易傳輝 趙健 胡劭驥 和菊 馮志偉 楊建華 陳鵬

(云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明，650201) (西南林業(yè)大學(xué)) (云南大學(xué)) (云南省林業(yè)科學(xué)院)

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中國尾鳳蝶屬昆蟲(鱗翅目：鳳蝶科)系統(tǒng)發(fā)育1)

易傳輝 趙健 胡劭驥 和菊 馮志偉 楊建華 陳鵬

(云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明，650201) (西南林業(yè)大學(xué)) (云南大學(xué)) (云南省林業(yè)科學(xué)院)

為探討中國尾鳳蝶屬(Bhutanitis)昆蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，采用線粒體DNACOI和ND1分子標(biāo)記，對基因序列進行了分析，基于分子特征，采用NJ和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對3種尾鳳蝶658 bp的COI基因序列的分析表明，三尾鳳蝶(Bh.thaidina)、二尾鳳蝶(Bh.mansfieldi)和多尾鳳蝶(Bh.lidderdalii)T、C、A、G 4種核苷酸的平均含量分別為41.5%、40.0%、41.9%，15.2%、15.8%、14.3%，29.3%、30.7%、29.8%，14.0%、13.5%、14.0%；共發(fā)現(xiàn)突變位點131個，約占全長的19.91%，簡約信息位點56個，約占全長的8.51%。對480 bp的NDI基因序列的分析表明，三尾鳳蝶、二尾鳳蝶和多尾鳳蝶的NDI基因序列T、C、A、G的平均含量依次為34.4%、33.3%、32.1%，11.3%、11.9%、12.1%，45.6%、46.7%、47.1%，8.7%、8.1%、8.8%；共有63個變異位點，占全長的13.13%，簡約信息位點39個，約占全長的8.13%。二者均表現(xiàn)為明顯的A+T堿基偏向。中國分布尾鳳蝶昆蟲遺傳多樣性較低，種間遺傳距離較小，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，二尾鳳蝶最早從祖先種群中分化，其次是多尾鳳蝶，最后是三尾鳳蝶；多尾鳳蝶與其他二種親緣關(guān)系均較近。

尾鳳蝶；線粒體DNACOI基因；線粒體DNAND1基因；系統(tǒng)發(fā)育；遺傳多樣性

Bhutanitis; MitochondrialCOIgene; MitochondrialND1 gene; Phylogeny; Genetic diversity

尾鳳蝶屬(Bhutanitis)屬鱗翅目(Lepidoptera)鳳蝶科(Papilionidae)鋸鳳蝶亞科(Zerynthiinae)昆蟲，為典型高山種類。分布于中國、印度、不丹、錫金、緬甸、泰國、越南等地，中國主要分布于云南、四川、陜西、甘肅和西藏等省(區(qū))。目前，對該屬物種存在爭議，以周堯等[1]185-188,[2]8為代表的中國科學(xué)家認(rèn)為該屬有 7 種 2 亞種，即不丹尾鳳蝶(Bh.ludlowi)、多尾鳳蝶(Bh.lidderdalii)、三尾鳳蝶(Bh.thaidina)(包括指名亞種(Bh.thaidinathaidina)和東川亞種(Bh.thaidinadongchuanensis)、玉龍尾鳳蝶(Bh.Yulongensis)、玄裳尾鳳蝶(Bh.nigrilima)、二尾鳳蝶(Bh.mansfieldi)和麗斑尾鳳蝶(Bh.pulchristriata)。以Hauser et al.[3]為代表的學(xué)者認(rèn)為，尾鳳蝶屬應(yīng)分為 4種，即不丹尾鳳蝶、多尾鳳蝶、三尾鳳蝶和二尾鳳蝶。除不丹尾鳳蝶外，其余各種(亞種)均在中國有分布。目前該屬昆蟲已為瀕危物種，為《瀕危動植物進出口貿(mào)易公約》(CITES)限制貿(mào)易物種，同時被 IUGN 瀕危物種紅皮書和中國野生動物法列為Ⅱ級保護物種[1]185,[2]8,[3-4]。由于DNA的獨特性，目前已成為物種區(qū)分的重要手段，線粒體基因因其不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，無重復(fù)序列，很少發(fā)生不等交換，在遺傳過程中不易發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變，已廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育分析等研究[5-10]。諸立新等[11]利用COI基因部分序列對尾鳳蝶屬4種蝴蝶分子系統(tǒng)關(guān)系進行了探討，結(jié)果表明，二尾種組與多尾鳳蝶親緣關(guān)系較近，而三尾鳳蝶較早分化出來，并認(rèn)為二尾和麗斑尾鳳蝶可能為同一物種。筆者基于COI基因和ND1基因標(biāo)記，采用MEGA5.0和Mrbayes 3.1.2軟件，構(gòu)建NJ樹與貝葉斯樹，對中國分布的尾鳳蝶屬3個物種系統(tǒng)發(fā)育進行分析，為深入研究該屬昆蟲的分子進化和保護提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

