicing ratio)

2.4.2 OTUs豐度排秩分析

OTUs豐度排秩(rank-abundance)是根據(jù)每個OTUs所含序列數(shù)的多少對OTUs進行排序，豐度排秩可以很直觀的看出在每個樣本里OTUs所包含的序列數(shù)的分布情況，曲線越平緩，OTUs分布越均勻，結(jié)果見圖3。橫坐標(biāo)表示OTUs按包含的序列數(shù)目排秩，縱坐標(biāo)表示該OTUs包含的序列數(shù)的相對豐度，每一條線表示對應(yīng)一個樣本的OTUs分布情況。結(jié)果表明樣品OTUs豐度排秩從高到低依次為I19>I1>I4>I10>I22>I16>I25>I13>I7。

2.4.3 樣品聚類樹圖

對所得各樣品的物種分布數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化之后，計算Bray-Curtis距離值[8]，利用層次聚類算法對各樣品進行聚類。通過聚類分析我們可以直觀的看出樣品間的相似情況以及離群點的存在情況。Bray-Curtis距離計算公式如下：

其中，BCij表示樣本i和j之間的Bray-Curtis距離，k表示兩個樣本共有的OTUs的個數(shù)，m、n分別表示兩個樣本所有的OTUs總數(shù)；Ck表示共有的包含較少序列的OTUs的序列數(shù)，Sim表示樣本i中某個OTUs所包含的序列數(shù)，Sjn表示樣本j中某個OTUs所包含的序列數(shù)。Bray-Curtis距離介于0 ～ 1之間，為0表示兩個樣本的物種組成完全一致，為1則表示兩樣本的物種組成完全不一致。通過計算此距離得到的樣本聚類樹見圖4。(橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示距離值，分支點處的縱坐標(biāo)表示分支的類之間的距離，不同顏色表示不同分組)結(jié)果表明樣品I4與I10的物種組成最相似。

圖3 OTUs豐度排秩Fig.3 OTUs abundance rankings of the samples

2.5 進化樹分析

根據(jù)已知的參考數(shù)據(jù)庫中的親緣關(guān)系，我們利用PyNAST序列比對算法[6]對得到的OTUs構(gòu)建進化樹，利用Graphlan[9]軟件得到如下進化樹，見圖5。結(jié)果顯示了每個樣本不同階段共有的菌群，不同顏色分別代表在整棵樹里面比較重要的一些子樹，包含序列越多圓圈越大。

2.6 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析了樣品內(nèi)菌群的多樣性情況，主要包括菌種的類別豐富度以及菌種數(shù)目均勻度兩大指標(biāo)。Alpha多樣性越高表示菌群種類豐富度越好，菌種數(shù)目越均勻，菌群愈穩(wěn)定。Alpha多樣性指標(biāo)值采用四種不同的計算指標(biāo)分析求得。

圖5 樣品進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the samples

圖4 樣品聚類圖Fig.4 Clustering chart of the samples

2.6.1 香隆指數(shù)(Shannon index)

Shannon index 是根據(jù)樣品中的物種種類以及每個物種的比例來計算的多樣性指標(biāo)，計算公式如下：

H′表示Shannon index 值，R表示樣品中物種的種類數(shù)，pi第i個物種所占百分比；

Shannon index值與樣品深度的關(guān)系見圖6。橫坐標(biāo)表示取樣深度即序列的條數(shù)，縱坐標(biāo)表示Shannon index值，菌種分布越均勻，其Shannon值越大。結(jié)果表明I19樣品微生物分布最均勻，I1、I10、I4次之，I22、I16、I13、I25再次之，最后是I7。

圖6 香隆指數(shù)Fig.6 Shannon indexes of the samples

2.6.2 Chao1

Chao1是一個可以不基于進化樹來進行評價物種豐度的一個指數(shù)，計算的公式為：

其中，Sobs是觀察到的物種數(shù)，n1是觀察到的singletons的種類數(shù)，n2是觀察到的doubletons的種類數(shù)。Chao 1在低豐度樣品特別多的時候更能體現(xiàn)真實的多樣性情況；Chao 1值與樣品深度的關(guān)系，見圖7。橫坐標(biāo)表示取樣深度即序列的條數(shù)，縱坐標(biāo)表示Chao 1 Index值。結(jié)果表明I19樣品微生物豐度最好，I4、I1、I10、I16、I22次之，最后是I25、I13、I7。

