劉麗云，龔 健，徐晉珩，張志勇*，崔永興

(1.唐山市工人醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000； 2.唐山市工人醫(yī)院外科，河北 唐山 063000)

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA CCAT1對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌侵襲和遷移能力的影響

劉麗云1，龔 健2，徐晉珩1，張志勇1*，崔永興1

(1.唐山市工人醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000； 2.唐山市工人醫(yī)院外科，河北 唐山 063000)

目的 檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT1在人乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)，并觀察下調(diào)表達(dá)CCAT1對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。方法 檢測(cè)人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1及人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1中CCAT1的水平，在TPC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CCAT1 siRNA質(zhì)粒，利用Transwell小室及劃痕實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)表達(dá)CCAT1對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，通過(guò)Western blot檢測(cè)BRAF、MUC15、RKIP蛋白的變化。結(jié)果 人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1中CCAT1的水平明顯高于人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1；在TPC-1細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)CCAT1后能夠明顯抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力；Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)顯示下調(diào)表達(dá)CCAT1組TPC-1細(xì)胞的穿膜數(shù)與對(duì)照組比較明顯減少。劃痕實(shí)驗(yàn)中下調(diào)表達(dá)CCAT1后細(xì)胞間距較對(duì)照組明顯增大，提示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱。同時(shí)下調(diào)表達(dá)CCAT1可明顯降低細(xì)胞中BRAF、MUC15的表達(dá)，增高RKIP蛋白的表達(dá)。結(jié)論 人乳頭狀甲狀腺癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT1較正常甲狀腺細(xì)胞明顯升高；在乳頭狀甲狀腺癌中下調(diào)表達(dá)CCAT1可抑制細(xì)胞的侵襲、遷移運(yùn)動(dòng)能力，并且可能通過(guò)影響B(tài)RAF、MUC15、RKIP蛋白的表達(dá)發(fā)揮上述功能。

長(zhǎng)鏈非編碼；siRNA CCAT1；人乳頭狀甲狀腺癌；TPC-1；Nthy-ori 3-1；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

人乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)是臨床上最為常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，PTC約占甲狀腺癌的85% ～ 90%[1-3]。PTC臨床上多以手術(shù)治療為主[4]，其早期診斷較為困難。研究顯示，約有50% ～ 80%的PTC患者在確診時(shí)往往已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[5，6]。故而對(duì)PTC細(xì)胞的遷移侵襲能力調(diào)控研究就頗顯重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)調(diào)控型大分子RNA。盡管其并不能轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)，但其在諸多生理活性和生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，如參與細(xì)胞發(fā)育、基因印記、X染色體沉默以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平等[7，8]。令人頗為興奮的是，近來(lái)研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA與人乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)展的關(guān)系極其密切[9]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(colon cancer associated transcript 1，CCAT1)基因是2012年被發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，研究已經(jīng)顯示CCAT1在結(jié)腸癌組織中異常表達(dá)[10]；該基因相對(duì)表達(dá)水平高低還與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移活性關(guān)系密切[11-13]。諸多研究顯示，CCAT1還可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖活化、肺癌、膽囊癌、胃癌、肝癌組織的發(fā)展，并被認(rèn)為是乳腺癌診斷的經(jīng)典生物標(biāo)志分子[14-17]。然而，就CCAT1在人乳頭狀甲狀腺癌方面的研究還較為缺乏。Nissan等[18]研究表明，癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的CCAT1可有效促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。據(jù)此推斷，CCAT1的過(guò)表達(dá)可能也會(huì)促進(jìn)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

因而，本試驗(yàn)擬首先檢測(cè)人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1中CCAT1的表達(dá)水平，研究CCAT1在TPC-1細(xì)胞與正常甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)水平差異；之后通過(guò)檢驗(yàn)CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染后TPC-1細(xì)胞侵襲遷移能力，研究CCAT1的表達(dá)水平與TPC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，并探討其分子機(jī)制，以期為人乳頭狀甲狀腺癌的防治提供依據(jù)和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

胰蛋白酶由美國(guó)Sigma公司購(gòu)進(jìn)；PBS磷酸緩沖液由美國(guó)Hyclone提供；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)買(mǎi)自德國(guó)Heraeus Sepatech 公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和PBS均購(gòu)自美國(guó)Hyclone，Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒(增強(qiáng)型)、5× SDS蛋白上樣緩沖液、20× TBS緩沖液等購(gòu)自南京建成生物有限公司。本試驗(yàn)細(xì)胞處理等過(guò)程中使用的超凈工作臺(tái)提供自上海藝斯高上海貿(mào)易有限公司。BRAF、MUC15、RKIP一抗為兔抗人多克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體購(gòu)于北京百邁客生物科技有限公司，GAPDH為單克隆小鼠抗人GAPDH抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體，均購(gòu)于杭州艾康生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1及人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1中CCAT1的水平

