盧立泉,邱立平*,劉盼盼,謝 康,程洪濤,石 亮,王 琰(.濟(jì)南大學(xué)土木建筑學(xué)院,山東 濟(jì)南500；.齊魯理工學(xué)院,山東 濟(jì)南 5000)

接種BAF處理海水養(yǎng)殖廢水低溫啟動(dòng)及微生物特性

盧立泉1,邱立平1*,劉盼盼2,謝 康1,程洪濤1,石 亮1,王 琰1(1.濟(jì)南大學(xué)土木建筑學(xué)院,山東 濟(jì)南250022；2.齊魯理工學(xué)院,山東 濟(jì)南 250200)

為研究低溫條件下曝氣生物濾池(BAF)處理高鹽貧營養(yǎng)含氮廢水的啟動(dòng)特性,在系統(tǒng)運(yùn)行水力停留時(shí)間為1h,水溫為12～16 ,℃氣水比為2:1(溶解氧控制在3～5mg/L),進(jìn)水pH值為7.38～8.23,高錳酸鹽指數(shù)為5.11～9.46mg/L,氨氮為3.27～4.88mg/L的工況條件下,對(duì)比考察了接種普通活性污泥和海水底泥沸石BAF處理人工模擬海水養(yǎng)殖廢水的低溫啟動(dòng)規(guī)律和微生物種群特性.結(jié)果表明,接種海水底泥與普通活性污泥的BAF反應(yīng)器分別于39和35d完成掛膜啟動(dòng),氨氮平均去除率分別為91%、95.7%,出水氨氮平均濃度分別為 0.36、0.17mg/L;高錳酸鹽指數(shù)的平均去除率分別為 31.9%、36.5%,出水平均濃度分別為 4.96、4.63mg/L.變性梯度凝膠電泳(DGGE)和16SrDNA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),兩座反應(yīng)器微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化,普通活性污泥、海水底泥及其對(duì)應(yīng)接種種泥的BAF反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定一個(gè)月后的反沖洗泥樣多樣性指數(shù)分別為 2.41、2.63、2.88、2.65; 隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),兩種接種方式 BAF的微生物種群數(shù)量及豐度差異逐漸減弱,優(yōu)勢(shì)種群趨于一致,表現(xiàn)出很強(qiáng)的相似性;部分耐鹽的氨氧化菌成為優(yōu)勢(shì)菌種,穩(wěn)定運(yùn)行的BAF生物種群以γ-變形菌綱為主.

沸石生物濾池；接種污泥；海水養(yǎng)殖廢水；啟動(dòng)特性；微生物種群

隨著海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)的提升及市場(chǎng)需求的日益擴(kuò)大,海水養(yǎng)殖業(yè)已然向集約化、高產(chǎn)化的模式發(fā)展[1],與此同時(shí),大量的養(yǎng)殖廢水排放入海給周邊環(huán)境造成了巨大的影響.海水養(yǎng)殖廢水中的污染物,尤其是氨氮,容易消耗水中氧氣導(dǎo)致水體缺氧,出現(xiàn)黑臭問題,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)赤潮[2],造成生態(tài)失衡,生物多樣性遭到破壞,因此,氨氮是養(yǎng)殖水體中主要的難去除污染物質(zhì)[3].

由于海水養(yǎng)殖廢水具有高鹽度和貧營養(yǎng)的水質(zhì)特征,處理難度較大,目前海水養(yǎng)殖廢水處理技術(shù)尚處于探索階段,缺乏完全行之有效的工程技術(shù)方法[4].Meske等[5]嘗試通過活性污泥法處理水產(chǎn)養(yǎng)殖循環(huán)用水,結(jié)果出水 NH4+-N達(dá)不到回用要求,究其原因是沒有徹底解決最小污泥齡問題.BAF可進(jìn)行模塊化應(yīng)用,在有機(jī)物和氮的去除方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6],根據(jù)海水養(yǎng)殖廢水的水質(zhì)特點(diǎn),可以考慮采用曝氣生物濾池(BAF)對(duì)其進(jìn)行處理,甚至回用.但是由于海水的鹽度效應(yīng)及養(yǎng)殖廢水污染結(jié)構(gòu)的特殊性,而且海水養(yǎng)殖是敞開式的外部環(huán)境,易受到溫度影響,尤其在我國北方地區(qū),低溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),BAF處理海水養(yǎng)殖廢水可能會(huì)遇到啟動(dòng)困難、微生物生長(zhǎng)緩慢、群落不完整和不穩(wěn)定等諸多問題[7].通過在序批式反應(yīng)器中投加循環(huán)養(yǎng)殖廢水底泥和少許厭氧池的污泥,縮短了啟動(dòng)時(shí)間,證實(shí)了活性污泥在接種過程中可以彌補(bǔ)海水養(yǎng)殖廢水中有機(jī)質(zhì)不足的弊端[8].