圖7 Chao1 指數(shù)Fig.7 Chao1 indexes of the samples

2.6.3 觀察細菌總數(shù)(Observed species)

Observed species是一個不基于進化樹來對物種豐富度進行檢測的指數(shù)，就是某次實驗中觀測到的種類數(shù)。Observed species與樣品深度的關(guān)系見圖8。橫坐標(biāo)表示取樣深度即序列的條數(shù)，縱坐標(biāo)表示OTUs的數(shù)目值。結(jié)果表明I19樣品微生物最豐富，I1、I4、I10次之，I16、I22再次之，最后是I25、I13、I7。

圖8 觀察種類Fig.8 Observed types of the samples

圖9 辛普森指數(shù)Fig.9 Simpson indexes of the samples

2.6.4 辛普森指數(shù)(Simpson index)

Simpson是一種立于分布格局的多樣性的測度方法。是測量一個種群的集中程度或優(yōu)勢程度的。根據(jù)物種在樣品中的比例來計算，公式如下:

其中Pi表示物種i的在樣品中的比例。

Simpson值與樣品深度的關(guān)系見圖9。橫坐標(biāo)表示取樣深度即序列的條數(shù)，縱坐標(biāo)表示Simpson值，稀有種對Simpson值的影響較小，而常見種對其的影響較大。

2.7 不同pH飲用水對SPF小鼠腸道微生物多樣性的影響

所有樣品共有優(yōu)勢菌為硬壁菌門(Firmicutes)；擬桿菌門(Bacteroidetes)；蛋白菌門(Proteobacteria)，并占小鼠腸道細菌總數(shù)98%以上。結(jié)果見表3。

表3 各樣品不同飼養(yǎng)階段的優(yōu)勢菌(每個樣品每個階段列出占比前10的細菌)Tab.3 Dominant species of the samples at different stages of feeding (listed the top 10 bacteria of each sample at each stage)

3 討論

在生物進化的漫長過程中，生物rRNA分子除了排列順序有些非常緩慢的變化外，其功能幾乎保持不變，從這個特性上可以檢測出種系變化的關(guān)系。rRNA結(jié)構(gòu)具有保守性和高變性。保守性揭示了生物物種的親緣關(guān)系，是系統(tǒng)發(fā)育重建的重要線索。高變性揭示了生物物種核酸序列的不同特征，是鑒定屬種的基礎(chǔ)。細菌rRNA的類型有23S、16S和5S rRNA 3種，其長度分別為2900、1540、120 bp。5S rRNA雖最易分析，但由于核苷酸數(shù)量少，用于分析研究的遺傳信息不夠準(zhǔn)確。23S rRNA含有最多的核苷數(shù)，幾乎是16S rRNA的2倍，用于分析研究的遺傳信息雖最準(zhǔn)確但分析較困難。16S rRNA的核苷數(shù)相對適中，較易于分析，用于分析研究的遺傳信息基本滿足序列測定的分析比較，也成為動物胃腸道宏基因組學(xué)研究的一個重要的理論和實踐基礎(chǔ)[10]。根據(jù)16S rRNA的保守區(qū)和可變區(qū)的特性[11]，測定其基因部分序列即可達到樣品分子鑒定的目的[12]，常用序列比對長度一般選為500 bp[13-16]，有的研究人員使用800 bp長度進行序列比對[17]。目前，16S rRNA/rDNA分子鑒定技術(shù)廣泛用于微生物的遺傳特征研究及分子差異的研究[18]。

人體內(nèi)正常的菌群主要定植于小腸、回腸及結(jié)腸部位，這些菌群可直接參與宿主的物質(zhì)代謝過程，進而影響人體健康，如Harold Tjalsma等[19]報道，腸道菌群失調(diào)是直腸癌發(fā)生的一大因素。Amandine Everard等[20]報道，腸道菌群失調(diào)能夠引發(fā)肥胖和2型糖尿病。Christopher T. Brown等[21]報道，腸道菌群失調(diào)能夠引發(fā)自身免疫性疾病如1型糖尿病。Osawa[22]及Smith[23]等研究報道動物的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物能夠影響宿主粘膜系統(tǒng)的發(fā)育、血管細胞的發(fā)生、腸道上皮細胞的更新、腸道功能的維持及參與宿主基因的表達及脂類的代謝調(diào)控。國內(nèi)郭秀蘭等[24]的研究表明擬桿菌屬可能是一個好的脂肪沉積的生物標(biāo)識。