尾鳳蝶屬昆蟲分別采自云南、四川和陜西3省，共49頭；中華虎鳳蝶(Luehdorfiachinensis)2頭，來自浙江天目山。樣本采集后，立即將一側(cè)的中后足取下，放入無水乙醇的離心管中，并標(biāo)記，野外采集回來后，置于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆?，?biāo)本信息見表1。

1.2 基因提取

將昆蟲足移入1.5 mL的離心管中，加入1 mL STE緩沖液，在干式恒溫器中37 ℃加熱1 h，去除離心管中的緩沖液，重新加入200 μL STE緩沖液；用小剪刀將足剪碎，加入4 mL蛋白酶K；干式恒溫器中37 ℃處理5 min，95 ℃加熱15 min，每隔5 min震蕩一次，待標(biāo)本溫度回到室溫后4 000 r·min-1離心，冰箱中-40 ℃保存待用。

表1 尾鳳蝶屬昆蟲標(biāo)本采集信息

1.3 PCR反應(yīng)與測序

擴增參照文獻[12-15]的方法。COI引物序列:(Jerry)COI-F,5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′;(K698)CO1-F,5′-TACAATTT ATCGCCTAAACTTC AGCC-3′;(Pat2)COI-R,5′-TCCATTACATATAATCTGCCATATT-3′;(Djernaes)CO1-R,5′-GC TATTATAGCATA AATTATTCC-3′。NDI引物序列：NDI-F，5′-ATCAAAAGGAGCTCGATTAGTTTC-3′；NDI-R，5′-CGTAAAGTCCTAGGTTAT AT TCAGATTCG-3′。反應(yīng)體系為25.00 μL，模板DNA1.00 μL，上下游引物各0.50 μL，ExTaqDNA聚合酶0.25 μL，dNTP Mix 和25.00 mmol MgCl2各2.00 μL，10×Loading Buffer 2.50 μL，加滅菌ddH2O 16.25 μL。擴增條件，預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，終延伸72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物2.4 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測(電壓150 V，電泳緩沖液為0.5×TBE)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。確定成功擴增出目標(biāo)片斷后，送上海賽音生物技術(shù)有限公司完成雙向測序工作。COI與NDI使用的反應(yīng)體系一致。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從NCBI網(wǎng)站中通過BLAST同源檢索確認(rèn)所測標(biāo)本的COI和NDI基因序列，并從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載目標(biāo)序列，用于系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析。校對后的測序結(jié)果通過BioEdit 7.0.9軟件中的Clustal W功能進行逆向互補校對，并對序列進行手工矯正和剪切；利用MEGA 5.0對整理好的序列進行概念翻譯，基于Kimura-2參數(shù)對序列特征、群體間遺傳距離(P-distance)和遺傳差異(Fst)進行分析[12-14]。應(yīng)用DnaSP5.0軟件分析計算三尾鳳蝶各地理種群間單倍型多樣性(Hd)、核苷酸平均差異數(shù)(k)和核苷酸多樣性(Pi)[16]。

采用2種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17-18]，以中華虎鳳蝶為外群，利用MEGA5.0軟件基于Kimura-2-Parameter模型，用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。用MrBayes 3.1.2軟件建立BI系統(tǒng)發(fā)育樹。最后利用軟件SequenceMatrix-Windows-1.7.8對序列COI和NDI進行整合，并利用整合后的序列構(gòu)建NJ樹和BI樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾鳳蝶屬COI基因的特征與差異