生物膜是BAF的核心,生物膜的附著程度及生長(zhǎng)情況直接影響著其處理效能和實(shí)際運(yùn)行費(fèi)用,因此選用合適的掛膜方法來啟動(dòng)BAF,具有重要的工程實(shí)踐意義[9].研究表明[10-11],水溫在20～24℃范圍內(nèi),BAF處理海水養(yǎng)殖廢水自然掛膜在42d左右,如果溫度降低,會(huì)影響氨氧化菌的代謝生長(zhǎng),即在低溫條件下,掛膜時(shí)間會(huì)更長(zhǎng).研究發(fā)現(xiàn),人工接種掛膜啟動(dòng)BAF時(shí)間明顯少于自然掛膜所需時(shí)間[12].為縮短啟動(dòng)時(shí)間,最大程度發(fā)揮BAF除氨氮效能,有必要進(jìn)行人工接種掛膜來啟動(dòng)生物反應(yīng)器.

因此,本文以沸石曝氣生物濾池為依托,系統(tǒng)研究接種不同種泥(普通活性污泥和海水底泥)BAF在低溫條件下處理高鹽貧營養(yǎng)含氮廢水的啟動(dòng)特性,研究其生物群落結(jié)構(gòu)及演替變化規(guī)律,旨在為沸石BAF處理海水養(yǎng)殖廢水啟動(dòng)方式和工藝設(shè)計(jì)優(yōu)化提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料

生物種泥采用海水底泥和普通活性污泥,分別取自威海榮成和光大水務(wù)(濟(jì)南)水質(zhì)凈化二廠.兩種泥樣的污泥性能指標(biāo)測(cè)定方法參照手冊(cè)[13],結(jié)果如表1所示.根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]和實(shí)驗(yàn)室小試試驗(yàn)[16],對(duì)比分析了鹽度條件下陶粒、火山巖和沸石濾料對(duì)氨氮的吸附性能和成本比較,擇優(yōu)選定沸石為曝氣生物濾池濾料.

表1 不同接種污泥的性能比較Table 1 Performance comparison of different inoculation sludge

實(shí)驗(yàn)用水為人工模擬海水養(yǎng)殖廢水,即在蒸餾水中加入 NH4Cl、NaNO2、KNO3、MgCl2、CaCl2、FeSO4·7H2O等,配置營養(yǎng)母液,其它微生物所需痕量元素由花園浸出液提供,鹽度由海水晶調(diào)節(jié)(控制在 30‰左右),并投加葡萄糖以提供微生物生長(zhǎng)所需的碳源(表2).

表2 模擬海水養(yǎng)殖廢水水質(zhì)Table 2 Characteristics of simulated seawater aquaculture wastewater

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置和方法

實(shí)驗(yàn)裝置(圖1)由2座同步運(yùn)行的模型BAF組成,每座 BAF接種 1種種泥,分別記為 HSBAF(接種海水底泥)和 AS-BAF(接種普通活性污泥).模型BAF由有機(jī)玻璃制作,柱高1000mm,內(nèi)徑70mm,每個(gè)反應(yīng)器裝填高度為600mm的沸石濾料,底部裝填 100mm厚的鵝卵石承托層,曝氣頭位于承托層上部,承托層以上每隔 15cm設(shè)一取樣口,儲(chǔ)于水箱中的模擬海水養(yǎng)殖廢水經(jīng)蠕動(dòng)泵進(jìn)入反應(yīng)器底部,升流式運(yùn)行,反沖洗水、氣也由底部進(jìn)入.

