李海波，劉 勇，趙 佳，王燕飛，徐 梁，楊 明

（1. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省安吉縣林業(yè)局，浙江 安吉 313300；3. 浙江省龍泉市林場，浙江 龍泉 323700；4. 浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)林業(yè)站，浙江 安吉 313300）

12個油茶良種的SCAR分子標記鑒別

李海波1，劉 勇2，趙 佳1，王燕飛3，徐 梁1，楊 明4

（1. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省安吉縣林業(yè)局，浙江 安吉 313300；3. 浙江省龍泉市林場，浙江 龍泉 323700；4. 浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)林業(yè)站，浙江 安吉 313300）

以12個長林系列油茶Camellia oleifera良種為試材，基于特異性SCAR分子標記的開發(fā)來鑒別油茶品種。結果表明：基于4條SAPD引物、24對SRAP引物和15個ISSR引物分別對12個油茶品種進行擴增，得到了21條多態(tài)性片段，包括7條nSAPD，10條SRAP和4條ISSR片段。2條nSAPD，7條SRAP和2條ISSR多態(tài)性片段被成功轉化為了11個穩(wěn)定可靠的SCAR標記。長林油茶23號、長林26號、長林53號、長林56號和長林166號有1個SCAR標記，長林3號和長林55號各有2個SCAR標記，長林21號有4個SCAR標記，長林18號有6個SCAR標記，長林4號、長林27號和長林40號沒有SCAR標記。這些SCAR標記可作為品種特異性的DNA指紋，輔助用于12個長林系列油茶良種的鑒別。

油茶；良種；品種鑒別；分子標記；SCAR；DNA指紋

油茶Camellia oleifera是我國南方重要的木本油料樹種，栽培歷史悠久，具有分布區(qū)域廣、栽培面積大、用途多等特點，并集經濟價值于一身[1]，在生態(tài)經濟建設中占有重要地位。早在上個世紀60年代，我國林業(yè)工作者就開展了油茶良種的選育工作，并取得了重大突破。先后選育出了一批優(yōu)良的單株、無性系和家系[2]，其中，具有早實、豐產和穩(wěn)產特點的油茶優(yōu)良無性系已作為最重要的良種資源推廣應用[3]。每公頃產油量達到750 kg以上的新品系，成為油茶主栽品種[4]。近年來，油茶產業(yè)迅速發(fā)展，油茶良種苗木市場供不應求，出現(xiàn)了品系混雜、以假亂真、以次充好的現(xiàn)象。油茶無性系品種的真實性問題一直困擾油茶產業(yè)化的發(fā)展。

油茶各無性系的識別主要依賴其表觀特征，但是許多形態(tài)性狀的鑒定周期長、受環(huán)境影響大，而且隨著無性系數(shù)量的不斷增多，鑒別也愈加困難。況且，用于大面積推廣的油茶芽砧苗尚不具備可用于識別的形態(tài)、生物學特征以及經濟性狀[2]。二十一世紀以來，分子標記技術包括隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD）[5]、簡單重復序列間區(qū)擴增多態(tài)性（Inter Simple Sequence Repeat, ISSR）[6]、相關序列擴增多態(tài)性（Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP）[7]和簡單序列重復（Simple Sequence Repeats，SSR）或微衛(wèi)星（Microsatellite）標記[8]陸續(xù)應用于油茶的生產技術研究，為油茶優(yōu)良無性系的品種鑒別與優(yōu)良品系的分子選育提供一種新的技術手段[2,4,9-12]。這些分子標記中，RAPD的穩(wěn)定性和可重復性較低。SSR具有多態(tài)性豐富、操作簡單、結果可靠、重復性好等優(yōu)點，但SSR標記的開發(fā)需要構建cDNA文庫、利用轉錄組測序技術，還需要對SSR標記的有效性做大量篩選工作，工作量很大、成本高。而且SSR標記用于油茶品種鑒定，不僅要篩選出一組多態(tài)性良好、擴增穩(wěn)定且均勻分布于染色體上的核心引物組合，并采用一個標準化的等位基因檢測方法[13]，還需要建立油茶已知品種的DNA數(shù)據(jù)庫。

