王希明 劉波 崔振紅 潘琦

濟(jì)南市的第四人民醫(yī)院， 骨科 250031

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是因多種原因引發(fā)的一組以骨量減少、骨脆性增加及骨微結(jié)構(gòu)變化為基礎(chǔ)病理的代謝性骨病變疾病，病人臨床主要表現(xiàn)為腰背疼痛、身長(zhǎng)縮短、駝背及骨折并發(fā)癥。隨著世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人類生活水平及衛(wèi)生事業(yè)水平巨大提高，人們的年齡也在不斷的提高，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來越高。據(jù)最新的調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)60歲以上人群中OP的發(fā)病率高達(dá) 56%，已成為威脅老年人群生活質(zhì)量的重要疾病因素[1]。骨質(zhì)疏松癥或骨密度減低癥人群中骨缺損常常愈合不佳，往往需要更長(zhǎng)的時(shí)間[2]。因此一種合適的骨生物材料的使用可以對(duì)增加骨缺損的愈合速度與愈合質(zhì)量具有顯著的臨床意義。我們?cè)缙谑褂眠騺盱⑺?ZA)干預(yù)骨質(zhì)疏松大鼠股骨干骺端骨缺損時(shí)可以增加骨缺損的愈合[3]，但是和正常的骨代謝下骨組織的愈合相比，尚有不足之處；單純的骨生物材料β-磷酸三鈣(β-TCP)也可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨缺損的愈合[4]，鑒于此我們假設(shè)唑來膦酸和β-TCP聯(lián)合使用可以明顯加速骨質(zhì)疏松骨缺損的愈合。本研究使用去卵巢的方法誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松，在骨質(zhì)疏松模型的基礎(chǔ)上建立雙側(cè)股骨干骺端骨缺損，植入ZA、聚乳酸-羥基乙酸聚合物(PLGA)、β-TCP復(fù)合人工骨，用修復(fù)結(jié)果來驗(yàn)證我們假設(shè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇3個(gè)月齡的健康成年雌性SD大鼠50只，體重為220～270 g (清潔級(jí)，上海斯萊克公司中心提供)。實(shí)驗(yàn)開始前，正常飲食和飲水，光照和黑暗各12 h，溫度為(23±2) ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料

雙能X線骨密度檢測(cè)儀(美國(guó)HOLOGIC公司)；顯微CT(Micro-CT,SCANCO Medical AG公司，瑞士)；冷凍干燥機(jī)(德國(guó) CHIST-ALPHA1-4)；聚乳酸—羥基乙酸聚合物(PLGA)山東岱罡生物技術(shù)公司；β-磷酸三鈣(β-TCP) 山東岱罡生物技術(shù)公司；唑來膦酸鹽(生產(chǎn)廠家:國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字:H20041955)；鈣黃綠素 (Sigma, 美國(guó))，25%戊二醛，丙酮，乙醚。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立：制作骨質(zhì)疏松雌性大鼠模型，具體如下[5]：隨機(jī)選取 5 只為假手術(shù)組，切開背部皮膚暴露雙側(cè)卵巢，不予摘除直接縫合；其余45 只大鼠接受雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后飼養(yǎng)12周。45只去卵巢大鼠中隨機(jī)選擇5只為模型組。這兩組的大鼠均處死檢測(cè)股骨的骨密度，達(dá)到骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)即認(rèn)為造模成功。

1.3.2ZA、PLGA、β-TCP 復(fù)合材料的制備：使用電子天平稱量一定重量純化后的PLGA 粉末，將其加入相當(dāng)于其本身質(zhì)量 10倍的1,4二氧六環(huán)溶液之中，磁力攪拌充分混勻，能夠使PLGA粉末充分溶入到1,4二氧六環(huán)溶液之中，制成混合溶液，靜置12 h后。再使用電子天平稱量與 PLGA 粉末等重的β-TCP 粉末和相當(dāng)于β-TCP 粉末質(zhì)量8%的ZA粉末，加入到混合溶液中。使用自動(dòng)攪拌機(jī)器將以上配比完成的混合溶液強(qiáng)烈攪拌，直至形成均勻的糊狀漿液，再次超聲混勻，封閉容器，靜置約4 h。取出置入冷凍干燥機(jī)里干燥72 h。干燥完成后將材料取出使用去離子水洗去NaCl，間隔 1 h換水，直至使用AgNO3檢測(cè)不到NaCl為止，再次置入冷凍干燥機(jī)中干燥 48 h，取出放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，至此制作成功ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料[6]。按照上述方法制成ZA、PLGA復(fù)合材料。

