劉相文++侯林++張成華++孫純勇++劉金安++田景振

[摘要] 目的 研究赤芍乙醇提取物和水提取物的抗病毒活性。 方法 結(jié)合細(xì)胞病變效應(yīng)法（CPE）及CCK-8試劑盒，以治療指數(shù)（TI）為指標(biāo)，研究赤芍乙醇和水提取物對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV）、單純皰疹病毒（HSV-1）、柯薩奇病毒（COX-B5）、手足口病毒（EV71）的預(yù)防、直接殺滅和穿入后抑制作用。 結(jié)果 赤芍乙醇和水提取物對(duì)RSV、HSV-1、COX-B5、EV71沒有預(yù)防和穿入后的阻斷作用，對(duì)EV71沒有直接殺滅作用，對(duì)RSV、HSV-1、COX-B5有直接殺滅作用，水提取物對(duì)RSV和COX-B5直接殺滅作用效果較好，TI值分別為15.034和13.076；75%乙醇提取物對(duì)HSV-1的直接殺滅作用較好，TI值為10.944；陽性對(duì)照藥對(duì)四種病毒均有作用，其中利巴韋林對(duì)RSV直接殺滅、預(yù)防和穿入后阻斷作用的TI值分別為19.760、16.760、18.028，對(duì)COX-B5的TI值分別為17.482、15.516、16.568，對(duì)EV71的TI值分別43.158、24.296、22.162；阿昔洛韋對(duì)HSV-1直接殺滅、預(yù)防和穿入后阻斷作用的TI值分別為23.432、10.922、23.417。 結(jié)論 赤芍乙醇和水提取物對(duì)RSV、HSV-1、COX-B5具有直接殺滅作用，對(duì)EV71無直接殺滅作用，對(duì)四種病毒無預(yù)防和穿入后阻斷作用，陽性對(duì)照藥對(duì)四種病毒具有直接殺滅、預(yù)防和穿入后阻斷作用。

[關(guān)鍵詞] 赤芍；抗病毒；呼吸道合胞病毒；單純皰疹病毒；柯薩奇病毒

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（a）-0004-04

Study on the antiviral activity of ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra

LIU Xiangwen HOU Lin ZHANG Chenghua SUN Chunyong LIU Jin′an TIAN Jingzhen

College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Province， Ji'nan 250355， China

[Abstract] Objective To investigate the antiviral activity of ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra. Methods Combining with cytopathic effect （CPE） method and CCK-8， taking therapeutic index （TI） as index， the prevention， direct killing and penetration inhibition effects of ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra for respiratory syncytial virus （RSV）， herpes simplex virus （HSV-1）， Coxsackie virus （COX-B5）， hand， foot and mouth virus （EV71） were researched. Results The ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra had no prevention and penetration inhibition effects for RSV， HSV-1， COX-B5， EV71， which had no direct killing effects for EV71 and had direct killing effects for RSV， HSV-1， COX-B5， among which， the water extract had better direct killing effects for RSV and COX-B5， the TI value was 15.034 and 13.076 respectively. 75% ethanol extract of Paeoniae Radix Rubra had good direct killing effect for HSV-1， the TI value was 10.944， all positive control drugs had effects for the four kinds of virus， among which， the TI values of Ribavirin for the direct killing， prevention and penetration inhibition effects of RSV were 19.760， 16.760， 18.028 respectively， which were 17.482， 15.516， 16.568 for COX-B5， 43.158， 24.296， 22.162 for EV71. The TI values of Acyclovir for the direct killing， prevention and penetration inhibition effects of HSV-1 were 23.432， 10.922， 23.417 respectively. Conclusion The ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra has direct killing effects for RSV， HSV-1， COX-B5， has no direct killing effects for EV71， has no prevention and penetration inhibition effects for four kinds of virus， while the positive control drugs have direct killing， prevention and penetration inhibition effects for the four kinds of virus.