SCAR（特征性片段擴增區(qū)域，Sequence Characterized Amplified Region）標記是RAPD標記的進一步發(fā)展，它是基于對特異RAPD片段的測序，根據(jù)兩端序列設計一對18 ~ 24堿基的引物，在較高的退火溫度下進行特異擴增實現(xiàn)的[14]。隨著分子標記技術的不斷發(fā)展，SCAR標記的開發(fā)已不僅僅限于從RAPD發(fā)展而來。幾種分子標記SRAP、ISSR）、特異擴增多態(tài)性DNA（Specifically Amplified Polymorphic DNA, SAPD）也被相繼用于轉化為SCAR標記。無論RAPD，還是SRAP，ISSR，SAPD都是基于通用性引物的PCR擴增，而轉化為SCAR標記是特異性引物的擴增，具有穩(wěn)定、簡便、快速的優(yōu)點，因而被廣泛用于眾多物種在種間或種內的高效鑒別[15-23]。

長林系列油茶品種具有早實豐產、穩(wěn)產、出籽率高、含油量高、抗性強、適應性廣等特性的優(yōu)良無性系。選用長林系列的12個良種作為材料，首先基于SAPD，SRAP和ISSR三種引物通用型的DNA分子標記技術對12個油茶品種的基因組DNA進行大規(guī)模篩選，并進一步通過分子克隆技術開發(fā)獲得油茶品種特異性的SCAR分子標記，進而達到對12個油茶品種快速鑒別的目的。該研究旨在為油茶優(yōu)良無性系的準確鑒別開發(fā)一種新的分子識別方法，為油茶優(yōu)良品種資源的保護提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 12個長林系列油茶優(yōu)良無性系來自浙江省林業(yè)科學研究院在浙江省武義縣俞源鎮(zhèn)鐘蓬村建立的百靈谷油茶幼林基地，分別為：長林3號（CL3）、長林4號（CL4）、長林18號（CL18）、長林21號（CL21）、長林23號（CL23）、長林26號（CL26）、長林27號（CL27）、長林40號（CL40）、長林53號（CL53）、長林55號（CL55）、長林56號（CL56）、長林166號（CL166）。主要經濟性狀參見林萍等[4]的報道。2015年4 ~ 5月進行采樣，每個油茶品種均采集3株，每株取3 ~ 5個幼嫩葉片，置于裝有硅膠的密封袋干燥保存，至完全失水后作為提取基因組DNA的供試材料。

1.1.2 主要試劑及引物 研究所用主要分子生物學試劑包括新型快速植物基因組DNA提取試劑（BioTeke，北京）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANGEN，北京）、PCR擴增試劑2′Power Taq PCR MasterMix（BioTeke，北京），基因克隆所用載體pGEM-Teasy、感受態(tài)細胞DH5a（TaKaRa，大連）。ISSR引物選用加拿大哥倫比亞大學（UBC）開發(fā)的通用引物。ISSR，SRAP，SAPD，nSAPD和SCAR引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司（TSINGKE，北京）合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及濃度測定 將每個油茶品種3株經干燥后的幼嫩葉片粉碎，取等量混合后作為基因組DNA的提取樣品。DNA提取方法參照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明，提取后的DNA測定濃度，并經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 nSAPD，SRAP和ISSR多態(tài)性擴增 SAPD-PCR的擴增體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 10 ml，SAPD（A-NotT-NotG-NotC-Not）引物（10 uM）1 ml，DNA模板（20 ng/ml）3 ml，加ddH2O補齊到20 ml。nSAPD-PCR的擴增體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 10 ml，nSAPD（A-Not-A，A-Not-T，A-Not-G，A-Not-C；T-Not-A、T-Not-T，T-Not-G，T-Not-C；G-Not-A，G-Not-T G-Not-G，G-Not-C；C-Not-A，C-Not-T，C-Not-G，C-Not-C）引物（10 uM）1 ml，DNA模板（SAPD-PCR的產物）1 ml，加ddH2O補齊到20 ml。SRAP和ISSR-PCR的擴增體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 10 ml，SRAP上下游引物（10 uM）各1 ml（或ISSR引物2 ml），DNA模板（20 ng/ml）3 ml，加ddH2O補齊到20 ml。

nSAPD、SRAP和ISSR的擴增反應均在Life ECO型PCR儀（Bioer，杭州）上進行。nSAPD的反應條件為95℃預變性5 min后，94℃變性1 min、39℃退火1 min (A-Not-A，A-Not-T，A-Not-G，A-Not-C；T-Not-A，T-Not-T，T-Not-G，T-Not-C)或41℃退火1 min（G-Not-A，G-Not-T，G-Not-G，G-Not-C；C-Not-A，C-Not-T，C-Not-G，C-Not-C），72℃延伸5 min，共30個循環(huán)；最后于72℃補平10 min，終止溫度為4℃。SRAP的反應條件為94℃預變性5 min后，94℃變性1 min、35℃退火1 min、共5個循環(huán)；之后72℃延伸1 min；繼續(xù)94℃變性1 min、52℃退火1 min、72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后于72℃補平10 min，終止溫度為4℃。ISSR的反應條件為94℃預變性5 min后；94℃變性45 s，退火時間45 s（不同ISSR引物的最佳退火溫度不同），72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后于72℃補平7 min，終止溫度為4℃。