1.3.3股骨干骺端骨缺損模型的建立及ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料干預(yù)：將已經(jīng)成功建立骨質(zhì)疏松模型的40只雌性大鼠，隨機(jī)均分成對(duì)照組，ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組，所有大鼠在雙側(cè)股骨干骺端建立骨缺損。后腿備皮，碘伏消毒，股骨髁部外側(cè)切開皮膚及皮下組織，鈍性分離至肌層，分離肌肉并直達(dá)骨面，用手觸摸感知關(guān)節(jié)部位，確認(rèn)股骨髁部外側(cè)，定位后采用骨鉆鉆頭鉆孔 (直徑3 mm，深度6 mm)制造圓形骨缺損[7]， ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組分別植入相應(yīng)的骨材料。確認(rèn)無活動(dòng)出血點(diǎn)后分層縫合，關(guān)閉腹腔后碘伏消毒。術(shù)后肌注2萬U/kg慶大霉素，1次/d，持續(xù)3 d。所有大鼠在處死前第18天以及處死前第5天, 每日分別腹腔內(nèi)注射15 mg/kg劑量的鈣黃綠素。本實(shí)驗(yàn)所使用的藥物劑量參考以前發(fā)表的治療骨質(zhì)疏松效果明顯的文獻(xiàn)中所使用劑量[8]。術(shù)后3個(gè)月采用斷頸法處死所有大鼠，獲取雙側(cè)股骨標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行Micro-CT檢查并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行切片及HE染色。

1.4 Micro- CT檢測(cè)

所有存活的大鼠在術(shù)后3個(gè)月時(shí)處死，完整取下大鼠雙側(cè)股骨，剔除周圍軟組織，生理鹽水沖洗后，采用10%的多聚甲醛固定用于Micro-CT 檢測(cè)。將左側(cè)股骨置于掃描床上，掃描興趣區(qū)為掃描完成后，選擇圓形骨缺損區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)(region of interest， ROI)，得到皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨的三維圖像，并用Micro-CT內(nèi)置軟件(CT An software)進(jìn)行定量分析。獲得大鼠股骨遠(yuǎn)端缺損區(qū)域感興趣區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb．Th)、骨小粱數(shù)量(trabeculae number，Tb．N)、 骨小粱分離度(trabecular spacing， Tb．Sp)、連接密度(connective density, Conn.D.)。

1.5 組織學(xué)檢測(cè)

待所有股骨經(jīng)過Micro-CT檢測(cè)后，所有標(biāo)本用4%多聚甲醛固定， EDTA脫鈣液中浸泡，每3～4天換液1次，連續(xù)脫鈣4周，X線檢測(cè)是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色。不脫鈣骨組織包埋塊修整后置于硬組織切片機(jī)沿股骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度約為30～40 μm，切片在熒光顯微鏡及光鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0 全自動(dòng)圖像分析儀對(duì)骨礦化沉積率(MAR)進(jìn)行計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件(版本19.0，Chicago，IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Image-ProPlus 6.0(Media Cybernetics，美國(guó))軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。通過獨(dú)立t檢驗(yàn)來對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)行比較，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去卵巢術(shù)后3個(gè)月各組大鼠骨密度結(jié)果

手術(shù)后經(jīng)過12周的喂養(yǎng)，假手術(shù)組與去卵巢模型組大鼠股骨的骨密度分別為0.205±0.010 g/cm2，0.188±0.006 g/cm2，兩組之間比較P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明成功制備大鼠骨質(zhì)疏松模型。