將人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1和人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1加入DMEM培養(yǎng)基，重復(fù)小心吹打細(xì)胞使其均勻分布，隨后離心棄上清液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h，胰蛋白酶溶液消化2～3 min后終止消化；離心棄上清重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度至2×107/mL，采用RT-PCR測(cè)定兩組細(xì)胞的CCAT1 lncRNA基因相對(duì)表達(dá)水平。

據(jù)國(guó)家和地方節(jié)能標(biāo)準(zhǔn)和能效標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，對(duì)應(yīng)的軟件也同步更新。節(jié)能軟件和能效測(cè)評(píng)軟件在全國(guó)使用率均在70%以上，為我國(guó)綠色建筑設(shè)計(jì)創(chuàng)造了條件。軟件除銷(xiāo)售給用戶(hù)外，在我們的綠色建筑的設(shè)計(jì)咨詢(xún)中項(xiàng)目中，也廣泛使用，既檢驗(yàn)了軟件功能，也增加了用戶(hù)體驗(yàn)，有利于軟件的改進(jìn)和完善。開(kāi)發(fā)了綠色建筑設(shè)計(jì)領(lǐng)域系列軟件產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)了綠色建筑設(shè)計(jì)軟件的產(chǎn)業(yè)化。

通過(guò)Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，CCAT1引物序列上游：5’-CCAATTGAACCGAGCCTTGT-3’；下游：5’-TCGTGAGCGTTTTCGCAATG-3’，目的片段長(zhǎng)度298 bp。參照物GAPDH引物序列上游：5’-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’；下游5’-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3’，片段長(zhǎng)度為176 bp。反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳并成像儀攝片，用Image Proplus 6.0圖像分析軟件測(cè)算電泳條帶的OD值，進(jìn)而計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)檢測(cè)重復(fù)三次。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染

CCAT1 siRNA載體質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒分別由上海生工生物有限公司合成并提供。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1細(xì)胞分為CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染組(進(jìn)行CCAT1 siRNA基因載體轉(zhuǎn)染)和陰性對(duì)照組(進(jìn)行空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)兩組，采用電穿孔法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。

用HeBS液(140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，0.75 mmol/L Na2HPO4，6 mmol/L glucose，25 mmol/L Hepes)重懸、計(jì)數(shù)，調(diào)整各組細(xì)胞密度至5×106/mL；每次取200 μL細(xì)胞懸液加入電擊杯，分別向轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組加入4 μg CCAT1 siRNA和空載質(zhì)粒；電擊后25℃靜置2 min，然后分別將兩組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.3 Transwell小室檢測(cè)下調(diào)表達(dá)CCAT1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

培養(yǎng)后48 h，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCAT1 siRNA轉(zhuǎn)染后人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力。將基質(zhì)膠均勻鋪至Transwell小室上室，并加入100 μL細(xì)胞懸液(106/mL)，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，取出Transwell，多聚甲醛固定，風(fēng)干后加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min。擦除上室細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選擇視野拍照，計(jì)算遷移到下腔表面的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)表達(dá)CCAT1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

1.2.5 Western blot檢測(cè)BRAF、MUC15、RKIP蛋白的變化

培養(yǎng)48 h后，采用蛋白免疫印跡法測(cè)定人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1中BRAF、MUC15、RKIP蛋白表達(dá)水平。取兩組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性。每組取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝膠電泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；轉(zhuǎn)膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過(guò)夜)；一抗1∶500，室溫孵育2 h(或4℃過(guò)夜)；TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次；將Western印跡試劑均勻涂于PVDF膜上，凝膠成像系統(tǒng)曝光1 ～ 2 min。用Image Proplus 6.0圖像分析軟件測(cè)算電泳條帶的OD值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

注：A：CCAT1基因的相對(duì)表達(dá)水平電泳結(jié) 果。1：正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1；2：人乳頭 狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1。B：CCAT1基因的相對(duì)表達(dá)水平。圖1 CCAT1基因表達(dá)水平Note. A: Electrophoresis results of relative expression level of CCAT1 gene. 1: Normal thyroid Nthy-ori 3-1 cells; 2: Papillary thyroid cancer TPC-1 cells; B: Relative expression level of CCAT1 gene.Fig.1 Expression level of CCAT1 gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1中CCAT1基因表達(dá)水平