三尾鳳蝶各地理種群的兩段COI部分序列，長分別為658、775 bp，二尾鳳蝶和多尾鳳蝶得到658 bp長度序列。對3種尾鳳蝶658 bp序列進行分析表明，三尾鳳蝶、二尾鳳蝶和多尾鳳蝶T、C、A、G核苷酸的平均含量依次為41.5%、15.2%、29.3%，14.0%、40.0%、15.8%，30.7%、13.5%、41.9%，14.3%、29.8%、14.0%。同源性比較顯示，3種尾鳳蝶中，共發(fā)現(xiàn)突變位點131個，約占全長的19.91%，簡約信息位點56個，約占全長的8.51%；核苷酸有26個位點發(fā)生轉(zhuǎn)換，占總替換數(shù)的68.42%，12個位點發(fā)生顛換，占31.58%，其中C與T之間的轉(zhuǎn)換占總轉(zhuǎn)換數(shù)的40.54%，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率R值為2.706。尾鳳蝶屬種群間基于COI核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.369 30，平均核苷酸差異數(shù)(Kxy)為243.000。

采用MEGA5.0軟件，基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型計算尾鳳蝶和虎鳳蝶各種群間的遺傳距離。結(jié)果表明，尾鳳蝶屬種間的遺傳距離(0.066～0.078)較小，與外群中華虎鳳蝶之間的遺傳距離(0.149～0.155)較大(表2)。

表2 尾鳳蝶屬各種間的遺傳距離

2.2 尾鳳蝶屬NDI基因的特征與差異

通過整理去除測序結(jié)果兩端側(cè)翼序列，得線粒體NDI部分序列，長度為480 bp。三尾鳳蝶、二尾鳳蝶和多尾鳳蝶該序列的T、C、A、G 4種核苷酸的平均含量依次為34.4%、11.3%、45.6%，8.7%、33.3%、11.9%，46.7%、8.1%、32.1%，12.1%、47.1%、8.8%。同源性比較顯示，3種尾鳳蝶中，共有63個變異位點，占全長的13.13%，保守位點417個，簡約信息位點39個，約占全長的8.13%，自裔位點24個，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失或插入。在所有核苷酸替換中，有14個位點發(fā)生轉(zhuǎn)換，占總替換數(shù)的41.2%，發(fā)生顛換有20個位點，占58.8%，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率R值為28.739。尾鳳蝶屬種群間基于NDI核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.072 57，平均核苷酸差異數(shù)(Kxy)為34.833。

采用MEGA5.0軟件，基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型計算尾鳳蝶和虎鳳蝶各種群間的遺傳距離。結(jié)果表明，尾鳳蝶屬種間遺傳距離(0.085～0.103)略小于外群中華虎鳳蝶種間遺傳距離(0.138～0.152)(表2)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

2.3.1 基于COI部分序列的分析

以線粒體COI基因部分序列為分子標(biāo)記，以中華虎鳳蝶為外群，采用MEGA5.0構(gòu)建NJ樹，采用Mrbayes 3.1.2構(gòu)建貝葉斯樹，對尾鳳蝶屬進行系統(tǒng)發(fā)育分析。2種方法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹極為相似，形成4個明顯的分支，并具有較高的自展值。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，中華虎鳳蝶與尾鳳蝶屬蝴蝶完全區(qū)分開，尾鳳蝶屬蝴蝶明顯分為2個聚類簇，各個地理種群的三尾鳳蝶個體首先聚在一起，隨后與多尾鳳蝶合成一個分支，二尾鳳蝶的個體聚在一起形成另外一個分支。

分支下的數(shù)字是基于貝葉斯分析的后驗率。

2.3.2 基于NDI部分序列的分析

基于所測尾鳳蝶屬線粒體NDI序列部分片段構(gòu)建NJ樹和貝葉斯樹。2種方法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹極為相似，明顯形成4個分支，并具有較高的自展值。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，中華虎鳳蝶與尾鳳蝶屬蝴蝶明顯分開，尾鳳蝶屬蝴蝶分為2個聚類簇，三尾鳳蝶各地理種群首先聚在一起，然后和多尾鳳蝶形成一個分支，二尾鳳蝶的個體聚在一起形成另外一個分支，與基于COI序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。

