武光東，邱 彬，王婷婷，劉云波，雍偉東

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

Fkbp51基因敲除小鼠心臟與肝臟RNA表達譜系的分析比較

武光東，邱 彬，王婷婷，劉云波*，雍偉東*

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 通過分析野生型小鼠(WT)和Fkbp51基因敲除(KO)小鼠心臟與肝RNA表達譜系之間的差異，研究Fkbp51基因在心臟和肝組織代謝通路中的作用。方法 利用第二代高通量基因測序技術(shù)，對Fkbp51 KO和WT小鼠的心臟和肝進行mRNA表達譜測序，將心臟測序的數(shù)據(jù)結(jié)果用DEGseq進行差異分析，肝臟組織測序結(jié)果用BRB-Array Tools進行分析，分別篩選出小鼠心臟和肝的差異基因，利用在線工具DAVID對差異基因進行GO本體分析和KEGG通路分析，利用BioinfoGP數(shù)據(jù)庫的Venn工具分析兩種組織的共差異基因，利用STRING數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)進行分析。結(jié)果 (1)Fkbp51的缺失導致心臟中血管平滑肌收縮、趨化因子信號、視黃醇信號和MAPK信號等相關(guān)通路的mRNA表達發(fā)生改變；(2)Fkbp51的缺失導致肝組織中膽固醇合成及代謝、脂類代謝以及氧化還原等相關(guān)基因和通路的變化；(3)在心臟和肝組織中，F(xiàn)kbp51缺失造成了4個共差異基因，其中Rnaset2b、Hmga1和Fkbp51下調(diào)，而Cyp2b10在心臟組織中下調(diào)，在肝組織中上調(diào)。這些蛋白均可與HSP90蛋白相互作用，參與心臟和肝組織中的代謝。結(jié)論Fkbp51在心臟和肝中參與不同的代謝及基因表達調(diào)控通路，其作用既是相互獨立又是相互聯(lián)系的。

Fkbp51基因敲除小鼠；心臟；肝臟；代謝；基因表達；信號通路

FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding proteins，F(xiàn)KBPs)是一類具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性的蛋白分子，參與細胞內(nèi)蛋白折疊的修飾過程[1]。這類蛋白能夠通過其TPR結(jié)構(gòu)域直接與熱休克蛋白HSP90結(jié)合，參與甾體類激素受體復(fù)合物的形成和功能調(diào)節(jié)[2]。

1993年人們首次發(fā)現(xiàn)了Fkbp51(FK506 binding proteins 51)[3]，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)Fkbp51能夠與所有的甾體類激素受體相互作用[4]，并且發(fā)現(xiàn)除雄性激素受體(AR)外，F(xiàn)kbp51對其它甾體激素受體的轉(zhuǎn)錄活性起負調(diào)控作用，如糖皮質(zhì)激素受體(GR)和雌激素受體(ER)等[5，6]。

糖皮質(zhì)激素是一種腎上腺釋放的生命所必須的類固醇激素，通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，作用于所有的組織和器官[7]。GC激活GR后可直接促進Fkbp51的表達，進而負反饋作用于GR，使其對GC的敏感性降低[8]，因此Fkbp51可以通過負反饋GR活性，維持機體的穩(wěn)態(tài)。除在糖代謝方面的調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)kbp51也在脂代謝過程中發(fā)揮重要作用。我們前期對Fkbp51基因敲除小鼠的肝臟和大腦海馬區(qū)RNA-seq測序分析，發(fā)現(xiàn)Fkbp51在代謝和神經(jīng)中均發(fā)揮作用，且在代謝通路和神經(jīng)通路調(diào)節(jié)過程中的作用既是相互獨立又是相互聯(lián)系的[8]。針對心臟的研究中發(fā)現(xiàn)小鼠GR基因第9外顯子的多態(tài)性(A3669G)可使其糖皮質(zhì)激素合成不足，導致其心臟發(fā)育異常；具有此種多態(tài)性的人患冠狀動脈疾病的風險增加，并可能出現(xiàn)心臟腫大、收縮功能障礙和心力衰竭[9]。