本研究表明所有樣品共有優(yōu)勢菌為硬壁菌門(Firmicutes)；擬桿菌門(Bacteroidetes)；蛋白菌門(Proteobacteria)，并占小鼠腸道細菌總數(shù)98%以上。這與Ley等2005[25]，2006[26]報道的硬壁菌門和擬桿菌門細菌占比超過哺乳動物腸道總細菌的98%的結(jié)果基本一致。硬壁菌門和擬桿菌門對健康有深遠的影響，如腸道菌群與脂肪沉積的關(guān)系，Ley等2006[26]對肥胖人和瘦人腸道微生物的組成情況作了比較，對糞便細菌作了16S rRNA基因序列克隆測序并分類計算，發(fā)現(xiàn)肥胖人糞便中的硬壁菌門比瘦人高(P=0.002)，而擬桿菌門比瘦人低(P< 0.001)。劉祥等2005[27]采取體外培養(yǎng)和生化反應(yīng)的方法對肥胖人和瘦人的腸道菌群進行了研究，發(fā)現(xiàn)肥胖人腸道菌群中擬桿菌門的含量顯著高于瘦人。這些結(jié)果表明脂肪沉積與腸道菌群中硬壁菌門、擬桿菌門的數(shù)量或相對豐度密切關(guān)聯(lián)。在本研究多樣性分析中表明pH3.0組小鼠腸道微生物的分布相對均勻、種類豐富及相對好的生物豐度，說明腸道微生物生態(tài)穩(wěn)定，有利于小鼠的健康(同批小鼠同時委托當(dāng)?shù)貙嶒瀯游镔|(zhì)量監(jiān)督檢測站做細菌、病毒、寄生蟲的檢測，其結(jié)果均為陰性)，也可能有利于減少腸道微生物對實驗結(jié)果的影響，使實驗數(shù)據(jù)具有更好的重復(fù)性。在長期規(guī)模化飼養(yǎng)條件下，選取pH 3.0飲用水的動物能較長時間維持動物腸道微生物多樣性，穩(wěn)定性達到一個平臺，可以做為長期飼養(yǎng)的一種選擇。因此本研究也為長期穩(wěn)定維持動物質(zhì)量的生產(chǎn)實踐提供了理論與技術(shù)支持。

[1] 徐平，毛佳賢. 小鼠飲水酸化后細菌生長情況 [J].上海實驗動物科學(xué)，1992，12(3): 157-159.

[2] Servick K. Mouse microbes may make scientific studies harder to replicate. 2016.8.16. http://www.sciencemag.org.

[3] Pei AY, Oberdorf WE, Nossa CW, et al. Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes [J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(12): 3886-3897.

[4] Zhang J, Kobert K, Flouri T, et al. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR[J]. Bioinformatics, 2014, 30(5): 614-620.

[5] Vasileiadis S, Puglisi E, Arena M, et al. Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene V regions coupled with Multi-Million read generating sequencing technologies [J]. PLoS ONE, 2012, 7(8): e42671.

[6] Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Methods, 2010, 7(5): 335-336.

[7] Ahn J, Sinha R, Pei Z, et al. Human gut microbiome and risk for colorectal cancer [J]. J Natl Cancer Inst, 2013,105(24):1907-1911.

[8] Bray JR, Curtis JT. An ordination of upland forest communities of Southern Wisconsin [J]. Ecol Monogr, 1957, 27(4):325-349.

[9] Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences [J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 814-821.[10] 吳舊生, 王鵬歧, 劉月環(huán). 宏基因組學(xué)與動物病原微生物檢測 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(9): 72-77.

[11] Woese CR. Bacterial evolution [J]. Microbiol Rev, 1987, 51(2): 221-271.

[12] Jones SW, Dobson ME, Francesconi SC, et al. DNA assays for detection, identification, and individualization of select agent microorganisms [J]. Croat Med J, 2005, 46(4): 522-529.

[13] Patel JB, Leonard DG, Pan X, et al. Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rDNA bacterial identification system [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(1): 246-251.

[14] Tang YW, Von Graevenitz A, Waddington MG, et al. Identification of coryneform bacterial isolates by ribosomal DNA sequence analysis [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(4): 1676-1678.[15] Hall L, Doerr KA, Wohlfiel SL, et al. Evaluation of the Micro Seq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4): 1447-1453.

