高 華,毛潔萍,羅 琴,楊新玲

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830000;2烏魯木齊市友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院綜合內(nèi)科;4新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

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脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞移植對(duì)帕金森病大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的影響

高 華1,毛潔萍2,羅 琴3,楊新玲4*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830000;2烏魯木齊市友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院綜合內(nèi)科;4新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

目的 探討脂肪源來源的神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞移植對(duì)帕金森病(Parkinson,s disease,PD)大鼠模型腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的影響。 方法 獲取SD大鼠脂肪干細(xì)胞,利用神經(jīng)營養(yǎng)因子將其誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞。用6羥基多巴胺(6-OHDA)大鼠紋狀體內(nèi)兩點(diǎn)毀損法制作PD模型(旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>7 r/min),將成功大鼠模型隨機(jī)分為模型組和神經(jīng)干細(xì)胞移植組,每組15只,另選15只正常大鼠為對(duì)照組。紋狀體區(qū)立體定位細(xì)胞移植后8周,進(jìn)行模型組和細(xì)胞移植組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的行為學(xué)檢測(cè)?；瘜W(xué)比色法分別檢測(cè)PD模型組、神經(jīng)干細(xì)胞移植組、正常對(duì)照組大鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性以及丙二醛(MDA)含量。免疫組化法計(jì)數(shù)大鼠腦內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)數(shù)量。 結(jié)果 細(xì)胞移植后8周,細(xì)胞移植組40 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(19±4)較PD模型組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(38±3)減少,大鼠腦內(nèi)SOD、GSH、GSH-Px活性提高,MDA含量減少。TH計(jì)數(shù)表明,細(xì)胞移植組(22.40±3.89)、模型組(13.50±1.08)及正常對(duì)照組(43.20±3.32)三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 脂肪來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病模型大鼠可改善其行為活動(dòng),其機(jī)制可能與減輕大鼠腦內(nèi)6-OHDA所致的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

脂肪干細(xì)胞； 神經(jīng)干細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 帕金森病； 細(xì)胞移植

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少及姿勢(shì)步態(tài)異常等為主要臨床表現(xiàn)的慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其病理特征主要為中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元大量喪失及膠質(zhì)細(xì)胞增生。既往研究認(rèn)為氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)功能障礙、炎性反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性和凋亡等都參與 PD 的發(fā)病過程[1]。某些基礎(chǔ)及臨床研究表明,帕金森病患者的機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。氧化應(yīng)激作為帕金森病的發(fā)病機(jī)制之一,也被認(rèn)為是致黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元凋亡的可能因素之一[3]。干細(xì)胞以其多功能性,成為目前細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的熱點(diǎn)之一,如何選擇合適正確的干細(xì)胞來源也成為討論的重點(diǎn)。脂肪干細(xì)胞以易獲得性、多分化性的特點(diǎn)日益受到關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)通過從SD大鼠脂肪中獲取脂肪干細(xì)胞(adipose stem cell),經(jīng)過體外培養(yǎng),采用神經(jīng)生長因子進(jìn)一步將其誘導(dǎo)成為神經(jīng)干細(xì)胞,將其移植治療PD大鼠模型,觀察大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)氧化應(yīng)激的各指標(biāo)的變化,探討其保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司)；Ⅰ型膠原酶(Worthington美國)；胰酶(Sigma)；低糖DMEM、 DMEM/F12培養(yǎng)基、B27(Gibco美國)；胎牛血清(杭州四季青)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF),表皮生長因子(EGF) (Peprotech美國)；6羥基多巴胺(6-OHDA)，阿撲嗎啡(APO)(Sigma美國)；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒，谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒，丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠,(110±10)g,新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理審核,倫審編號(hào):A-20141008019,實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。參照文獻(xiàn)[4]的大鼠腦立體定位圖譜,依據(jù)文獻(xiàn)[5]在右側(cè)黑質(zhì)區(qū)和腹側(cè)被蓋區(qū)注射,采用兩點(diǎn)單側(cè)6-OHDA注射法制備 PD模型,造模1周后以腹腔注射APO(0.5 mg/kg),持續(xù)觀察40 min,以恒定向左側(cè)旋轉(zhuǎn)并平均轉(zhuǎn)速大于7 r/min視為成功PD模型。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組和神經(jīng)干細(xì)胞移植組,每組15只。另選15只正常大鼠為對(duì)照組。