[Key words] Paeoniae Radix Rubra； Antiviral； Respiratory syncytial virus； Herpes simplex virus； Coxsackie virus

赤芍（Paeoniae Radix Rubra）為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，赤芍主要含有揮發(fā)油[2]、苷類[3]、黃酮[4]等多種化學(xué)成分，具有抗腫瘤[5]、抑制肺纖維化[6]、抗血栓[7]、抗內(nèi)毒素[8]、抗肝纖維化[9]、神經(jīng)保護(hù)[10]、心臟保護(hù)[11]、抗氧化[12]、抗抑郁[13]、抗驚厥[14]等藥理作用，但其在抗病毒領(lǐng)域的研究較少，本研究將赤芍分別進(jìn)行75%乙醇提取后和水提取，研究其對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV）、單純皰疹病毒（HSV）、柯薩奇病毒（COX-B5）、手足口病毒（EV71）的體外抗病毒活性，為我國(guó)豐富的赤芍資源開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤芍藥材（購買于濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為毛茛科植物芍藥的干燥根）；利巴韋林注射液（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1410206811）；阿昔洛韋注射液（亞寶藥業(yè)制藥有限公司，批號(hào)：15062005）；人喉癌細(xì)胞（Hep-2，為RSV、HSV-1、COX-B5宿主細(xì)胞）、人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD，為EV71宿主細(xì)胞）、RSV、HSV-1、COX-B5、EV71由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，本研究室保存。

1.2 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)AAJ207653），二甲基亞砜（即DMSO，Amresco公司，批號(hào)2705C127）；胰酶（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1737903）；Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號(hào)C0039）；乙醇等化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 供試品的制備

取干燥的赤芍粉末（過60目篩）20 g，10倍量水提取2 h，取濾液抽慮、濃縮，減壓干燥，取適量干燥產(chǎn)物用2%DMSO溶液配成16 mg/mL的供試品溶液，即為赤芍水提取物供試品；75%乙醇回流提取物的制備方法同“赤芍水提取物供試品”制備方法。利巴韋林和阿昔洛韋用2%的DMSO溶液配成50 mg/mL的溶液作為陽性對(duì)照藥供試品。

1.4 病毒的擴(kuò)增

將病毒株200 μL接種于單層細(xì)胞上，加入5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)90%以上的病變時(shí)，反復(fù)凍融3次，吹打，1000 r/min離心5 min，取上清液分裝備用。

1.5 病毒毒力的測(cè)定

將消化好Hep-2和RD細(xì)胞，以105個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種96孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)成單層后使用。將上述擴(kuò)增好的病毒用10倍比系列稀釋，稀釋10個(gè)梯度，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，接種于已經(jīng)長(zhǎng)好細(xì)胞的96孔板中，并設(shè)空白對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照，置病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)90%以上病變時(shí)終止培養(yǎng)，按照CCK-8試劑盒的操作，測(cè)定吸光度OD值。根據(jù)Reed-Muench公式[15]計(jì)算病毒液的半數(shù)感染濃度（TCID50）。細(xì)胞存活率=（各組OD值-空白對(duì)照OD值）/（正常細(xì)胞OD值-空白對(duì)照OD值）×100%。細(xì)胞比距=（高于50%病變率-50%）/（高于50%病變率-低于50%病率）×100%。TCID50=Antilg[高于50%細(xì)胞病變效應(yīng)法（CPE）百分率病毒稀釋度+比距]。

1.6 細(xì)胞毒性的測(cè)定

將供試品藥物（“1.3”中赤芍供試品和陽性對(duì)照藥供試品，下同）用二倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，從“接種于已經(jīng)長(zhǎng)好細(xì)胞的96孔板中”起，操作同“1.5”，計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度（TC50），并確定最大無毒濃度（TC0）。TC50=[Antilog（高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距）]×C，C為第一孔藥物終濃度。