[16] Tang YW, Ellis NM, Hopkins MK, et al. Comparison of phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual aerobic pathogenic gram-negative bacilli [J]. J Clin Microbiol, 1998, 36(12): 3674-3679.

[17] Bosshard PP, Abels S, Zbinden R, et al. Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram-positive rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation) [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(9): 4134-4140.

[18] Cai HY, Arehambanlt M, Gyles CL, et al. Molecular genetic methods in the veterinary clinical bacteriology laboratory:current usage and future applications [J]. Anim Health Res Rev, 2004, 4(2): 73-79.

[19] Tjalsma H, Boleij A, Marchesi JR, et al. A bacterial drive-passenger model for colorectal cancer: beyond the usual suspects [J]. Nat Rev Microbiol, 2012, 10(8): 575-582.

[20] Everard A, Belzer C, Geurts L, et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity [J]. PNAS, 2013, 28(5): 9066-9071.

[21] Brown CT, Davis-Richardson AG, Giongo A, et al. Gut microbiome metagenomics analysis suggests a functional model for the development of autoimmunity for type 1 diabetes [J]. PLoS ONE, 2011, 6(10): e25792.

[22] Osawa R, Kuroiso K, Goto S, et al. Isolation of tannin-degrading lactobacilli from humans and fermented foods [J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(7): 3093-3097.

[23] Smith AH, Mackie RI. Effect of condensed tannins on bacterial diversity and metabolic activity in the rat gastrointestinal tract [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(2): 1104-1115.

[24] 郭秀蘭. 豬腸道硬壁門和擬桿菌數(shù)量的檢測及其相對豐度與脂肪沉積的相關(guān)性研究 [D]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文. 2009

[25] Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, et al.Obesity alters gut microbial ecology [J]. PNAS, 2005, 102(31): 11070-11075.[26] Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, et al.Microbial ecology: Human gut microbes associated with obesity [J].Nature, 2006, 444(7122): 1022-1023.

[27] 劉祥，張朝武，潘素華，等. 不同體脂人群腸道主要菌群的定量分析 [J]. 衛(wèi)生研究，2005, 34(6): 724-725.

Effect of drinking water at different pH on intestinal microbial diversityin SPF mice evaluated by high throughput sequencing

YU Qiang1,2#， LIU Yue-huan2#， WANG Zhi-yuan2， WU Jiu-sheng1*

(1.College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China； 2.Zhejiang Academy of MedicalSciences, Hangzhou 310013)

Objective To study the effect of drinking water at different pH on intestinal microbial diversity in SPF mice. Methods Ninety 21-day-old SPF mice were randomly divided into three groups: drinking acidified water (pH 3.0), neutral water (pH 7.0) and alkaline water (pH 9.0), respectively, for 3 months, 30 mice in each group. 10 mice were sacrificed at the end of 4, 8 and 12 weeks in each group. Bacteria, virus and parasites in serum were detected according to the national standard for SPF. Then, primer sequences were designed according to the conservativeness of bacteria 16S rRNA, and libraries were constructed. Subsequently, the ileocecal contents were subjected to high-throughput sequencing (Illumina). 10 G data were obtained and analyzed. Results The sequencing results revealed that the intestinal microbial abundance of the mice receiving pH 3.0 drinking water was moderate with a high stability. Conclusions Under the conditions of large-scale breeding, the mice receiving pH 3.0 drinking water can maintain the intestinal microbial diversity for a long time, and reach a stable platform. This study provides theoretical and technical support for the stable long-term maintenance of animal quality production. It is also a specific application of gastrointestinal macrogenomics in animal quality control.

Intestinal microflora; 16S rRNA; High throughput sequencing; Drinking water; Mice

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計劃(2011C37096，2015C37102)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才基金(2015RCA006)；浙江省自然科學(xué)基金(LY16H030011)。

余強(1980-)，男，實驗師，碩士生，本科，研究方向：實驗動物學(xué)。Email: yu_q2008@163.com；劉月環(huán)(1974-)，女，副研究員，博士后，研究方向：實驗動物生物技術(shù)。Email: yuehuanliu@163.com.#共同第一作者

吳舊生(1969-)，男，副教授，博士，研究方向：實驗動物醫(yī)學(xué)。 Email: wjosh@zju.edu.cn

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0040-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.008

2016-12-21