易 鳴 朱志強(qiáng) 曾 智

科研園地

水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚快速檢測方法初探

易 鳴 朱志強(qiáng) 曾 智

在標(biāo)準(zhǔn)《NY 5070-2002 無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中氯霉素和己烯雌酚因其對(duì)人體的危害已被列為不得檢出的藥物殘留項(xiàng)目。檢測氯霉素和己烯雌酚的方法主要有酶聯(lián)免疫法、氣相法、液質(zhì)聯(lián)用法，其中酶聯(lián)免疫法耗時(shí)最短且操作最簡單，也是筆者檢測工作的主要項(xiàng)目之一。結(jié)合筆者的實(shí)際工作，本文詳述了酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚含量的原理、方法和注意事項(xiàng)。

一、材料和方法

1.氯霉素和己烯雌酚

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，能對(duì)多種細(xì)菌微生物產(chǎn)生作用，常用于對(duì)水生動(dòng)物各種傳染病的治療，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題。因其會(huì)引起人類的再生障礙性貧血、新生兒灰嬰綜合癥等嚴(yán)重毒副作用，作為漁藥已禁用。己烯雌酚為人工合成的非甾體雌激素，對(duì)水生動(dòng)物有提高繁育率等作用。但人食用了殘留有己烯雌酚的水產(chǎn)品后會(huì)造成體內(nèi)激素失調(diào)，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，作為漁藥也已禁用。因此對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚的檢測對(duì)于食品安全有重要意義。

2.酶聯(lián)免疫法

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann，荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）。它的中心原理就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。

具體步驟是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，然后與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。但由于酶聯(lián)免疫法可能出現(xiàn)假陽性情況，故在本法檢出陽性后一般再用其它方法復(fù)驗(yàn)。

3.酶聯(lián)免疫試劑盒

試劑盒中提供的檢測材料有：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、酶結(jié)合物、抗體、底物溶液、終止液和洗滌液、提取液等試劑。

（1）氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒

筆者在實(shí)際工作中使用氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測時(shí)采用間接競爭一步法。在酶標(biāo)板中同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)品（或樣本）、酶標(biāo)二抗及氯霉素抗體，酶標(biāo)板上包被的抗原與加入的標(biāo)準(zhǔn)品（或樣本）中的抗原競爭結(jié)合加入的氯霉素抗體，同時(shí)酶標(biāo)二抗與氯霉素抗體結(jié)合。用TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物中氯霉素濃度呈負(fù)相關(guān)，與校準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中氯霉素的含量。

（2）己烯雌酚酶聯(lián)免疫試劑盒

筆者在實(shí)際工作中所用的己烯雌酚酶聯(lián)免疫試劑盒基于競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理。含有己烯雌酚的抗原已經(jīng)包被于微孔板上。檢測時(shí)，樣品同特異性一抗共同被添加到板孔中，如果樣品中含有己烯雌酚，會(huì)競爭一抗，抑制抗體與板上包被的藥物抗原結(jié)合。加入酶標(biāo)記的二抗，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入底物后，產(chǎn)物的顏色深淺與樣品中己烯雌酚的濃度成反比。

二、樣品前處理

由于上酶標(biāo)板檢測必須采用液體樣本，所以必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理，提取出其中的氯霉素和己烯雌酚。因兩種藥殘的樣品前處理步驟大同小異，以下以氯霉素的前處理為主，合并敘述。以筆者在工作中采用的試劑盒為例，所有的提取液、洗滌液等均需預(yù)先配成1倍濃度。

（1）稱取3.0±0.05g（己烯雌酚稱取2.0g）組織樣本于50mL離心管中；

（2）加入6mL乙酸乙酯（己烯雌酚加6mL乙腈和2mL組織提取液）；

（3）渦漩3-5分鐘；

（4）4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取4mL有機(jī)相（己烯雌酚取3mL有機(jī)相至另一試管中加入150mg組織清洗劑，渦漩30秒，室溫靜置5分鐘，再次4000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取2.4mL上清液），于60℃下氮?dú)獯蹈桑?/p>

（5）殘留物加入1mL正己烷和1mL樣本稀釋液（己烯雌酚加入400μL1倍PBS-甲醇（3∶2，v/v），渦漩混勻1分鐘；

（6）取50μL下層液體（己烯雌酚為均相液體）進(jìn)行檢測。

三、操作步驟與要點(diǎn)

此為定性定量的關(guān)鍵步驟，但由于兩種試劑盒的操作步驟不盡相同，以下分別敘述。

1.氯霉素試劑盒操作步驟

①加樣：每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50μL，加入酶結(jié)合物50μL和抗體50μL，輕輕震蕩混勻，25℃靜置溫育30分鐘。

②洗板：取出微孔板，甩干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板4次，250μL/孔，浸泡30秒，在吸水紙上拍干。