圖1 沸石曝氣生物濾池系統(tǒng)示意Fig.1 Schematic diagram of zeolite BAF system

考慮到實(shí)際工程應(yīng)用的需要,本實(shí)驗(yàn)選擇先將接種污泥與要處理的模擬廢水混合,再注入沸石BAF中進(jìn)行悶曝;24h后排空,重新注入混合液,繼續(xù)悶曝 24h,隨后放空濾柱;以同樣的方式重復(fù)3次后,改用小流量進(jìn)水,保持水力停留時(shí)間為1h.

啟動(dòng)期間系統(tǒng)運(yùn)行的水力停留時(shí)間為1h,水溫為 12～16℃,氣水比為 2:1(溶解氧控制在 3～5mg/L),pH值為7.38～8.23,進(jìn)水高錳酸鹽指數(shù)為5.11～9.46mg/L,NH4+-N為3.27～4.88mg/L.定時(shí)測(cè)量反應(yīng)器進(jìn)、出水的高錳酸鹽指數(shù)、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、pH值和溶解氧,所有水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定均按國標(biāo)方法進(jìn)行[17].

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)的操作根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]所述方法進(jìn)行,并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行了修正:分別提取接種的普通活性污泥、海水底泥以及相對(duì)應(yīng)接種種泥的BAF反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定1個(gè)月后的反沖洗泥樣品,利用FastDNATMSPIN Kit Soil提取樣品基因組DNA,以樣品基因組DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物GC-338F (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R (5’ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)擴(kuò)增樣品 16S rDNA高變區(qū)序列,PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel ExtractionKit純化回收后,取 10μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析.用滅菌的手術(shù)刀切下待回收的DGGE圖譜中的優(yōu)勢(shì)條帶,將PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆,進(jìn)行序列測(cè)定,得到的序列信息和GenBank數(shù)據(jù)庫中的信息進(jìn)行相似性比對(duì),以進(jìn)一步確定相關(guān)微生物種類.

2 結(jié)果和討論

2.1 啟動(dòng)運(yùn)行階段 BAF對(duì)高錳酸鹽指數(shù)的去除

啟動(dòng)運(yùn)行階段接種2種種泥的沸石BAF進(jìn)水及出水高錳酸鹽指數(shù)和去除率隨時(shí)間變化情況如圖2、圖3所示.

圖2 啟動(dòng)階段HS-BAF對(duì)高錳酸鹽指數(shù)的去除效果Fig.2 Permanganate index removal from HS-BAF system during start-up phase

由圖2可以看出,HS-BAF前期對(duì)高錳酸鹽指數(shù)的去除效果不穩(wěn)定,但總體可以保持一定的去除能力,這是因?yàn)殡m然海水底泥中的微生物菌群相對(duì)較少,但沸石濾料的前期不飽和吸附特性可以彌補(bǔ)微生物氧化有機(jī)物能力較弱的缺陷.相對(duì)應(yīng)地,圖3顯示,AS-BAF對(duì)高錳酸鹽指數(shù)的前期去除要穩(wěn)定且高效的多,這是通過沸石填料的吸附和微生物的生物氧化作用協(xié)同完成的結(jié)果.綜合對(duì)比圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn),雖然兩者去除趨勢(shì)大致相同,但是AS-BAF整體對(duì)高錳酸鹽的去除要比HS-BAF穩(wěn)定的多,而且上升趨勢(shì)沒有大幅度的波動(dòng),這是因?yàn)榛钚晕勰嗟漠愷B(yǎng)菌種類較多,高鹽環(huán)境對(duì)異養(yǎng)菌的活性沒有完全抑制,故可以保持相對(duì)穩(wěn)定的有機(jī)物去除能力.2個(gè)反應(yīng)器在大約30d左右,高錳酸鹽指數(shù)的出水相對(duì)穩(wěn)定,分別達(dá)到2.74和2.52mg/L,此時(shí)可以認(rèn)為,微生物種類大致確定,不會(huì)發(fā)生大范圍的變化.