通過(guò)RT-PCR進(jìn)行測(cè)定CCAT1基因相對(duì)表達(dá)水平。圖1為RT-PCR的電泳圖，可見(jiàn)目的基因CCAT1相對(duì)表達(dá)量，人正常甲狀腺細(xì)胞(1.282 ± 0.164)和人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞(3.026 ± 0.243)，基因CCAT1在人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于其在正常甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)水平(P< 0.05)。

2.2 下調(diào)表達(dá)CCAT1后細(xì)胞的侵襲能力

如圖2所示，基因沉默CCAT1對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力變化的影響。陰性對(duì)照組(52.93 ± 4.56)和基因轉(zhuǎn)染組(23.06 ± 2.79)細(xì)胞的侵襲率差異有顯著性(P< 0.05)，與陰性對(duì)照組相比，基因轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞的侵襲率降低。

2.3 下調(diào)表達(dá)CCAT1后細(xì)胞的遷移能力

采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞遷移能力，結(jié)果如圖3。陰性對(duì)照組和基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移率分別是(46.25 ± 3.98)%和(19.20 ± 2.23)%，陰性對(duì)照組與基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移能力差異有顯著性(P<0.05)。CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染顯著降低了TPC-1細(xì)胞的遷移能力，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞降低。

2.4 BRAF、MUC15、RKIP蛋白表達(dá)

如表1、圖4所示，Western blot結(jié)果顯示CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染顯著降低了人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1中的BRAF、MUC15的表達(dá)水平，并提高了RKIP的蛋白表達(dá)水平。與陰性對(duì)照組相比，下調(diào)CCAT1表達(dá)組BRAF和MUC15的蛋白表達(dá)水平分別降低，RKIP表達(dá)水平升高，且二者差異有顯著性(P< 0.05)。

注： A：正常細(xì)胞組；B：陰性對(duì)照組；C：基因轉(zhuǎn)染組。(× 200)圖2 CCAT1下調(diào)表達(dá)后細(xì)胞的侵襲能力Note. A: Normal cell group; B: Negative control group; C: Gene transfection group.Fig.2 inhibition of cell invasion after down-regulation of CCAT1

注： A：正常細(xì)胞組； B：陰性對(duì)照組； C：基因轉(zhuǎn)染組。(×200)圖3 下調(diào)表達(dá)CCAT1后細(xì)胞的遷移能力Note. A: Normal cell group; B: Negative control group; C: Gene transfection group.Fig.3 Inhibition of cell migration after down-regulation of CCAT1

組別GroupsBRAFMUC15RKIP正常細(xì)胞組Normalcellgroup0198±00300213±00380234±0078陰性對(duì)照組Negativecontrolgroup0185±00280207±00350259±0102基因轉(zhuǎn)染組Genetransfectiongroup0067±00100082±00080436±0117

注：A：正常細(xì)胞組； B：陰性對(duì)照組； C：基因轉(zhuǎn)染組。圖4 各組BRAF、MUC15、RKIP蛋白表達(dá)水平Note. A: Normal cell group; B: Negative control group; C: Gene transfection group.Fig.4 Expression levels of BRAF, MUC15 and RKIP proteins in each group

3 討論

盡管長(zhǎng)鏈非編碼RNA無(wú)法編碼蛋白質(zhì)，但是由于其具有特定的空間結(jié)構(gòu)，并可定位于細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；故而其具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，如參與染色質(zhì)重構(gòu)、翻譯和翻譯后調(diào)控、RNA剪接等生理過(guò)程[19-21]。

在正常細(xì)胞中只能檢測(cè)到微量或檢測(cè)不到的CCAT1表達(dá)。在機(jī)體發(fā)生癌變時(shí)，腫瘤組織中的CCAT1基因表達(dá)水平會(huì)顯著升高[22-24]。但就CCAT1在TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)水平的研究尚為缺乏。本研究結(jié)果表明，TPC-1細(xì)胞TPC-1中的CCAT1基因相對(duì)表達(dá)水平顯著高于正常甲狀腺細(xì)胞。這提示高表達(dá)水平的CCAT1可能在TPC-1細(xì)胞的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)通過(guò)CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染以探討CCAT1基因?qū)PC-1細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。本試驗(yàn)提示，下調(diào)CCAT1的基因表達(dá)水平顯著降低了TPC-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。研究顯示CCAT1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移、膽囊癌細(xì)胞進(jìn)展中均具有積極的促進(jìn)作用[25-27]。