各分支上的數(shù)字為1 000次Bootstrap支持率；DQ為NCBI中檢索到的尾鳳蝶屬COI序列片段。

圖2 基于線粒體COI基因片段構(gòu)建的NJ樹

分支下數(shù)字是基于貝葉斯分析的后驗率。

各分支上的數(shù)字為1 000次Bootstrap支持率。

分支下面的數(shù)字是基于貝葉斯分析的后驗率。

圖5 基于線粒體COI和NDI基因整合序列片段構(gòu)建的貝葉斯樹

2.3.3 拼接COI與NDI序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用SequenceMatrix-Windows-1.7.8軟件對各個樣本的COI與NDI序列進行拼接，拼接后新序列總長度1 913 bp，構(gòu)建貝葉斯樹和NJ樹。所得結(jié)論與COI和NDI序列分別單獨構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹幾乎一致。

各分支上的數(shù)字為1 000次Bootstrap的支持率。

圖6 基于線粒體COI和NDI基因整合序列片段構(gòu)建的NJ樹

3 結(jié)論與討論

本研究利用線粒體COI和NDI基因序列，對中國分布的3種尾鳳蝶屬昆蟲系統(tǒng)發(fā)育進行了研究，結(jié)果表明：(1)中國尾鳳蝶屬昆蟲遺傳多樣性低，尾鳳蝶屬種群間基于COI核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.369 30，基于NDI核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.072 57，與諸立新等[12]的研究結(jié)論一致，表明該屬昆蟲適應(yīng)性和生存能力較差，進化潛力弱。(2)二尾鳳蝶最早從祖先種群中分化，其次是多尾鳳蝶，最后是三尾鳳蝶；二尾鳳蝶與多尾鳳蝶的親緣關(guān)系相對較近，與三尾鳳蝶的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果與前人的研

究有一定差異，主要表現(xiàn)在多尾鳳蝶在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置，諸立新等的研究結(jié)果顯示，多尾鳳蝶最早從祖先中分化出來，其次是二尾鳳蝶，最后是三尾鳳蝶[12]。差異可能與研究標(biāo)本數(shù)量、采集存放時間和保存方法有關(guān)。存放時間越長，對研究產(chǎn)生的影響越大。本研究利用線粒體COI和NDI基因序列進行分析得到的結(jié)果一致，可靠性較高，但由于部分種類個體數(shù)量較少，可能對研究結(jié)果有一定影響，有待今后補充并深入分析。

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1)國家自然科學(xué)基金項目(31260527)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才項目(2013HB093)。

易傳輝，男，1970年8月生，云南省林業(yè)科學(xué)院，副研究員。E-mail:ynkcx2007@163.com。

2016年9月16日。

Q963;Q969.438.2

責(zé)任編輯：程 紅。

Phylogenetic Analysis ofBhutanitis(Lepidoptera: Papiliondae) Distribution in China//Yi Chuanhui(Yunnan Academy of Forestry, Yunnan 650201, P. R. China); Zhao Jian(Southwest Forestry University); Hu Shaoji(Yunnan University); He Ju, Feng Zhiwei, Yang Jianhua, Chen Peng(Yunnan Academy of Forestry)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：77-81.

The phylogenetic relationships among threeBhutanitisspecies distribution in China areas were analyzed based on 658 bp sequences of COI and 480 bp ND1 gene. With COI gene sequences, the average T contents ofB.thaidina,B.mansfieldiandB.lidderdaliiof were 41.5%, 40.0%, 41.9%, C were 15.2%, 15.8%, 14.3%, A were 29.3%, 30.7%,29.8%, and G were 14.0%,13.5%, 14.0%, respectively. There were 131 variable sites, in which 56 were parsimony information sites, accounting for 19.91% and 8.51% of the total length, respectively. With the ND1gene sequences, T were 34.4%, 33.3%, 32.1%, C were 11.3%, 11.9%, 12.1%, A were 45.6%, 46.7%, 47.1%, and G were 8.7%, 8.1%, 8.8%. There were 63 variable sites, in which 39 were parsimony information sites, accounting for 13.13% and 8.13% of the total length, respectively.Bhutanitisexhibited a high A+T bias. A low level of genetic diversity in the total population ofBhutanitis, and their average genetic distance was small. From the phylogenetic trees NJ and BI,B.mansfieldiwas differentiated earlier than other species followed byB.lidderdalii.B.lidderdaliishowed the highest affinity withB.thaidinaandB.mansfieldi.