圖3 啟動(dòng)階段AS-BAF對(duì)高錳酸鹽指數(shù)的去除效果Fig.3 Permanganate index removal from AS-BAF system during start-up phase

2.2 啟動(dòng)運(yùn)行階段BAF對(duì)氨氮的去除

圖4 啟動(dòng)階段HS-BAF氨氮的去除效果Fig.4 Ammonia nitrogen removal from HS-BAF system during the start-up phase

圖5 啟動(dòng)階段AS-BAF氨氮的去除效果Fig.5 Ammonia nitrogen removal from AS-BAF system during the start-up phase

啟動(dòng)運(yùn)行階段接種2種種泥的沸石BAF進(jìn)水及出水氨氮濃度和去除率隨時(shí)間變化情況如圖4、圖5所示.

圖4顯示,反應(yīng)器啟動(dòng)的前9d,HS-BAF氨氮去除率從13%增加到34%,AS-BAF氨氮去除率從17%提高到38%,這是由于在反應(yīng)器啟動(dòng)初期,沸石發(fā)揮著物理吸附及濾料的截留作用,這種吸附和截留性能在生物膜沒有成熟之前為氨氮的去除提供了保障.HS-BAF在第 9d之后,氨氮去除率都有下降的趨勢(shì),除了濾料吸附飽和的原因之外,低溫影響微生物生長(zhǎng)速度也是一個(gè)重要的因素.氨氧化菌在低溫條件下活性不高,并且廢水環(huán)境高鹽高氯,都會(huì)影響菌群微生物的生長(zhǎng).第12d之后,這種去除效果下降的趨勢(shì)逐漸消失,直到第30d左右,氨氮去除率在35%的水平上下波動(dòng),且HS-BAF反應(yīng)器中氨氮濃度波動(dòng)范圍較小,說明耐鹽菌在這個(gè)階段逐漸生長(zhǎng),并且這些菌種在接種海水底泥的 HS-BAF反應(yīng)器中環(huán)境變化不大,氨氧化菌和有氨氮去除作用的嗜鹽菌比較穩(wěn)定.自第 30d之后,氨氮去除有了明顯的提高,并且去除率梯度變化較大,表明氨氧化菌已經(jīng)適應(yīng)高鹽環(huán)境,逐漸繁殖生長(zhǎng),成為優(yōu)勢(shì)種群,在第39d之后,氨氮的去除率穩(wěn)定在82%.由圖5可知, AS-BAF的氨氮去除趨勢(shì)與HS-BAF大致相同,只有在波動(dòng)的時(shí)間長(zhǎng)短與后期達(dá)到最高穩(wěn)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)有所區(qū)別.AS-BAF反應(yīng)柱的波動(dòng)時(shí)間在10d左右,且波動(dòng)較大,在20%～40%之間,說明在這段時(shí)間優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了明顯交替,且受生長(zhǎng)環(huán)境影響較大,使得處理效果不穩(wěn)定.在第27d之后,氨氮去除率呈逐漸上升趨勢(shì),且在 3d之內(nèi)升至較高水平,在第35d左右氨氮去除開始穩(wěn)定,去除率達(dá)到87%.這種變化曲線表明,在接種活性污泥的海水養(yǎng)殖廢水環(huán)境中,由于前后生長(zhǎng)環(huán)境的差異使得微生物種類變化較大,氨氧化菌和有特殊功能的嗜鹽菌在氨氮去除的過程中發(fā)揮著重要作用.綜合對(duì)比圖4和圖5可以發(fā)現(xiàn),接種海底底泥和活性污泥的BAF在啟動(dòng)運(yùn)行階段對(duì)氨氮的去除整體變化趨勢(shì)大致相同,去除率前期波動(dòng)較大,后期趨于穩(wěn)定,并達(dá)到較好的處理水平,其處理出水水質(zhì)中氨氮符合《中華人們共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-海水養(yǎng)殖水排放標(biāo)準(zhǔn)(SC/T9103-2007)》[20]的出水要求.在進(jìn)水負(fù)荷大體穩(wěn)定之后,系統(tǒng)生物膜增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好,氨氮去除性能逐漸提升,由此可見,穩(wěn)定的進(jìn)水負(fù)荷也有利于系統(tǒng)的啟動(dòng).