1.3 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)、神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)及細(xì)胞的移植

依據(jù)既往實(shí)驗(yàn)方法[6],腹腔注射氯胺酮(0.75 ml/100 g)麻醉SD大鼠,無菌取其腹股溝處脂肪,進(jìn)行體外培養(yǎng)、純化脂肪干細(xì)胞,傳至第3代將其置于DMEM/F12+2% B27+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞,以Nestin表達(dá)陽性為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。將誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞在腦立體定位下給予大鼠右側(cè)紋狀體兩點(diǎn)移植:前囟后(0.2±0.1)mm,矢狀縫右側(cè)(2.5±0.1)mm,硬膜下(5.0±0.1)mm;前囟后(1.0±0.1)mm,矢狀縫右側(cè)(3.0±0.1)mm,硬膜下(5.5±0.1)mm。

1.4 細(xì)胞移植后各組大鼠的行為學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞移植后8周,在APO誘導(dǎo)下,分別檢測(cè)脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植組和單純模型組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的變化。

1.5 檢測(cè)腦組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)

大鼠的行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,將三組大鼠處死獲取其紋狀體區(qū)腦組織0.2 g低溫狀態(tài)下研磨并進(jìn)行勻漿,將勻漿液以4 000 r/min,離心15 min,取其上清液用比色法測(cè)量MDA、SOD、GSH和GSH-Px。操作方法按照按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進(jìn)行測(cè)試。

1.6 免疫組化染色計(jì)數(shù)TH

大鼠安樂死后取腦,4%多聚甲醛固定,脫水、包埋,常規(guī)行石蠟切片,片厚6 μm,取紋狀體部分腦片行TH免疫組織化學(xué)染色。應(yīng)用DAB試劑盒顯色。每組各取2只大鼠,每只取5張紋狀體區(qū)片,每張片取2個(gè)不同視野,計(jì)數(shù)TH陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按完全隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)的要求收集整理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理,兩樣本均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),如方差齊采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差不齊采用t′檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,方差不齊采用近似F檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞移植后8周,經(jīng)APO誘導(dǎo)后,脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植組與模型組比較,大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著減少[(19±4)r/minvs(38±3)r/min],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),行為學(xué)得到有效改善。

2.2 各組大鼠紋狀體SOD、GSH、GSH-Px和MDA含量

細(xì)胞移植后8周,細(xì)胞移植組與正常組及模型組比較,腦內(nèi)MDA含量有所下降,SOD、GSH和GSH-Px活性有所上升,但未能達(dá)到正常,三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

組別SOD(nU/ml)GSH(mg/g)GSH-Px(nU/g)MDA(nmol/mg)模型組99.17±4.235.22±0.441.96±0.147.27±0.30細(xì)胞移植組113.72±11.556.16±0.302.87±0.204.85±0.74正常對(duì)照組203.13±16.178.05±0.373.80±0.223.77±0.33 F345.34235.70348.84190.97 P0.000.000.000.00

2.3 各組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH計(jì)數(shù)

細(xì)胞移植后8周,脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH表達(dá)的數(shù)量較模型組有所增加,但少于正常對(duì)照組,三組間TH數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2,圖1)。

組別TH計(jì)數(shù)FP模型組13.50±1.08254.470.00細(xì)胞移植組22.40±3.89正常對(duì)照組43.20±3.32

圖1 大鼠黑質(zhì)區(qū)TH免疫組化染色 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining of TH in substantia nigra (×400)

3 討論

PD病理主要為黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元缺失,目前研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)也參與導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞死亡過程[7,8]。正常情況下,黑質(zhì)部位存在氧化和抗氧化之間的平衡,如SOD、GSH 的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)發(fā)生異常,增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng),自由基生成過多,造成蛋白質(zhì)及脂質(zhì)過氧化損害,介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡[9，10]。許繼平等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)帕金森病患者中抗氧化酶活性降低,過氧化脂質(zhì)代謝增強(qiáng)。任金鵬等[12]在采用百草枯建帕金森病模型,小鼠腦內(nèi)其超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、過氧化物酶活性降低及丙二醛水平升高。證實(shí)氧化應(yīng)激、自由基損傷在帕金森病發(fā)生中起到不可小覷的作用[13,14]。