PCR擴增后的產物用1.5%的瓊脂糖凝膠（EB染色）電泳，擴增圖譜的攝取采用美國伯樂自動凝膠圖像分析儀（Chemi Doc XRS imaging system，Bio-Rad，Hercules, CA, USA）。

1.2.3 nSAPD，SRAP和ISSR特異片段回收、克隆及測序 采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒從1.5%的瓊脂糖凝膠中回收nSAPD、SRAP和ISSR的特異片段。特異片段與pGEM-Teasy載體連接，4℃過夜。連接產物轉化于E. coli 感受態(tài)細胞DH5a中，經藍白斑篩選后，每個樣品均隨機挑選5個陽性克隆交付杭州擎科生物技術公司完成測序。

1.2.4 SCAR引物設計 根據(jù)nSAPD，SRAP和ISSR特異片段的測序數(shù)據(jù)，利用Oligo 6.54（MBI，USA）軟件設計SCAR引物。引物設計的主要參數(shù)標準為：Stringency：moderate；Prime Tm Range：60.0±5.0；其余參數(shù)選擇Defaults。用軟件的“Analyse”菜單對設計出的SCAR引物進行分析評價，包括引物二聚體（3’端不形成二聚體）、發(fā)夾結構（DG＜4.5 kcal/mol）、GC含量（45% ~ 55%）、Tm值（上下游引物接近）等，最終設計出一對18~24 bp的特異PCR引物，交由北京擎科合成。

1.2.5 SCAR-PCR擴增 20 ml SCAR-PCR的擴增體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 10 ml，SCAR上下游引物（10 mM）各1 ml，DNA模板（20 ng/ml）3 ml，加ddH2O補齊到20 ml。擴增反應在TC-XP型（Bioer，杭州）擴增儀上進行。反應條件為94℃預變性6 min后；94℃變性40 s，退火時間40 s（不同SCAR引物的最佳退火溫度不同），72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后于72℃補平7 min，終止溫度為4℃。最適退火溫度的取得是通過在SCAR-PCR擴增中逐步提高退火溫度。

2 結果與分析

2.1 nSAPD，SRAP和ISSR多態(tài)性分析、特異片段的克隆及測序

利用nSAPD、SRAP和ISSR分子標記對12個油茶品種的基因組DNA進行PCR擴增，檢測品種間的多態(tài)性差異（圖1）。利用4條SAPD（A-Not，T-Not，G-Not，C-Not）引物分別對12個油茶品種的基因組DNA進行PCR擴增之后，繼續(xù)用16條nSAPD （A-Not-A，A-Not-T，A-Not-G，A-Not-C；T-Not-A，A-Not-T，A-Not-G，A-Not-C；G-Not-A，G-Not-T，G-Not-G，G-Not-C；C-Not-A，C-Not-T，C-Not-G，C-Not-C）引物分別對SAPD-PCR產物進一步進行巢式PCR擴增。nSAPD的擴增圖譜顯示，A-Not-A，A-Not-C，G-Not-T，C-Not-G，C-Not-C這5條引物在12個油茶品種間共檢測到了7條清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性片段；選用24個Me/em系列的SRAP引物對對12個油茶品種的基因組DNA進行PCR擴增，SRAP擴增圖譜顯示，7個SRAP引物（Me1/em9，Me1/em12，Me2/em7，Me6/em4，Me7/em12，Me7/em4，Me8/em8）在12個油茶品種間擴增出了10條帶清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性片段；選用15個UBC系列的ISSR引物對12個油茶品種進行PCR擴增，其中3個ISSR引物共檢測到了4條清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性片段。這7條nSAPD，10條SRAP和4條ISSR多態(tài)性片段被進一步回收、克隆測序，待轉化為SCAR標記。

圖1 12個油茶品種的nSAPD，SRAP和ISSR-PCR擴增圖譜Figure 1 Electrophoretic prof i le of 12 cultivars of C. oleifera amplified with nSAPD, SRAP and ISSR primers