HS-BAF和AS-BAF分別運(yùn)行39d和35d后,高錳酸鹽指數(shù)的去除率超過 45%, NH4+-N去除率達(dá)到 80%以上,且保持相對(duì)穩(wěn)定;用肉眼可以觀察到濾料表面上附著明顯的淡黃色生物膜,還有絲狀絮體,用顯微鏡可以觀察到淺色菌膠團(tuán)、絲狀菌和固著型纖毛蟲;此時(shí)HS-BAF和AS-BAF處理出水清澈,出水水質(zhì)符合《中華人們共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-海水養(yǎng)殖水排放標(biāo)準(zhǔn)(SC/T9103-2007)》[20]的要求,至此標(biāo)志反應(yīng)器啟動(dòng)成功.

結(jié)合文獻(xiàn)[21-26]和本試驗(yàn)結(jié)果,不同溫度條件下自然掛膜與接種掛膜BAF啟動(dòng)時(shí)間如圖6所示.

一般處理生活污水的BAF常溫接種掛膜可在20d左右完成啟動(dòng)[21],但楊婧雯等[22]在8～16℃的溫度條件下處理生活污水接種啟動(dòng)BAF的時(shí)間為 27d, 與自然掛膜時(shí)間相差無幾,說明低溫抑制氨氧化菌的代謝,致使優(yōu)勢(shì)菌種演替緩慢;相比生活污水處理,宋協(xié)法等[23]在處理循環(huán)養(yǎng)殖水時(shí),常溫條件用活性污泥接種BAF的啟動(dòng)時(shí)間為 30d, 海水養(yǎng)殖廢水的高鹽度、貧營養(yǎng)特點(diǎn),是其啟動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)的主要原因, 也有研究表明[27-28],海水養(yǎng)殖廢水中高濃度的氯能夠抑制氨氧化,進(jìn)而大大延長(zhǎng)了建立完整硝化系統(tǒng)的時(shí)間.由于低溫對(duì)氨氧化菌的活性抑制效應(yīng),在低溫條件下BAF處理海水養(yǎng)殖廢水的掛膜啟動(dòng)更為困難,王博[24]在低溫下進(jìn)行了生物濾器自然掛膜處理海水養(yǎng)殖廢水的試驗(yàn),其啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 71d.本研究中2座沸石BAF的低溫掛膜啟動(dòng)時(shí)間分別為35和39d,可見人工接種掛膜可以有效促進(jìn)低溫高鹽條件下BAF的啟動(dòng).

圖6 不同溫度及接種條件下的BAF啟動(dòng)時(shí)間Fig.6 Start-up time of BAF in different conditions of temperature and inoculation

2.3 穩(wěn)定運(yùn)行階段 BAF對(duì)高錳酸鹽和氨氮的去除

在反應(yīng)器啟動(dòng)成功之后,進(jìn)入穩(wěn)定運(yùn)行階段,期間高錳酸鹽指數(shù)和氨氮濃度的去除變化如圖7、圖8所示.

由圖 7可以看出,在進(jìn)水條件相同的前提下,HS-BAF和AS-BAF反應(yīng)器在穩(wěn)定運(yùn)行階段的高錳酸鹽指數(shù)的去除沒有大幅度的波動(dòng),去除率保持在 50%左右,說明系統(tǒng)生物膜中的異養(yǎng)菌種群已穩(wěn)定形成,并發(fā)揮著生物氧化作用.功能穩(wěn)定的生物膜不僅強(qiáng)化了濾料層的截留作用, 其部分代謝產(chǎn)物如胞外聚合物(EPS)及溶解性微生物產(chǎn)物(SMP),還可以起到生物絮凝的作用[29-30],進(jìn)一步把濾床中懸浮性有機(jī)物凝聚沉降下來,使部分大分子有機(jī)物在生物反應(yīng)器中被生物膜吸附,提高了生物膜系統(tǒng)的綜合去除能力.綜合兩者的變化曲線,AS-BAF較HS-BAF的有機(jī)物去除能力稍強(qiáng),說明AS-BAF中的異養(yǎng)菌數(shù)量比HSBAF要多,豐度可能也較好.