1.7 對(duì)病毒直接殺滅作用

供試品從無毒濃度起，按二倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，與等體積100倍TCID50濃度的病毒液相互作用2 h，每孔100 μL，從“接種于己經(jīng)長(zhǎng)好細(xì)胞的96孔板中”起，操作同“1.5”，計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）和治療指數(shù)（TI）。EC50=[Antilog（高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距）]×C，C為第一孔藥物終濃度。TI=TC50/EC50。

1.8 對(duì)病毒預(yù)防作用

供試品從無毒濃度起，用2%維持液按二倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，每孔100 μL依次接種于已經(jīng)長(zhǎng)好細(xì)胞的96孔板中，2 h后，用PBS清洗，每孔再加入100 μL 100倍TCID50濃度的病毒液，接下來的步驟按照“1.7”操作計(jì)算EC50和TI。

1.9 對(duì)病毒穿入細(xì)胞后的阻斷作用

己經(jīng)長(zhǎng)好細(xì)胞的96孔板中每孔加入100 μL 100倍TCID50濃度的病毒液，2 h后，用PBS清洗，供試品從無毒濃度起，按二倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，每孔100 μL接種，接下來的步驟按照“1.7”操作計(jì)算EC50和TI。

2 結(jié)果

2.1 病毒毒力的測(cè)定結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得，RSV、HSV-1、COX-B5、EV71的TCID50分別為10-5.36/mL、10-4.24/mL、10-4.52/mL、10-4.42/mL。

2.2 對(duì)病毒直接殺滅作用結(jié)果

水提取物抗RSV、COX-B5的效果好于75%乙醇提取物，其TI值分別為15.034和13.076；75%乙醇提取物抗HSV-1的效果與水提物效果相差不大，其TI值分別為10.994和10.100；對(duì)EV71無效，見表1～4。

2.3 對(duì)病毒預(yù)防作用結(jié)果

水提取物和乙醇提取物對(duì)四種病毒均無預(yù)防作用，陽性對(duì)照藥利巴韋林對(duì)RSV、EV71、COX-B5的TI分別為16.230、24.296、15.516，阿昔洛韋對(duì)HSV-1的TI值為10.922，見表5～8。

2.4 對(duì)病毒穿入細(xì)胞后的阻斷作用

水提取物和乙醇提取物對(duì)四種病毒均無穿入后阻斷作用，陽性對(duì)照藥利巴韋林對(duì)RSV、EV71、COX-B5的TI值分別為18.028、22.162、16.568，阿昔洛韋對(duì)HSV-1的TI值為23.417，見表9～12。

3 討論

本研究觀察了赤芍水和75%乙醇提取物對(duì)病毒的直接殺滅作用、預(yù)防作用、穿入后抑制作用，發(fā)現(xiàn)赤芍兩種方法提取物均無穿入后抑制作用、預(yù)防作用，但是具有直接殺滅作用，對(duì)此結(jié)果，筆者進(jìn)行了推測(cè)：第一，對(duì)病毒沒有預(yù)防作用的原因可能是赤芍提取物與細(xì)胞作用，細(xì)胞本身沒有產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的免疫因子，達(dá)不到抑制病毒的有效濃度；第二，對(duì)病毒沒有直接殺滅作用的原因可能是，病毒穿入后，藥物沒有與細(xì)胞表面的受體蛋白結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行對(duì)病毒的殺滅，或者藥物進(jìn)去細(xì)胞的藥物濃度過低，達(dá)不到抑制濃度；第三，對(duì)病毒有直接殺滅作用的原因可能是，病毒還未進(jìn)入細(xì)胞或進(jìn)入細(xì)胞較少時(shí)，藥物就與病毒作用，將其殺死，水提物較75%乙醇提取物較好，作者推測(cè)，水較乙醇極性較大，且能較為完全地從藥物中較大程度地提出藥物成分，故其抗病毒效果較好。

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（收稿日期：2017-01-05 本文編輯：張瑜杰）