由于糖皮質(zhì)激素及其受體在心臟中的重要功能，并且Fkbp51對糖皮質(zhì)激素的重要調(diào)節(jié)功能，因此有理由推測Fkbp51可能在心臟的發(fā)育和功能調(diào)控中發(fā)揮作用。本研究通過分析Fkbp51基因敲除小鼠與野生型心臟和肝臟mRNA表達譜之間的差異，不僅有助于揭示Fkbp51在心臟和肝臟發(fā)育中的作用，還將有助于加深我們對Fkbp51在不同組織中功能差異的了解，為進一步研究Fkbp51的生物學功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Fkbp51 KO與同窩野生型雄鼠(遺傳背景為C57，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供)【SYXK(京)2011-0022】，【SCXK(京)2014-0004】。選用8周齡Fkbp51 KO與同窩野生型雄鼠各3只，體重20 ～ 24 g。動物實驗方案經(jīng)過中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準。在使用實驗動物的過程中充分考慮到動物福利原則，尊重動物生命，善待動物，減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA提取及測序

8周齡Fkbp51 KO與同窩WT雄鼠各3只，脫頸處死后取心臟和肝組織，利用Trizol法提取RNA，肝臟樣品交由華大基因測序，心臟樣品交由諾禾致源測序。

1.2.2 差異表達基因的篩選

心臟組織和肝組織分別使用DEGseq軟件和BRB-Array Tools軟件進行差異基因分析，限定P值后獲得差異基因列表。將得到的差異基因進行統(tǒng)一分析，集中關(guān)注顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，以此來闡述基因敲除后對心臟和肝臟組織產(chǎn)生的影響或揭示其中的生物學意義。

1.2.3 差異基因的GO本體分析及KEGG通路分析

注：1：RNA代謝監(jiān)控；2：氧化還原；3：轉(zhuǎn)錄調(diào)控；4：脂質(zhì)生物合成；5：穩(wěn)態(tài)過程；6：細胞增殖調(diào)控；7：化 學平衡；8：大分子代謝過程中的正調(diào)控；9：微粒；10：小泡碎片；11：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；12：細胞外膜；13：細胞組 分；14：膜組分；15：細胞質(zhì)；16：線粒體；17：過渡金屬離子結(jié)合；18：鐵離子結(jié)合；19：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性；20： 血紅素結(jié)合；21：電子載體活動；22：四吡咯結(jié)合；23：肽酶抑制劑活性。圖1 Fkbp51 KO和WT小鼠心臟與肝差異基因的相同GO本體分析Note. 1: RNA metabolic regulation; 2: oxidation reduction reaction; 3: transcriptional regulation; 4: lipid biosynthetic process; 5: homeostatic process; 6: cell proliferation control; 7: chemical homeostasis; 8: positive regulation of macromolecule metabolic process; 9: microsome; 10: vesicular fraction; 11: endoplasmic reticulum; 12: extrinsic to membrane; 13: cell fraction; 14: membrane fraction; 15: cytosol; 16: mitochondrion; 17: transition metal ion binding; 18: iron ion binding; 19: transcription regulator activity; 20: heme binding; 21: electron carrier activity; 22: tetrapyrrole binding; 23: peptidase inhibitor activity.Fig.1 The same GO ontology analysis of differential genes in the heart and liver of Fkbp51 KO and WT mice

通過在線工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對得到的差異基因進行分析。基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)能夠?qū)⒐δ芟嗤幕蚓垲惖揭粋€單元，在生物學網(wǎng)絡(luò)水平從生物過程、細胞成分和分子功能三個方面對差異基因進行注釋；全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(KEGG)是一個整合了基因組化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，從系統(tǒng)信息、基因信息和化學信息三個方面對同一通路的差異基因進行聚類分析。1.2.4 差異基因的韋恩(Venn)分析