2.2 Micro- CT 三維重建分析及骨微觀參數(shù)

我們通過Micro- CT對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重建，重建的結(jié)果如圖1所示，通過內(nèi)置軟件計(jì)算的骨微觀參數(shù)如表1所示。我們可以通過觀察圖1明顯地發(fā)現(xiàn)ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組缺損區(qū)域新生骨明顯多于對(duì)照組，而且新生骨組織聯(lián)系緊密，骨小梁更粗。12周時(shí)，我們明顯可以觀察到ZA、PLGA、β-TCP有著最多的新生骨及最小尚存在的骨缺損。骨微觀參數(shù)更加明顯的表明ZA、PLGA、β-TCP組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和最低Tb.Sp，而對(duì)照組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D。和ZA、PLGA組，β-TCP組比較，ZA、PLGA、β-TCP組骨微觀參數(shù)差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些表明使用ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料以明顯增加骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損修復(fù)速度。

圖1 4組大鼠材料干預(yù)12周后左側(cè)股骨干骺端骨干骺端感興趣區(qū)域Micro-CT三維重建結(jié)果(A：未用藥組；B：β-TCP組；C：ZA、PLGA組；D：ZA、PLGA、β-TCP組)Fig.1 Twelve weeks after the implantation, the Micro-CT 3D reconstruction of bone in the left femoral metaphysis region of interest in each group(A: Control group; B: β-TCP group; C: ZA/PLGA group; D: ZA/PLGA/β-TCP group)

Parameter對(duì)照組β-TCP組ZA、PLGA組ZA、PLGA、β-TCP組Tb.N2.13±0.09 2.23±0.11?&2.39±0.11?#2.76±0.11?#&Tb.Th0.11±0.010.12±0.01?&0.14±0.011?#0.16±0.01?#&BV/TV0.19±0.010.23±0.01?&0.27±0.02?#0.35±0.01?#&Tb. Sp0.54±0.120.47±0.08?&0.42±0.04?#0.25±0.03?#&Conn. D40.21±8.2451.27±5.67?&61.34±6.34?#76.78±14.43?#&

注：與對(duì)照組組比較，*P<0.05；與β-TCP組比較，#P<0.05；與ZA/PLGA組比較，&P<0.05。

2.3 組織切片觀察結(jié)果

大鼠左側(cè)股骨缺損區(qū)域經(jīng)過HE染色結(jié)果如圖2所示，我們可以清楚發(fā)現(xiàn)ZA、PLGA、β-TCP組股骨遠(yuǎn)端缺損區(qū)骨小梁的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組組，且骨小梁之間聯(lián)系緊密，排列有規(guī)律，骨材料剩余更少；切片的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Micro-CT的結(jié)果。熒光共聚焦顯微鏡的觀察的結(jié)果如圖3所示，通過Image-Pro Plus 6.0 計(jì)算言ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組的結(jié)果分別為：0.91±0.10，1.07±0.11，1.28±0.16 和1.51±0.19，通過SPSS軟件統(tǒng)計(jì)表明各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，這表明ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料可以加速缺損區(qū)域新生骨組織的礦化。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)中使用雌性SD大鼠經(jīng)過去卵巢手術(shù)后，在正常環(huán)境下喂養(yǎng)12周通過檢測(cè)股骨骨密度的變化來驗(yàn)證骨質(zhì)疏松模型建立是否成功。隨后在去卵巢大鼠的雙側(cè)股骨干骺端建立標(biāo)準(zhǔn)化的骨缺損，分別植入ZA、PLGA，β-TCP及ZA、PLGA、β-TCP骨生物材料，通過骨缺損區(qū)域骨生物材料來影響局部骨代謝， 12周后處死大鼠取下雙側(cè)股骨行Micro-CT、組織學(xué)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明相對(duì)于單獨(dú)使用ZA、PLGA，β-TCP，ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料的使用可以更好加速骨質(zhì)疏松骨缺損的愈合。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要由于雌激素的不足，因此，骨形成較快，但破骨更快，屬于高轉(zhuǎn)化型。老年型骨質(zhì)疏松，骨量丟失較慢，屬于低轉(zhuǎn)化型[9]。但無論哪種骨質(zhì)疏松癥，骨形成和骨吸收的平衡打破了，都將影響骨質(zhì)最終導(dǎo)致一系列的病理性骨折如常見的骨質(zhì)疏松骨折。骨質(zhì)疏松性骨缺損愈合較普通創(chuàng)傷性骨缺損愈合時(shí)間延長(zhǎng)，效果差，靠自身骨代謝修復(fù)會(huì)造成骨延遲愈合或不愈合，甚至影響患肢的功能，這類疾病往往需要植骨。骨質(zhì)疏松骨缺損由于其特殊性，目前主要通過藥物或者局部的人工骨材料的植入來干預(yù)其修復(fù)進(jìn)程。但是兩者都有不足之處，雖然單純的骨生物材料如β-TCP具有良好的生物相容性、容易生物降解吸收、具有骨傳導(dǎo)性以及無毒副作用，被視為優(yōu)良的骨替代材料[10]。但是其誘導(dǎo)能力有限，特別是對(duì)骨質(zhì)疏松骨缺損這類特異性的骨缺損時(shí)更加不適合，在β-TCP基礎(chǔ)上進(jìn)行改變是一種非常合適的方法。