圖7 穩(wěn)定運(yùn)行階段HS-BAF、AS-BAF高錳酸鹽指數(shù)的去除效果Fig.7 Permanganate index removal in the HS-BAF and AS-BAF system at the stable running stage

圖8 穩(wěn)定運(yùn)行階段HS-BAF、AS-BAF氨氮的去除效果Fig.8 Ammonia nitrogen removal in the HS-BAF and AS-BAF system at the stable running stage

圖8表明,在穩(wěn)定運(yùn)行階段,雖然進(jìn)水負(fù)荷波動(dòng)較大,但出水氨氮穩(wěn)定保持在較低水平,HS-BAF和AS-BAF的出水氨氮濃度都能保持在 0.30mg/L左右,去除率也在 90%以上,系統(tǒng)的除氮效能都較為穩(wěn)定,說明在穩(wěn)定運(yùn)行階段,2種接種方式BAF的處理效果無明顯差別.原因是經(jīng)過前期微生物馴化培養(yǎng),反應(yīng)器內(nèi)的菌種對(duì)水質(zhì)的適應(yīng)性增強(qiáng),最終兩種接種方式BAF的優(yōu)勢(shì)種群都能有效降解氨氮.

2.4 微生物種群結(jié)構(gòu)分析

2座沸石BAF啟動(dòng)成功并穩(wěn)定運(yùn)行1個(gè)月后,對(duì)濾池反沖洗生物膜和接種污泥進(jìn)行了分子生物學(xué)分析,以期考察高鹽度條件下濾池微生物種群的結(jié)構(gòu)特征及演替變化規(guī)律. 16S rDNA PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析結(jié)果見圖9.

圖9 DGGE圖譜Fig.9 Atlas of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

如DGGE圖譜所示,兩種接種方式BAF啟動(dòng)成功后,微生物種群較為豐富,隨著反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行,沸石濾料中的優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)生了更迭演替.其中,條帶20、23、25在4個(gè)泥樣中均存在,說明這些菌種能適應(yīng)養(yǎng)殖廢水的水質(zhì)條件,具有比較寬的生態(tài)幅;活性污泥種泥中,條帶15、16、18、22、27、34、37均為優(yōu)勢(shì)菌種,但隨著反應(yīng)器的運(yùn)行,由于不適應(yīng)高鹽環(huán)境而逐漸被淘汰;而條帶2、5、7、8、9、10、11、13、14、17、21、28、33、36、38在活性污泥種泥中并未檢出,隨著反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),菌群得到了富集和增殖,說明這些菌種適應(yīng)高鹽低溫環(huán)境并可以發(fā)揮其生態(tài)功能;條帶30和40所代表的菌種在活性污泥馴化過程中保留了下來,說明該菌種適應(yīng)性較強(qiáng),既能處理生活污水,又能在海水養(yǎng)殖廢水的處理過程中發(fā)揮作用.類似的,條帶 17、20、23、25、28在海水底泥接種啟動(dòng)BAF后得以保留,條帶3、5、6、9、10、11、12、25、32、38、40、42、 47可以認(rèn)為是海水底泥馴化得到的新菌種,而海水底泥樣品中條帶1、7、15、19、24、33、36、37、41、43逐漸消失.

為了了解反應(yīng)器在啟動(dòng)過程中優(yōu)勢(shì)菌種的變化情況,將 DGGE凝膠條帶回收,克隆、測(cè)序,在NCBI中比對(duì),結(jié)果見表3.

