丁城，劉璐，胡勇*

(1.湖北工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；2.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心 教育部發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；3.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068)

基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)辣椒提取液抗氧化性和亞硝酸鹽清除率

丁城1,2,3，劉璐1,2,3，胡勇1,2,3*

(1.湖北工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；2.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心 教育部發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；3.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068)

辣椒包含豐富的活性物質(zhì)并且對(duì)人體健康有益。本研究主要探究了辣椒提取液的抗氧化性和亞硝酸鹽的清除作用。干紅辣椒被濃度為1%～10%的乳酸、草酸、檸檬酸、乙酸和酒石酸連續(xù)提取。辣椒提取液中辣椒堿、辣椒紅素、多酚和類黃酮物質(zhì)被測(cè)定，以及抗氧化性和亞硝酸鹽清除率被探究。在5種有機(jī)酸辣椒提取液中辣椒堿和辣椒紅素含量分別為118.63～66.78 μg/g 和 26.67～7.37 μg/g，多酚和黃酮含量分別為357.03～182.53 mg/L和20.34～3.11 mg/L。草酸提取液的抗氧化性和亞硝酸鹽的清除率最高。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型用于揭示活性成分與抗氧化性和亞硝酸鹽清除率的關(guān)系，結(jié)果顯示：辣椒紅素和多酚物質(zhì)與抗氧化性和亞硝酸鹽清除率顯著性最高。

活性物質(zhì)；抗氧化性；亞硝酸鹽；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

亞硝酸鹽可以改善肉制品的顏色，抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)，因此，被作為食品添加劑廣泛地應(yīng)用于食品中，亞硝酸鹽在食品中最大添加量為156 mg/kg[1-3]。除此之外，亞硝酸鹽還普遍存在于一些天然食物中，如蔬菜和腌制品。但是，亞硝酸鹽能夠和人體內(nèi)胺類物質(zhì)結(jié)合生成亞硝胺，這種物質(zhì)會(huì)對(duì)人體造成很大傷害，例如致癌[4]。

分子氧是人體呼吸和產(chǎn)生三磷腺苷同時(shí)需要的物質(zhì)，也是人類生存和生長(zhǎng)不可缺少的物質(zhì)[5]。然而，人體細(xì)胞蛋白的分解、脂肪的燃燒會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧。過(guò)多的活性氧會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生傷害，但是在一些天然食物中的活性物質(zhì)能夠消除活性氧，減少對(duì)人體的危害[6-8]。

紅辣椒屬于茄科植物，包含大量活性物質(zhì)，如辣椒堿[9]、辣椒紅素[10]、維生素C[11]、多酚和黃酮[12]等物質(zhì)，這些物質(zhì)都具有一定抗氧化性。辣椒中辣椒堿和辣椒紅素具有抗癌的作用[13]，此外，辣椒含有許多抗氧化物質(zhì)，如多酚、黃酮、辣椒紅素、抗壞血酸[14-17]。然而，一些抗氧性物質(zhì)和亞硝酸鹽清除有著密切的聯(lián)系[18]。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是處理大量信息的有效工具，在許多領(lǐng)域被廣泛利用，同時(shí)在食品工業(yè)中應(yīng)用不斷增加[19]。2010年，Dwivedi和 Ramaswamy[20]建立了罐頭傳熱神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型；1995年，Sablani等[21]建立了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)罐頭食品最佳優(yōu)化條件的預(yù)測(cè)。2002年，Mittal和Zhang[22]報(bào)道了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)升溫對(duì)滅菌的影響。

在本研究中，辣椒被不同有機(jī)酸提取，提取液的抗氧化性和亞硝酸鹽清除率被探究。通過(guò)提取液中活性成分和抗氧化性、亞硝酸鹽清除率，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型被建立。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

辣椒堿、辣椒紅素、甲醇、二氯甲烷、DPPH、亞硝酸鈉等試劑。

紅辣椒：采購(gòu)于永州農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 辣椒提取液的制備

辣椒被粉碎機(jī)粉碎后，準(zhǔn)確稱取5 g辣椒粉置于250 mL容量瓶中。分別用濃度為1%～10%的草酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸和乙酸與辣椒粉充分混勻，然后置于50 ℃恒溫水浴鍋中1 h，再超聲0.5 h，過(guò)濾備用。

1.3 多酚的測(cè)定

總酚類物質(zhì)采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定。將100 μL的提取液放置于試管中，并用水調(diào)至10 mL，然后加入0.5 mL的福林酚試劑，反應(yīng)1 min后，添加1.5 mL的20%飽和碳酸鈉，充分混勻，反應(yīng)1 h后，在波長(zhǎng)765 nm處，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定?？偡颖槐硎緸榈葍r(jià)沒(méi)食子酸。