BioinfoGE(http://bioinfogp.cnb.csic.es/)數(shù)據(jù)庫是一個有關(guān)基因組學和蛋白質(zhì)組學分析研究的數(shù)據(jù)庫。本文主要利用此數(shù)據(jù)庫分析Fkbp51基因敲除后肝臟和心臟兩種組織的共差異基因。

1.2.5 差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫是一個有關(guān)已知或預(yù)測蛋白質(zhì)間相互作用的數(shù)據(jù)庫。本文主要利用此數(shù)據(jù)庫對肝臟和心臟共差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行分析，進一步研究蛋白質(zhì)之間的直接與間接作用。

2 結(jié)果

2.1Fkbp51 KO與WT小鼠心臟和肝臟差異基因的檢測

利用第二代高通量基因測序技術(shù)，對Fkbp51 KO和WT小鼠的心臟和肝臟mRNA進行表達譜測序，差異基因的P值限定為0.01后得到差異基因列表。心臟共得出153個差異基因，肝臟共得出206個差異基因(表1)。

表1 Fkbp51 KO和WT小鼠肝臟和心臟差異基因數(shù)目Tab.1 Differential gene numbers in the heart and liver of Fkbp51 KO and WT mice

2.2Fkbp51 KO與WT小鼠心臟與肝臟差異基因的GO本體分析和KEGG通路分析

利用DAVID對Fkbp51 KO小鼠心臟和肝臟的差異基因進行GO本體分析，從(圖1)可以看出，差異基因的GO本體分析主要涉及與代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的生物學過程，在細胞組成中涉及到細胞器及細胞膜組成，在分子功能中主要涉及離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄、載體和肽酶抑制劑的活性。從系統(tǒng)信息、基因信息和化學信息三個方面對同一通路的差異基因進行聚類分析，分析發(fā)現(xiàn)心臟和肝臟中都受到影響的KEEG通路是花生四烯酸代謝通路(表2)。

表2 Fkbp51 KO和WT小鼠肝和心臟差異基因的相同KEGG通路Tab.2 The same KEGG pathway of differential genes in the heart and liver of Fkbp51 KO and WT mice

注：Fisher檢驗，P< 0.1；Benjamini-Hochberg校正P< 1。

Note. Fisher’s exact test,P< 0.1; Benjamini-Hochberg correctedP< 1.

圖3 Fkbp51 KO小鼠心臟和肝共差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein interaction network of the co-differential genes in the heart and liver of Fkbp51 KO mice

2.3Fkbp51 KO與WT小鼠心臟和肝共差異基因的韋恩分析

通過BioinfoGE在線工具對心臟和肝特異性基因進行韋恩(Venn)分析，共找到4個共差異基因(圖2)，其中Rnaset2b和Hmga1在心臟和肝中均為下調(diào)，Cyp2b10在心臟組織中下調(diào)而在肝組織中上調(diào)。

圖2 Fkbp51 KO和WT小鼠心臟 與肝共差異基因的韋恩分析Fig.2 Venn analysis of the co-differential genes in the heart and liver of Fkbp51 KO and WT mice

2.4Fkbp51 KO小鼠心臟和肝共差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

通過STRING對Fkbp51基因敲除后心臟和肝組織的四個共差異基因編碼的蛋白進行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)FKBP51與HSF1、HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8、STIP1、CDC37、SUGT1、MYC、HMGA1、CYP7A1、CYP2B10、UGT1A1形成互作網(wǎng)絡(luò)(圖3)。這些蛋白雖未出現(xiàn)在我們的測序數(shù)據(jù)里，但是為我們研究FKBP51在心臟發(fā)育和代謝方面的作用提供了一個明確的思路，具有重要的意義。

3 討論

Fkbp51在心臟發(fā)育與代謝過程中的具體作用機制目前仍不清楚，其作用機制可能涉及多個方面，是一個多基因、多途徑、多信號通路相互作用和相互影響的過程。研究Fkbp51 KO和WT小鼠的心臟和肝RNA-seq結(jié)果，對于從分子水平揭示Fkbp51在生物體內(nèi)的作用是一個重要的突破口。