SOD是一種自由基的清除劑。GSH-Px可特異催化還原型谷胱甘肽GSH對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng),起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。MDA可以反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度,間接反應(yīng)細(xì)胞損傷程度。

細(xì)胞移植治療作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的一種可行性方式,具有廣泛前景,脂肪干細(xì)胞來源豐富,獲取簡單備受關(guān)注并且具有多種分化潛能[15，16]。本實(shí)驗(yàn)采用獲取脂肪干細(xì)胞,在利用神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)成為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森模型鼠,這在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)實(shí)施并成功[17]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PD模型組中SOD、GSH-Px、GSH的含量下降,MDA含量則升高明顯。提示帕金森病大鼠腦內(nèi)的氧化反應(yīng)被激活,多巴胺能神經(jīng)元抗氧化應(yīng)激損傷的水平下降,機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng),處于一種氧化應(yīng)激狀態(tài)。這從一定程度上反映模型符合帕金森病氧化應(yīng)激的發(fā)病機(jī)制,這也與陸明佳等[18，19]的研究結(jié)果一樣。在細(xì)胞移植后8周,脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植的PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為有明顯改善,這也與既往研究結(jié)果一致[17]。細(xì)胞移植后8周脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植組的MDA的含量較單純PD模型組的有所下降,但不能達(dá)到正常水平。而相應(yīng)狀態(tài)下移植組大鼠腦內(nèi)SOD、GSH-Px、GSH含量較模型組略有增加。大鼠黑質(zhì)區(qū)TH計(jì)數(shù)結(jié)果說明,在經(jīng)過細(xì)胞移植后可以提高TH數(shù)量,這也與其在APO誘導(dǎo)下旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少的行為學(xué)結(jié)果相一致,但不能促使其恢復(fù)正常功能狀態(tài)。提示脂肪源性的神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞移植治療后可以提高機(jī)體的抗氧化能力和清除自由基損傷的能力,從而可能在一定程度上保護(hù)了多巴胺能神經(jīng)元[20，21],但其與帕金森病的其他發(fā)病機(jī)制,如線粒體功能異常、炎癥、細(xì)胞毒性間的相互關(guān)聯(lián)性仍然不清楚,需要進(jìn)一步做有關(guān)相關(guān)通路的深入研究和探討。

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Effects of adipose-derived neural stem cell transplantation on oxidative stress reaction in rats with Parkinsons disease

GAO Hua1,MAO Jieping2,LUO Qin3,YANG Xinling4*

(1DepartmentofNeurology,FifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofNeurology,UrumqiFriendshipHospital;3DepartmentofGeneralMedicine,AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity;4SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:poplar862@sohu.com)

ObjectiveTo explore the effects of adipose-derived neural stem cell transplantation on oxidative stress reaction in rats with Parkinson’s disease (PD).MethodsThe adipose stem cells from SD rat fat tissues were isolated and induced to develop the neural stem cell with neurotrophic factors.Meanwhile,the PD model was established through brain stereotoxic injection of 6-OHDA(7 r/min).The PD model rats were randomly divided into two groups:model group(n=15) and neural stem cell transplantation group(n=15).Fifteen normal SD rats were chosen as normal group.The behavior(number of rotation) was observed in model group and cell transplantation group at 8 week.Moreover,the contents of superoxidedismutase(SOD) and glutathione(GSH),the activity of glutathione peroxidase(GSH·Px) and malondialdehyde(MDA) in rat brain nigrostriatum were detected by chemical colorimetry.The number of TH in striatum was detected by immunohistochemical staining.ResultsAt 8 week,the rotation in 40 min was lower in neural stem cell transplantation group than in model group (19±4vs38±3,P<0.05).The contents of SOD,GSH,GSH-PX were increased compared with PD model group and normal group,while the content of MDA was decreased significantly.The quantity of TH were 22.40±3.89 in cell transplantation group,13.50±1.08 in model group,and 43.20±3.32 in normal group,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe adipose-derived neural stem cell transplantation can improve the behavior of PD rats,which may be related to the decrease of the injury of oxidative stress.

adipose stem cell; neural stem cell; oxidative stress; Parkinson’s disease; cell transplantation

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆基金資助項(xiàng)目(201501160)

高華,女,1979-08生,在讀博士,主治醫(yī)師,E-mail:gaohuasnow@163.com

2016-12-19

R742

A

1007-6611(2017)04-0333-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.007