2.2 SCAR標記的建立及可鑒別的油茶品種

對21條多態(tài)性片段的測序數(shù)據(jù)設計出21對SCAR特異引物，分別對12個油茶品種的基因組DNA進行擴增，結果顯示，21對SCAR引物中的10對引物并沒有再現(xiàn)起初nSAPD，SRAP和ISSR標記的多態(tài)性，表明這些多態(tài)性的分子標記未能轉化為特異性的SCAR標記；其余的11對引物（從Co_1R/Co_1F到Co_11R/Co_11F）在各自最適的退火溫度下，從1個或幾個油茶品種中擴增出了預期的特異性條帶（圖2），這表明基于三種分子標記對12個油茶品種的多態(tài)性篩選，2個nSAPD，7個SRAP和2個ISSR多態(tài)性標記已成功轉化為了11個穩(wěn)定特異的SCAR標記CoSC1 ~ CoSC11。表1所示為11對油茶SCAR標記特異引物的名稱、核苷酸序列、最適退火溫度、bp數(shù)，以及這些SCAR標記可用于鑒別的油茶品種。11個SCAR標記對油茶品種的鑒別能力顯著不同，CoSC1可鑒別5個油茶品種，CoSC10可鑒別3個油茶品種，CoSC6和CoSC7均可鑒別2個油茶品種，其余7個SCAR標記可各自鑒別1個油茶品種。從表2所示的11個SCAR標記在12個油茶品種間的分布來看，12個油茶品種所擁有的SCAR標記數(shù)量亦明顯不同，長林23號、長林26號、長林53號、長林56號和長林166號只有1個SCAR標記，長林3號和長林55號各有2個SCAR標記，長林21號有4個SCAR標記，長林18號有6個SCAR標記，而長林4號、長林27號和長林40號則沒有SCAR標記。從SCAR標記的品種特異性來看，11個SCAR標記中的CoSC2，CoSC3，CoSC8為長林18號所特有，CoSC4，CoSC5，CoSC9為長林21號所特有，CoSC11為長林55號所特有，其余的CoSC1，CoSC6，CoSC7和CoSC10均為幾個品種所共有。因此，這11個SCAR標記尚不能鑒別長林4號、長林27號和長林40號，另外9個油茶品種的鑒別則需要11個SCAR標記的聯(lián)合使用。

圖 2 12個油茶品種的SCAR-PCR擴增圖譜Figure 2 Electrophoretic prof i le of 12 cultivars of C. oleifera amplified with SCAR primers

表1 用于12個油茶品種鑒別的特異SCAR標記Table 1 SCAR markers for identification of 12 cultivars of C. oleifera

表212個油茶品種的SCAR標記分布Table 2 Distribution of SCAR markers among 12 cultivars of C. oleifera

3 討論與結論

根據(jù)21條多態(tài)性片段的測序數(shù)據(jù)設計的21對SCAR引物中，11對成功轉化為了SCAR標記CoSC1 ~ CoSC11，可用于9個油茶品種的鑒別。剩下的10對中，5對nSAPD引物和3對SRAP引物在12個油茶品種間的SCAR-PCR擴增出現(xiàn)完全一致的結果，沒有再現(xiàn)起初nSAPD和SRAP的多態(tài)性；2對ISSR引物雖出現(xiàn)多態(tài)性，但重復性很差。這可能是由于起初nSAPD和SRAP檢測到的多態(tài)性來自于引物錯配位點?；蛘哂捎谠O計的SCAR引物不在變異位點，而導致原有的多態(tài)性消失。因此從引物通用性標記轉化為品種特異性的SCAR標記需要做大量的篩選工作和重復性測試，才能最終確定SCAR標記的穩(wěn)定可靠性。1對SCAR引物的擴增產生了2個SCAR條帶的情況，但由于其中1個條帶的擴增效率很低且重復性差，在逐步提高退火溫度后，只有1個SCAR標記穩(wěn)定存在。

針對12個長林系列的油茶優(yōu)良品種，開發(fā)出了11個SCAR標記，可作為品種特異性的DNA指紋，從分子水平上輔助油茶良種的有效鑒別。為了提高品種間分子鑒別的可靠性與便捷性，挖掘品種的多個SCAR標記（多位點SCAR表型）具有重要價值[19]。本研究中，長林3號和長林55號各有2個SCAR標記，長林21號有4個SCAR標記，長林18號有6個SCAR標記。因此在后續(xù)研究中，進一步擴大SRAP，ISSR等通用性引物的多態(tài)性篩選，不僅開發(fā)出可用于鑒別長林4號、長林27號和長林40號品種的SCAR標記，特別是開發(fā)出單個品種的多位點SCAR表型對于這些油茶良種的準確鑒別更有意義。