表3 序列對(duì)比分析結(jié)果Table 3 The results of sequence analysis

由分析結(jié)果得到,所有條帶分屬于 6個(gè)門類,其中 Proteobacteria在數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì).由此可以看出,BAF在低溫條件下經(jīng)過長(zhǎng)期的馴化,微生物種群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了較高的豐度.其中,條帶 9、13、14、17屬于 γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),條帶 10屬于梭菌綱(Clostridia),條帶36、38屬于擬桿菌門中的黃桿菌目(Flavobacteriales),這些為高鹽環(huán)境下活性污泥馴化出來的優(yōu)勢(shì)菌種,其中,所屬黃桿菌目的菌種為兼性厭氧菌,能夠利用NO3--N或NO2--N為電子受體在低溶氧條件下進(jìn)行無氧呼吸代謝,將NO3--N和NO2--N徹底還原為N2,在處理模擬海水養(yǎng)殖廢水的過程中起著重要作用[31].條帶 9、17屬于 γ-變形菌綱中所屬的海洋螺菌目,條帶42為厚壁菌門中所屬的芽孢桿菌目(Bacillales),在其它的泥樣樣品中均未檢出,這與厚壁菌門細(xì)菌對(duì)有機(jī)物分解力強(qiáng),在能量和物質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用且耐低溫高鹽密不可分[32-33],條帶47最相似菌種為 Iamiamajanohamensis(90%),屬于放線菌門微酸菌屬,該菌可以利用多種碳化合物作為碳源,參與氮元素的轉(zhuǎn)化,故這幾種菌可以利用水中的有機(jī)物分解為小分子,并利用這些小分子物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖,成為優(yōu)勢(shì)菌[34].條帶19(Nitrobacter winogradskyi)為硝化菌屬,條帶43(Nitrosospira multiformis)屬于亞硝化單胞菌,這兩種菌屬在活性污泥中是優(yōu)勢(shì)菌,但在馴化過程中逐漸淘汰,說明有些氨氧化菌對(duì)鹽度和溫度變化比較敏感,低溫或者高鹽影響了生物活性.但有些氨氧化菌也能夠適應(yīng)海水養(yǎng)殖廢水的水質(zhì)條件而生存下來成為優(yōu)勢(shì)菌種,其中條帶20、23和25在接種過程中保留下來,是氨氮氧化過程中起主要作用的菌屬.

為了對(duì)比不同條帶強(qiáng)度及遷移率,考察群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù),以下對(duì)污泥樣品的條帶圖譜進(jìn)行細(xì)菌群落相似性和多樣性分析.

菌群多樣性可以用香農(nóng)指數(shù)來分析,該指標(biāo)是將DGGE圖譜采用Quantity one軟件對(duì)每個(gè)樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化的一種形式.其算法如下所示:

式中:pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率,%;N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度, %;Ni為第i條帶的豐度,%[35].

普通活性污泥、海水底泥、HS-BAF和AS-BAF的反沖洗生物膜計(jì)算得到的多樣性指數(shù)結(jié)果分別為2.41、2.63、2.65、2.88,從這個(gè)結(jié)果可以看出,普通活性污泥樣品中生物并不豐富,經(jīng)過鹽度條件啟動(dòng) BAF,生物多樣性得到了大幅的提升,這也可能是接種活性污泥啟動(dòng)BAF時(shí)間較短的原因之一.對(duì)比海水底泥和HS-BAF泥樣,香農(nóng)指數(shù)相差不大,說明生物多樣性程度相似,菌種數(shù)量和種類在馴化過程中變化較小,原因是兩者的存在環(huán)境比較相似.經(jīng)過馴化之后的 HSBAF和AS-BAF的多樣性指數(shù)差異很小,說明在穩(wěn)定運(yùn)行后兩者微生物種群趨于一致.