首先，對Fkbp51 KO小鼠心臟測序數(shù)據(jù)進行分析，共篩選出153個差異表達基因，對肝測序數(shù)據(jù)進行分析，共篩選出206個差異表達的基因。進一步，對心臟的差異基因進行GO本體分析和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)心臟差異基因主要參與平滑肌收縮調(diào)節(jié)通路、趨化因子通路、花生四烯酸代謝通路、MAPK信號通路和鈣信號通路等分子過程和信號通路。Pla2g2d和Cyp2b10幾乎參與上述所有過程，Pla2g2d是磷脂酶A2的編碼基因，具有鈣離子結(jié)合活性和磷脂酶A2活性，可能參加炎癥和免疫反應(yīng)；Cyp2b10是細胞色素P450家族成員，能催化藥物和膽固醇代謝，類固醇和其他脂類的合成[10]。Fkbp51與代謝及鈣離子通道相關(guān)，Pla2g2d和Cyp2b10可能通過脂類代謝和鈣離子通道與Fkbp51共同發(fā)揮作用。因此，進一步研究Pla2g2d、Cyp2b10與Fkbp51對脂代謝和鈣離子通道的影響，對于探索Fkbp51在心臟中的脂代謝和肌細胞活性具有重要意義。

肝差異基因進行GO本體和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與類固醇生物合成和代謝、脂類代謝、細胞色素P450外源性代謝通路等分子生物過程及信號通路[8]。在這些過程中，Cyp基因家族幾乎參與上述所有過程。Cyp參與編碼細胞色素P450超家族成員，且Cyp40和Fkbp51都是具有TPR結(jié)構(gòu)域，都可以直接與HSP90結(jié)合參與甾體類激素受體復(fù)合物的形成，可能具有相似或相關(guān)的功能。通過對比研究Cyp基因家族和Fkbp51發(fā)揮作用的機制，對于探討肝組織中Fkbp51參與的多種代謝通路及信號通路，具有重要意義。

進而對心臟和肝差異基因進行韋恩分析，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟和肝的共差異基因共有四個，分別是Cyp2b10、Fkbp5、Hmga1和Rnaset2b，其中Rnaset2b、Hmga1、Fkbp5在心臟和肝中均下調(diào)，而Cyp2b10在心臟中下調(diào)而在肝組織中上調(diào)。Cyp2b10是細胞色素P450家族成員，細胞色素P450蛋白能催化藥物代謝和膽固醇代謝，類固醇和其他脂類的合成。CYP2b10蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，代謝通路主要涉及細胞色素P450異生素的亞麻酸代謝和對代謝影響，并影響鐵離子結(jié)合和氧化還原酶活性。Cyp2b10在肝中上調(diào)，在心臟中下調(diào)，說明基因敲除后肝組織中脂類代謝的影響高于心臟組織。

最后我們對心臟和肝的共差異基因進行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP51與HSF1、HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8、STIP1、CDC37、SUGT1、MYC、HMGA1、CYP7A1、CYP2B10、UGT1A1共同形成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。其中HSP90作為中間環(huán)節(jié)，與FKBP51、HSF1、CDC37、SUGT1、STIP1形成互作網(wǎng)絡(luò)。HSP90即熱休克蛋白，是一種具有ATP酶活性可誘導的分子伴侶，可以調(diào)節(jié)特定靶蛋白的正確折疊。HSF1是熱休克轉(zhuǎn)錄因子1，可以特異性結(jié)合熱休克啟動元件并激活轉(zhuǎn)錄蛋白；CDC37即細胞分離周期蛋白37，在HSP90與其靶激酶結(jié)合發(fā)揮作用的過程中起重要作用；SUGT1有著絲粒功能，作用于熱休克蛋白90的多個轉(zhuǎn)錄變異體剪接交互；STIP1是應(yīng)激誘導磷蛋白1，影響HSP70和HSP90的相互關(guān)系及其ATP酶活性。這些蛋白的作用都圍繞于HSP90蛋白，而HSP90蛋白可以與FKBP51形成復(fù)合物，參與糖皮質(zhì)激素信號傳導和PI3K-AKT信號。充分證明HSP90與FKBP51共同在心臟組織中的發(fā)揮重要作用，也從側(cè)面證實了代謝調(diào)控與心臟發(fā)育是緊密聯(lián)系的。