多重PCR是一種可以在一個PCR反應里同時檢測多位點表型的分子技術手段。利用多重PCR技術將特異性的SCAR標記整合已成功用于了香菇菌株和乳酸菌種間等物種的高效鑒別[19-20,22-24]。因此在后續(xù)研究中，技術層面上進一步優(yōu)化建立油茶品種的多重PCR體系，即將某些品種，例如長林3號和長林55號的2個SCAR標記、長林21號品種的4個SCAR標記、長林18號的6個SCAR標記的引物進行整合，實現(xiàn)在一個PCR反應里同時檢測一個品種的多個SCAR指紋條帶，這樣不僅可以實現(xiàn)油茶品種的高效鑒別，也更有利于油茶品種鑒別的準確性。

SAPD分子標記揭示基因組DNA在限制性內切酶Not I識別位點序列（GCGGCCGC）上的多態(tài)性，其開發(fā)初衷是為了增強原RAPD標記的分辨率并克服其不穩(wěn)定性[25-26]。高分辨率的SAPD標記已成功用于了細菌、酵母、真菌、植物、水稻以及人類的基因組研究[22]，還有最近報道的用于櫻花品種鑒別的研究[27]，但由SAPD轉化為特異性的SCAR標記用于優(yōu)良經濟林品種的鑒別迄今尚未有報道。本研究基于4個SAPD引物和15個ISSR引物的篩選，從12個油茶品種中各獲得了2個穩(wěn)定的SCAR標記，而基于24對SRAP引物的篩選則獲得了7個穩(wěn)定的SCAR標記，顯然SRAP顯示了比SAPD和ISSR標記更高的分辨率、更低的工作量。因此，對于油茶品種的鑒別，SAPD和ISSR不是最佳的分子標記，基于SRAP標記篩選并進一步轉化為特異性SCAR標記更適合于油茶品種高效鑒別。

SCAR分子標記的一個顯著特點是可以由顯性標記發(fā)展為更加有用的共顯性標記[13]。因而本研究中獲得的油茶顯性SCAR分子標記可進一步發(fā)展為共顯性的SCAR標記，用于今后油茶分子標記輔助育種（Marker Assisted Selection）中雜合子的高效鑒定，對于提高油茶育種目的性、精確性及其遺傳改良效率具有重要意義。

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Identification of 12 Superior Cultivars of Camellia oleifera by Sequence Characterized Amplified Region Markers

LI Hai-bo1，LIU Yong2，ZHAO Jia1，WANG Yan-fei3，XU Liang1，YANG Ming4
（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2. Anji Forestry Bureau of Zhejiang, Anji 313300, China; 3. Longquan Forest Farm of Zhejiang, Longquan 323700, China; 4. Anji Meixi Forestry Station of Zhejiang, Anji 313300, China）

Experiments were conducted on sequence characterized amplified region markers (SCAR) from amplified polymorphic DNA (SAPD), sequence-related amplified polymorphism and inter simple sequence repeat (ISSR) molecular techniques for identification of 12 cultivars (Changlin series)of Camellia oleifera. The result demonstrated that twenty-one polymorphic bands (7 from nSAPD, 10 from SRAP and 4 from ISSR) were obtained from the tested cultivars by using 43 primers (4 SAPD, 24 SRAP and 15 ISSR). Eleven (2 from nSAPD, 7 from SRAP and 2 from ISSR) of 21 polymorphic bands were converted into 11 stable and reproducible SCAR markers by designing specific SCAR primers from the 11 sequenced polymorphic bands and by verifying PCR amplification with SCAR primers. Changlin 23, 26, 53, 56 and 166 had only one SCAR marker, Changlin 3 and 55 had two ones, Changlin 21 had four ones, Changlin 18 had six ones, and Changlin 4, 27 and 40 have no SCAR markers. These SCAR markers can be used as cultivar-specific DNA fingerprints for better identification of cultivars.

Camellia oleifera; superior cultivars; identification; molecular markers; SCAR; DNA fingerprints

S794.4

A

1001-3776（2017）02-0017-07

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.02.003

2016-12-25；

2017-02-12

浙江省科研院所扶持專項（No. 2014F30002；2013F50012）；浙江省重大科技專項（No. 2010C02005-1）

李海波，研究員，從事林木遺傳育種研究；E-mail：1178646251@qq.com。通信作者：楊明，助理工程師，從事森林培育研究；E-mail：1178646251@qq.com。