唑來膦酸因其具有強(qiáng)大的抗骨質(zhì)吸收的作用而常用于骨質(zhì)疏松的防治，最近的幾項(xiàng)研究表明唑來膦酸可以不同程度增加不同部位的骨密度，顯著降低髖部、椎體和非椎體骨折達(dá)到50%[11, 12]。唑來膦酸對(duì)骨礦化表面尤其是骨轉(zhuǎn)換活躍區(qū)有高度親和力，主要作用于破骨細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，抑制骨吸收。使用唑來膦酸干預(yù)后血清中骨吸收標(biāo)志物尿Ⅰ型膠原氨基末端肽 (NTX)、血Ⅰ型膠原 C 端肽 (CTX)和骨形成標(biāo)志物骨堿性磷酸酶 (BAP) 水平均下降[13]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了局部使用唑來膦酸可以明顯加速骨缺損的修復(fù)，加速局部骨礦化。

我們實(shí)驗(yàn)中使用的ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料修復(fù)效果明顯優(yōu)于單獨(dú)的材料，原因可能在于唑來膦酸雖然可以抑制局部破骨細(xì)胞活性，但是其促進(jìn)成骨的能力不佳；β-TCP由于其降解能力在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下明顯下降，12周時(shí)還可以見到大量的白色顆粒，因此限制了其修復(fù)骨缺損的能力，同時(shí)由于β-TCP降解減慢會(huì)占用了新生骨組織的區(qū)域，因此進(jìn)一步減慢缺損的愈合。ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料結(jié)合各自的優(yōu)點(diǎn)，唑來膦酸可以充分發(fā)揮其抑制破骨的能力，相對(duì)而言成骨能力增強(qiáng)，加速β-TCP的降解，降解下來的Ca、P 離子能進(jìn)入活體循環(huán)系統(tǒng)形成新生骨，因此互相作用，最終加速骨缺損的愈合。

本次試驗(yàn)也有其局限性，首先我們實(shí)驗(yàn)使用的大鼠數(shù)量有限，且時(shí)間較短，12周之后動(dòng)物骨缺損修復(fù)的具體情況不知。我們沒有進(jìn)一步從生化角度進(jìn)一步觀察骨骼的具體改變，同時(shí)也沒有進(jìn)一步探索機(jī)制。最后我們實(shí)驗(yàn)使用的ZA劑量參考別的實(shí)驗(yàn)中使用的劑量，同時(shí)治療骨缺損修復(fù)最佳的藥物劑量也不得而知，進(jìn)一步確定最佳劑量也是下一步要考慮的事。

綜上所述，本次試驗(yàn)雖然沒有從機(jī)制，生化方面進(jìn)一步研究ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料修復(fù)骨質(zhì)疏松骨缺損，但是這次試驗(yàn)從體內(nèi)很好的證ZA、PLGA、β-TCP復(fù)合材料可以促進(jìn)骨量的增加、加速骨組織的礦化來加速骨質(zhì)疏松骨缺損的修復(fù)，該復(fù)合材料在臨床的使用有巨大的潛力。