1.4 黃酮類物質(zhì)測(cè)定

0.5 mL的紅辣椒提取物與4.5 mL的15%乙醇混合，然后加入0.3 mL的0.5 mol/L亞硝酸鈉溶液和0.3 mL的0.3 mol/L氯化鋁溶液?；旌虾蠓磻?yīng)5 min，然后加入2 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液和10 mL的15%乙醇，反應(yīng)10 min。在506 nm處，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定?？傸S酮類化合物被表示為等價(jià)兒茶素。

1.5 辣椒堿和辣椒紅素的測(cè)定

辣椒堿和辣椒紅素用高效液相色譜法測(cè)定。

1.6 亞硝酸鹽清除率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取2 mL亞硝酸鈉溶液(6 μg/mL)，置于50 mL容量瓶中，然后加入10 mL的辣椒提取液搖勻，放置30 min，加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸，搖勻后，避光反應(yīng)3 min，再加入1 mL的鹽酸萘乙二胺，搖勻，避光反應(yīng)15 min，然后定容至刻度線，在538 nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)做空白對(duì)照。

式中：A1為未加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值，A2為加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值。

1.7 抗氧化性的測(cè)定

1.7.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

0.1 mL的紅辣椒提取物添加到3.9 mL的0.06 mmol/L DPPH甲醇溶液中，充分混勻。然后在黑暗中反應(yīng)20 min，在515 nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100。

式中：Ai為未加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值，Aj為加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值。

1.7.2 羥自由基清除率的測(cè)定

紅辣椒提取液添加到96孔板中，然后加入0.1 mL3 mmol/mL 1,10-鄰菲羅啉和0.1 mL 3 mmol/mL FeSO4，再加入0.1 mL的0.01%過(guò)氧化氫溶液，充分混勻，在37 ℃反應(yīng)1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度。羥自由基清除率計(jì)算公式如下:

式中：A1為未加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值，A2為加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值，A0為空白吸光值。

1.7.3 超氧陰離子基清除率的測(cè)定

將80 μL焦棓酸和4.5 mL Tris-HCl-EDTA緩沖液加入樣品中?；靹蚝?，在室溫下反應(yīng)30 min，在365 nm處測(cè)定吸光度。超氧陰離子基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值，A2為加入辣椒提取液但未加入焦棓酸測(cè)定的吸光值，A0為未加入辣椒提取液測(cè)定的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒堿和辣椒紅素的含量

不同濃度的5種有機(jī)酸提取液中，辣椒堿和辣椒紅素的含量具有差異。乳酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸和草酸提取液中辣椒堿和辣椒紅素含量見(jiàn)表1。

表1 多酚、黃酮、辣椒堿和辣椒紅素含量Table 1 Total phenolics, flavonoids, capsaicin and capsorubin content of organic acid extract of red pepper

注：a 等價(jià)于沒(méi)食子酸；b 等價(jià)于兒茶素。

辣椒堿和辣椒紅素的含量在不同提取液中，含量變化分別為：118.63～66.78 μg/g和26.67～7.37 μg/g。2%的草酸提取液中，辣椒堿的含量最高(118.63 μg/g)，而3%的草酸提取液中，辣椒紅素的含量最高(26.67 μg/g)。然而，最低含量的辣椒堿(66.78 μg/g)和辣椒紅素(7.37 μg/g)分別在2%(V/V)乙酸和1%(W/V)檸檬酸中被發(fā)現(xiàn)。辣椒紅素是一種重要的天然類胡蘿卜素，Daood等[23]研究：類胡蘿卜素是一類親脂性物質(zhì)，除此之外，在高溫下，類胡蘿卜素會(huì)大量地減少，這也許可以解釋提取液中辣椒紅素含量較少的原因。

2.2 總酚類物質(zhì)和類黃酮

多酚類化合物和黃酮類化合物，如蕓香苷、兒茶素和柚苷配基，普遍存在于植物中，而這些化合物具有重要的生理活性[24]。5種有機(jī)酸提取液中總酚類物質(zhì)和類黃酮含量見(jiàn)表1。酚類物質(zhì)和類黃酮含量變化分別為357.03～182.53 mg/L的沒(méi)食子酸，20.34～3.11 mg/L的兒茶素。6%(V/V)乳酸提取中液總酚類物質(zhì)含量最高，5%(V/V)乳酸提取液中類黃酮物質(zhì)含量最高。