表4 戴斯系數(shù)比較PCR-DGGE圖譜的相似性(%)Table 4 The similarity of comparative PCR-DGGE atlas using Deiss coefficient

由表中數(shù)據(jù)可以看出,活性污泥和 AS-BAF相似性只有18%,相對(duì)于海水底泥和HS-BAF的36.4%的相似性相差甚遠(yuǎn),表明鹽度條件對(duì)于活性污泥中的微生物生長(zhǎng)影響較大,很多優(yōu)勢(shì)菌種不能適應(yīng)高鹽環(huán)境而被逐漸淘汰.HS-BAF和AS-BAF菌群的相似性最高,達(dá)到64.5%,即隨著時(shí)間的延長(zhǎng),種群數(shù)量及豐富程度差異逐漸減弱,表現(xiàn)出很強(qiáng)的相似性,說明經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)行,2種接種方法對(duì)低溫條件下啟動(dòng)BAF的微生物種群影響不大.

3 結(jié)論

3.1 人工接種掛膜可以有效促進(jìn)低溫高鹽條件下BAF的啟動(dòng).

3.2 接種普通活性污泥比接種海水底泥更有利于BAF低溫啟動(dòng),且啟動(dòng)階段處理效果也較好. 3.3 穩(wěn)定運(yùn)行階段,2種接種方式BAF的處理效果無明顯差別,微生物優(yōu)勢(shì)種群基本一致,即接種普通活性污泥和海水底泥對(duì)低溫啟動(dòng)后的 BAF運(yùn)行效果無顯著影響.

3.4 分子生物學(xué)分析結(jié)果表明,接種普通活性污泥BAF的種群結(jié)構(gòu)變化較大,多樣性指數(shù)最高.隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),2種接種方式BAF種群數(shù)量及豐富程度差異逐漸減弱,優(yōu)勢(shì)種群趨于一致,表現(xiàn)出很強(qiáng)的相似性.

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Low temperature start-up characteristics and microbial population of BAFs for marine aquaculture wastewater treatment inoculated with two kinds of sludge.

LU Li-quan1, QIU Li-ping1*, LIU Pan-pan2, XIE Kang1, CHENG Hong-tao1, SHI Liang1, WANG Yan1(1.School of Civil Engineering and Architecture, University of Jinan, Jinan 250022, China；2.Qilu Institute of Technology, Jinan 250200, China). China Environmental Science, 2017,37(7)：2574～2582

In order to investigate the low temperature start-up characteristics of biological aerated filter (BAF) for simulated marine seawater aquaculture wastewater treatment, two zeolite media BAFs, which inoculated with marine sediment and activated sludge respectively, were operated under the conditions of hydraulic retention time 1h, water temperature 12～16℃, the ratio of gas to water 2 : 1 (dissolved oxygen in 3～5mg/L), as well as the influent pH value of 7.38～8.23, permanganate index of 5.11～9.46mg/L, ammonia nitrogen 3.27～4.88mg/L. The results showed that the start-up time, average concentration of effluent ammonia nitrogen, removal rate of average ammonia nitrogen, average concentration of effluent permanganate index and removal rate of permanganate index of BAF inoculated with marine sediment were 39d, 0.36mg/L, 91%, 4.96mg/L,31.9%, respectively, while the BAF inoculated with activated sludge were 35d, 0.17mg/L, 95.7%,4.63mg/L, 36.5%, respectively. It was observed by DGGE and 16SrDNA gene sequencing analysis that the microbial population structure of two reactors had gone through a tremendous change. The Shannon index of original activated sludge, the marine sediment and the corresponding backwashing sludge the reactor stable operation after one month was 2.41, 2.63, 2.88 and 2.65, respectively. With the increase of running time, the deference of quantity and abundance microbial population in two BAFs decreased gradually, and the dominant population became more and more similar and consistent. Several salt-tolerant ammonia-oxidizing bacteria became dominant species, and the mainly population in stable operated BAF belonged to γ-proteobacteria class.

zeolite biological filter；inoculation sludge；marine aquaculture wastewater；characteristics of start-up；microbial population

X703

A

1000-6923(2017)07-2574-09

盧立泉(1992-),男,山東濱州人,碩士研究生,主要從事廢水處理理論與工藝研究.發(fā)表論文2篇.

2016-11-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51278225, 51678276);山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016GSF117012, 2016CYJS07A03-3)

* 責(zé)任作者, 教授, lipingqiu@163.com