BRAF是MAPK信號(hào)途徑最為有效的激活劑[28-30]。彭思丹等[31]研究顯示，人乳頭狀甲狀腺癌組織中的BRAF蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。BRAF可與Ras相互激活而磷酸化MEK和ERK蛋白，并將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等方面的功能。MUC15是黏蛋白家族成員之一，癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的MUC15可以激活ERK-MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而提高癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[32]。RKIP在癌細(xì)胞中低表達(dá)，其可以依賴(lài)Raf和不依賴(lài)Raf兩種方式抑制MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)控癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[33]。本試驗(yàn)通過(guò)沉默CCAT1基因表達(dá)，顯著降低了TPC-1細(xì)胞中BRAF和MUC15的蛋白表達(dá)水平，提高了RKIP蛋白表達(dá)水平。CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染可能通過(guò)調(diào)控BRAF、MUC15和RKIP的蛋白表達(dá)影響癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。癌細(xì)胞中BRAF、MUC15和RKIP蛋白分子表達(dá)均與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。而MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與c-myc蛋白表達(dá)的調(diào)控關(guān)系密切[29]。He等[30]研究表明，c-myc可通過(guò)結(jié)合CCAT1的啟動(dòng)子區(qū)域活化CCAT1基因表達(dá)，上調(diào)的CCAT1進(jìn)而提高癌細(xì)胞侵襲能力。因此CCAT1基因沉默導(dǎo)致的癌細(xì)胞侵襲和遷移能力下降可能通過(guò)c-myc和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

本文通過(guò)CCAT1 siRNA基因轉(zhuǎn)染，顯著抑制了人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的侵襲和遷移活性，其可能是通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的BRAF、MUC15和RKIP蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。因此，CCAT1可能是人乳頭狀甲狀腺癌防治的新靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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Effect of long non-coding RNA CCAT1 on invasion andmigration of papillary thyroid cancer cells

LIU Li-Yun1, GONG Jian2, XU Jin-Heng1, ZHANG Zhi-yong1*, CUI Yong-xing1

(1.Department of Pathology, Tangshan Gongren Hospital, Tangshan 063000, China； 2.Department of Surgery,Tangshan Gongren Hospital, Tangshan 063000)

Objective To detect the expression of long non-coding RNA (lncRNA) CCAT1 in human papillary thyroid cancer, and to observe the effect of CCAT1 down-regulation on the invasion and migration of human papillary thyroid cancer. Methods The expression of CCAT1 was detected in human normal thyroid Nthy-ori 3-1 cells and human papillary thyroid cancer TPC-1 cells. CCAT1 siRNA plasmid was transfected into TPC-1 cells. The effect of CCAT1 down-regulation on cell invasion and migration was observed by Transwell chamber assay and scratch test, and the expressions of BRAF, MUC15 and RKIP proteins were detected by Western blot. Results The level of CCAT1 in human papillary thyroid cancer TPC-1 cells was significantly higher than that in human normal thyroid Nthy-ori 3-1 cells. CCAT1 down-regulation significantly inhibited the invasion and migration of TPC-1 cells. The Transwell invasion assay revealed that the number of migrated TPC-1 cells in the CCAT1 down-regulation group was significantly lower than that in the control group. The scratch test showed an increased distance between cells in the CCAT1 down-regulation group compared to the control group, suggesting a reduced cell motility. The expressions of BRAF and MUC15 proteins were decreased in the CCAT1 down-regulation group, while that of RKIP protein was increased. Conclusions The expression of CCAT1 in papillary thyroid cancer cells is significantly higher than that in normal human thyroid cells. Down-regulation of CCAT1 in papillary thyroid cancer cells may inhibit the cell invasion and migration by regulating the expression of BRAF, MUC15 and RKIP proteins.

LncRNA; siRNA CCAT1; Human papillary thyroid cancer; TPC-1; Nthy-ori 3-1; Cell invasion; Cell migration

劉麗云，主治醫(yī)師。研究方向：腫瘤病理。Email: sunguolei2580@163.com

張志勇，主治醫(yī)師。研究方向：腫瘤病理。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0081-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.015

2017-04-05