2.3 不同提取物對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

亞硝酸鹽是潛在的致癌物質(zhì)，亞硝酸鹽的過(guò)度消費(fèi)會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[25]。為了研究不同提取液對(duì)亞硝酸鹽清除率的作用，對(duì)不同濃度的有機(jī)酸提取液進(jìn)行了亞硝酸鹽清除率測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2。有機(jī)酸提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率和有機(jī)酸的種類和濃度有關(guān)，更具體地說(shuō)，隨著酸的濃度增加，亞硝酸鹽清除率先增加然后減少，這可能是隨著酸的濃度增加，活性成分的減少，而導(dǎo)致亞硝酸鹽清除率的下降。4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%檸檬酸和2%草酸提取液中亞硝酸鹽清除率最高，分別為96.8%，96.3%，95.4%，93.6%，98.3%。Kang報(bào)道具有抗氧化性的活性物質(zhì)和亞硝酸鹽的清除率有著緊密的關(guān)系。辣椒含有多酚類物質(zhì)、辣椒紅素、維生素C、維生素E和生物堿，這可能是辣椒提取液具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽清除能力的原因。

表2 提取液抗氧化性Table 2 DPPH radical, hydroxyl radical, superoxide radical and nitrite scavenging activity of organic acid extract of red pepper %

此外，進(jìn)一步探究了4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%檸檬酸和2%草酸提取液不同添加量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 辣椒提取液濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

亞硝酸鹽清除率先不斷上升最后趨于平穩(wěn)，不同有機(jī)酸對(duì)亞硝酸鹽清除率作用依次為草酸>乳酸=乙酸>酒石酸>檸檬酸。

2%草酸提取液亞硝酸鹽清除率最高，在反應(yīng)時(shí)間為5～35 min時(shí)，亞硝酸鹽清除率變化范圍為95.6%～98.9%。然而，在15 min時(shí)，亞硝酸鹽清除率趨于平穩(wěn)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)4%乳酸提取液亞硝酸鹽清除率和6%乙酸提取液大致相同。

2.4 抗氧化活性

不同濃度的有機(jī)酸提取液DPPH自由基清除率、超氧陰離子基清除率和羥自由基清除率見(jiàn)表2。DPPH自由基清除率變化范圍為41.1%～74.3%。2%草酸、6%乳酸、5%酒石酸、5%乙酸和3%檸檬酸提取液DPPH自由基清除率最高，依次為74.3%，74.2%，62.5%，73.9%，54.3%。羥基自由基清除率和超氧陰離子基清除率變化范圍分別為60.1%～21.4%和59.4%～23.9%。

進(jìn)一步研究了不同濃度的4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%檸檬酸和2%草酸紅辣椒提取液抗氧化性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 辣椒提取液抗氧化性

提取液濃度很低時(shí)，5種提取液抗氧化性沒(méi)有差別。然而，抗氧化性隨著提取液的濃度增加而上升，在4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%檸檬酸和2%草酸紅辣椒提取液中，2%草酸提取液抗氧化性最強(qiáng)。6%乙酸和4%酒石酸提取液羥自由基清除率大致相同?？偟膩?lái)說(shuō)，4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%檸檬酸和2%草酸提取液自由基清除率和生物活性物質(zhì)含量成正比(見(jiàn)表1)。此外，提取液中含有維生素C，但是在本研究中并沒(méi)有測(cè)定。這些結(jié)果表明：提取液中生物活性物質(zhì)含量與有機(jī)酸的種類和濃度有關(guān)，也與自由基清除率有著密切的聯(lián)系。通過(guò)提取液中的生物活性物質(zhì)，可以確定抗氧化活性的強(qiáng)弱[26]。因此，提取液中的活性成分與抗氧化性和亞硝酸鹽清除率有著怎樣的聯(lián)系值得被研究。

2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)包含3個(gè)層，即輸入層、輸出層和隱藏層。在這項(xiàng)研究中，多酚類物質(zhì)、總類黃酮、辣椒堿和辣椒紅素構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入神經(jīng)元，DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子基清除率和亞硝酸鹽清除率構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出神經(jīng)元。隱含層神經(jīng)元變化范圍為3～21。所有的數(shù)據(jù)被隨機(jī)分為3組：訓(xùn)練(50%)、交叉(20%)和驗(yàn)證(30%)。

2.5.1 敏感性分析

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型敏感性分析是通過(guò)處理不同的輸入層，不斷優(yōu)化模型，而確定重要因素的一種有效的工具，這個(gè)過(guò)程可以在整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中選擇貢獻(xiàn)最大的因素。如果靈敏度因子越大表明該因素與抗氧化活性、亞硝酸鹽清除率顯著性較高，相反，則顯著性較低。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)因素的敏感性見(jiàn)圖3。

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)敏感性分析

與其他的輸入神經(jīng)元比較，多酚類物質(zhì)和辣椒紅素與抗氧化性和亞硝酸鹽清除率顯著性較高，其次是總黃酮類物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽清除率與辣椒堿顯著相關(guān)，但是與抗氧化性無(wú)顯著性。