本研究通過對Fkbp51 KO與WT小鼠的心臟和肝RNA-Seq數(shù)據(jù)分析后，發(fā)現(xiàn)Fkbp51在心臟發(fā)育和代謝通路中的作用既是相互獨立又是相互聯(lián)系的，也為下一步深入研究Fkbp51基因在心臟發(fā)育和代謝通路中作用的分子機制提供了理論基礎(chǔ)，進一步為Fkbp51在心臟疾病和肝疾病中可能起到的作用做出理論鋪墊。未來我們將繼續(xù)展開工作，對這些數(shù)據(jù)分析進行后續(xù)的分子生物學實驗，以期進一步驗證這些分析的可靠性。

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Analysis and comparison of RNA expression profiles in the heart and liverofFkbp51 knockout mice

WU Guang-dong， QIU Bin， WANG Ting-ting， LIU Yun-bo*， YONG Wei-dong*

(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health； 2.Key Laboratory of Human DiseaseAnimal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine； 3.Comparative Medicine Center,Institution of Laboratory Animal Science, CAMS & PUMC, Beijing 100021, China)

Objective To study the function ofFkbp51 in the heart and liver by analyzing the differential RNA expression profiles in the wild-type mice (WT) andFkbp51 knockout (KO) mice, and to elucidate the role ofFkbp51 gene in metabolic pathways in the heart and liver. Methods Using the second generation of high-throughput gene sequencing technology, the mRNA expression profiles of heart and liver were sequenced in WT andFkbp51 KO mice. The data of sequencing of heart tissues were analyzed by DEGseq, and the results of sequencing of liver tissues were analyzed by BRB-Array Tools. The differential genes of the heart and liver in the mice were screened respectively. Gene ontology (GO) analysis and KEGG pathway analysis were performed to analyze the differentially expressed genes using the online tool DAVID. In addition, the differential genes of the two organ tissues were analyzed by Venn diagram. The interaction network of proteins was analyzed using the STRING database. Results (1) The absence ofFkbp51 led to changes in mRNA expressions of heart-related signal pathways such as vascular smooth muscle contraction, chemokine, retinol, and MAPK signaling pathways. (2) The lack ofFkbp51 mostly induced changes in cholesterol synthesis and metabolism, lipid metabolism, redox and other related genes and pathways in the liver. (3) In the heart and liver,Fkbp51 deletionresult ed in four co-differential genes, among them, down-regulation ofRnaset2b,Hmga1 andFkbp51, whileCyp2b10 was down-regulated in the heart but up-regulated in the liver. All these proteins may interact with HSP90 protein and participat in the metabolism of heart and liver tissues. ConclusionsFkbp51 is involved in different metabolic and gene expression regulation pathways of heart and liver, and the roles are both independent and interrelated.

Fkbp51 KO mouse; Liver; Heart; Metabolism; Gene expression; Signaling pathways

北京市自然科學基金資助項目(NO. 7164278)；國家科技重大專項(NO. 2014ZX10004002-003-001)；國家自然科學基金(NO. 81272273)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(NO. DWS201508，DWS201607)。

武光東(1990-)，男，碩士研究生，專業(yè)：動物學。Email: wu_guangdong@126.com

雍偉東，男，研究員，研究方向：生殖與發(fā)育生物學。Email: yongwd@hotmail.com； 劉云波，男，研究員，研究方向：實驗動物質(zhì)量控制。Email: yunboliu@126.com.*共同通訊

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0001-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.001

2017-02-08