③顯色：每孔加入底物溶液100μL，震蕩后25℃避光顯色15分鐘。

④依序每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

⑤在加終止液后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光度（OD）值。

2.己烯雌酚試劑盒操作步驟

①每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50μL和一抗100μL輕輕震蕩混勻，25℃靜置反應(yīng)30分鐘。

②洗板，同氯霉素試劑盒操作步驟（2）。

③每孔加入150μL二抗，25℃避光顯色30分鐘。

④洗板，同步驟（2）。

⑤加入100μLTMD底物并混勻，25℃避光靜置反應(yīng)10-15分鐘。

⑥每孔加終止液100μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

⑦穩(wěn)定2分鐘后，在450nm波長下測定OD值。

3.操作要點(diǎn)

由于同屬酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作有共同之處?，F(xiàn)將操作要點(diǎn)一并敘述如下：

（1）為保證抗體活性，試劑盒應(yīng)保存在2-8℃下，使用前將盒內(nèi)試劑移至室溫25℃平衡至少30分鐘。整個(gè)酶標(biāo)板操作過程都應(yīng)保證溫度在25℃左右。按量取用微孔條，不用的放回鋁箔袋，2-8℃保存。

（2）加樣：加樣使用一次性槍頭，避免交叉污染。加樣時(shí)應(yīng)輕緩，避免起泡，直接加于酶標(biāo)板底部，勿沿孔壁加樣。一次加樣時(shí)間最好控制在10分鐘內(nèi)，如樣品數(shù)量多，在可能時(shí)推薦使用排槍加樣。

（3）溫育：為防止樣品蒸發(fā)或污染，溫育過程中推薦覆上板貼。溫育過程中應(yīng)保持溫度恒定，室溫達(dá)不到25℃時(shí)推薦使用空調(diào)，可在已恒溫的小盒子內(nèi)溫育。

圖1 Mk3型酶標(biāo)儀給出的數(shù)據(jù)

（4）洗板：洗板過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。ELISA分析中的重現(xiàn)性很大程度上取決于洗板的一致性。手工洗板法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪幾層吸水紙，酶標(biāo)板向上用力拍幾次；浸泡時(shí)間不可太短，以30秒為宜；重復(fù)次數(shù)以4次為宜。自動(dòng)洗板法：如有自動(dòng)洗板機(jī)，就在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)中去。

（5）顯色：為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物顯色反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。可在加入底物溶液后每隔一段時(shí)間（如每隔10分鐘）觀察顯色情況以控制反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品前1-4孔有明顯梯度藍(lán)色，后5-6孔顯色不明顯時(shí)，即可加入終止液終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立刻變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應(yīng)與底物溶液加入順序相同。

（6）底物溶液應(yīng)為淺藍(lán)色或無色，如果顏色嚴(yán)重變深則應(yīng)棄用。底物溶液易受污染，應(yīng)避光保存。

（7）試劑盒的最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光值和靈敏度發(fā)生變化。

四、數(shù)據(jù)處理

以氯霉素的數(shù)據(jù)處理為例說明酶聯(lián)免疫法的數(shù)據(jù)處理。

筆者使用的是熱電Mk3型酶標(biāo)儀。給出的數(shù)據(jù)如圖1：其中A1、B1、C1、D1、E1、F1格為標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值，G1-H3為樣品OD值。

圖2 在計(jì)算軟件上輸入的測定值

圖3 由OD值計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖形

筆者在實(shí)際工作中使用RIDARSOFT Win (Art.No.Z9999軟件)計(jì)算，輸入界面如圖2，其中上半部分為指定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值。

計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

計(jì)算出的結(jié)果如圖4，樣品的稀釋倍數(shù)為0.5。

圖4 計(jì)算結(jié)果

五、結(jié)果分析

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析：OD值有明顯的梯度，圖形呈曲線，判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線合格。軟件自動(dòng)分析18號(hào)樣品OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍；對(duì)樣品值進(jìn)行分析：1號(hào)樣品和18號(hào)樣品OD值接近或超過標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)最低濃度，判斷為樣品氯霉素含量極低，屬正?，F(xiàn)象。

六、結(jié)論

水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚的檢測對(duì)現(xiàn)時(shí)的食品安全有重要意義，酶聯(lián)免疫法作為一種快速檢測方法在實(shí)際應(yīng)用中更有潛力。因相對(duì)其它檢測方法操作簡單、快速而節(jié)省了實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間、人力，提高了檢測效率。通常農(nóng)業(yè)部一次例行監(jiān)測約50個(gè)樣品用酶聯(lián)免疫法檢測氯霉素只需要1-2天即可給出結(jié)果，但如何避免假陽性，還需進(jìn)一步研究。

（通聯(lián)：430077，湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所）