2.5.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模的性能

在這項(xiàng)研究中，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是一個(gè)3層反向傳播網(wǎng)絡(luò)，包含4個(gè)輸入神經(jīng)元和4個(gè)輸出神經(jīng)元。ANN模型的測(cè)試性能見(jiàn)表3。

表3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型參數(shù)Table 3 Parameters of GA-ANN model

在模型中，標(biāo)準(zhǔn)誤差小于1，而亞硝酸鹽清除率、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和超氧陰離子基清除率相關(guān)系數(shù)分別為0.964，0.956，0.967，0.964，說(shuō)明對(duì)抗氧化性和亞硝酸鹽清除率、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有良好的擬合性。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值和實(shí)際值見(jiàn)表4。

表4 活性物質(zhì)與亞硝酸鹽清除率和抗氧化性關(guān)系Table 4 The relationship between active ingredients and nitrite scavenging activity and antioxidant activity

在網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過(guò)程中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)了良好的性能，并且能夠根據(jù)提取液中活性成分準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抗氧化活性和亞硝酸鹽清除率。殘差分析是驗(yàn)證模型的輸出層，結(jié)果能有效地驗(yàn)證模型是否可以被接受?？寡趸院蛠喯跛猁}清除率的殘差值分析見(jiàn)圖4。

圖4 殘差值與預(yù)測(cè)值

注：(A)為亞硝酸鹽，(B)為DPPH，(C)為羥基，(D)為超氧化物。

殘差值隨機(jī)分布在水平線兩邊，殘差值可以有效地評(píng)估模型預(yù)測(cè)的性能。如果殘差值隨機(jī)分布，說(shuō)明模型有著良好的預(yù)測(cè)性能，否則，模型預(yù)測(cè)性能較差。由圖4可知，該模型能夠有效地預(yù)測(cè)和擬合數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，辣椒提取液中活性成分被測(cè)定，并探究了提取液的抗氧化性(DPPH自由基清除率、超氧陰離子基清除率和羥自由基清除率)和亞硝酸鹽清除率。辣椒提取液中活性成分含量(辣椒堿、辣椒紅素、多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì))的不同，導(dǎo)致了提取液有著不同的抗氧化性和亞硝酸鹽清除率。2%草酸提取液抗氧化性和亞硝酸鹽清除率最高。辣椒提取液有著良好的抗氧化性和亞硝酸鹽清除率，這與提取液中辣椒紅素和多酚類物質(zhì)有著重要的聯(lián)系。

通過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，將辣椒提取液中活性成分與抗氧化性和亞硝酸鹽清除率建立聯(lián)系，結(jié)果顯示：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有著良好的擬合和預(yù)測(cè)性能。該模型可以作為辣椒提取液實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化的一個(gè)有效工具。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有機(jī)酸提取液可以改善食品安全，提高食品質(zhì)量。辣椒提取液中一些特定的活性物質(zhì)與潛在的健康和食品質(zhì)量之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

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Prediction of Antioxidant Activity of Pepper Extract and Clearance Rate of Nitrite Based on Neural Network Model

DING Cheng1,2,3, LIU Lu1,2,3, HU Yong1,2,3*

(1.Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Wuhan 430068, China;2.Key Lab of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei Province,Wuhan 430068, China;3.College of Bioengineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Pepper contains rich active ingredients and physiological active substances promoting the health. Investigate the effects of pepper extract on antioxidant activity and scavenging activity of nitrite. Red peppers are extracted using different concentration (1%～10%) of solvent such as lactic acid, oxalic acid, citric acid, acetic acid and tartaric acid.The levels of specific bioactive compounds (capsaicin, capsorubin, polyphenols and flavonoids substances) are determined, and the antioxidant activity and nitrite scavenging activity are investigated. The capsaicin and capsorubin are extracted from the five organic acids, ranging from 118.63 μg/g to 66.78 μg/g and 26.67 μg/g to 7.37 μg/g respectively. The polyphenols and flavonoids content varies from 357.03 mg/L to 182.53 mg/L and 20.34 mg/L to 3.11 mg/L respectively. The antioxidant activity and nitrite scavenging ability are the highest in oxalic acid extract. The developed ANNs are able to reveal the relationship between the active ingredients and antioxidant activity and nitrite scavenging activity. The antioxidant activity and nitrite scavenging activity are significantly correlated with capsorubin and phenolics.

active ingredients; antioxidant activity; nitrite; neural network

2017-01-22 *通訊作者

丁城(1991-)，男，湖北武漢人，碩士，研究方向：食品發(fā)酵與分子生物學(xué)； 胡勇(1980-)，男，湖北荊門人，講師，博士，研究方向：醋酸菌等工業(yè)微生物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和代謝組學(xué)特征。

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.018

1000-9973(2017)07-0082-08