高春蕾,孫 萍,賈智慧,姜美潔,2,3,趙翠瓊,張學雷,2,3，吳振興，梁成珠

1 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061 2 青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室, 青島 266061 3 國家海洋局海洋環(huán)境與科學重點實驗室, 青島 266061 4 中國海洋大學, 青島 266003 5 國家海洋局東海預報中心, 上海 200081 6 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，青島 266002

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溫度和營養(yǎng)鹽限制對網(wǎng)狀原角藻生長與產(chǎn)毒的影響

高春蕾1,2,3,*,孫 萍1,2,3,4,賈智慧1,姜美潔1,2,3,趙翠瓊5,張學雷1,2,3，吳振興6，梁成珠6

1 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061 2 青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室, 青島 266061 3 國家海洋局海洋環(huán)境與科學重點實驗室, 青島 266061 4 中國海洋大學, 青島 266003 5 國家海洋局東海預報中心, 上海 200081 6 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，青島 266002

網(wǎng)狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)是能夠形成有毒赤潮的海洋甲藻之一,所產(chǎn)毒素為蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs),該藻在全球很多海域中普遍存在,其生長與產(chǎn)毒特征表現(xiàn)出較強的海域差異性。以分離自我國北黃海海域的網(wǎng)狀原角藻為實驗對象,研究了溫度和營養(yǎng)鹽(N、P)限制對該藻生長與產(chǎn)毒的影響。研究發(fā)現(xiàn)：溫度和營養(yǎng)鹽限制對藻細胞的生長和產(chǎn)毒均有影響,但營養(yǎng)鹽限制影響更為顯著。較低的溫度更適宜P.reticulatum的生長,15℃時無營養(yǎng)鹽限制的L1-Si培養(yǎng)基中藻細胞生長最好。營養(yǎng)鹽限制尤其是P限制能夠顯著降低藻細胞的比生長速率和細胞密度(P<0.01),縮短藻細胞指數(shù)生長期和穩(wěn)定期的持續(xù)時間。所有溫度下N、P限制均有利于藻細胞內(nèi)毒素累積,15℃P限制培養(yǎng)基中單個藻細胞中YTX毒素最高,達到92.6 pg/細胞,分別是相同培養(yǎng)溫度下N限制和L1-Si中藻細胞毒素含量的3.8倍和7.1倍。溫度變化對N和P限制下藻細胞毒素含量影響不同：在5—15℃范圍內(nèi),隨溫度升高,N限制培養(yǎng)基中藻細胞YTX含量增幅逐漸下降,而P限制條件下反之。在所有培養(yǎng)條件下,濾液中毒素含量在穩(wěn)定期后開始增多,與L1-Si相比,N、P限制不利于毒素的釋放。高溫能促進L1-Si培養(yǎng)基和N限制培養(yǎng)基中毒素的釋放,但對P限制影響不顯著。

網(wǎng)狀原角藻；營養(yǎng)鹽限制；溫度；蝦夷扇貝毒素；北黃海

近年來,有毒有害赤潮在全球很多海域中頻繁發(fā)生,對當?shù)氐乃a(chǎn)養(yǎng)殖、旅游、人類健康和生命安全等造成了極大的危害。有毒赤潮的危害不僅取決于赤潮藻的生物量,還受到藻細胞毒素含量的影響。對于能夠形成有毒赤潮的甲藻,其生長和產(chǎn)毒會受到許多因素的影響,其中營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、鹽度、光照等都是非常重要的影響因子。但環(huán)境因素對藻細胞生長與產(chǎn)毒的影響因藻種而異,相同環(huán)境條件下,不同的藻結(jié)果可能完全不同。

網(wǎng)狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)是廣泛分布于全球近岸海水中并能夠形成赤潮的有毒甲藻之一,是第一個被確認產(chǎn)生蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs)的單細胞藻類[1],已在新西蘭[2- 4]、日本[5- 6]、挪威[7- 8]、意大利[9]、英國和加拿大[10]、西班牙和美國[11- 12]、德國[13]等國的近岸海水中分離到。該藻所產(chǎn)的蝦夷扇貝毒素是一類毒性較強的細胞毒素[14- 15],心臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、細胞溶酶體、胸腺等都有可能是YTXs作用的靶器官[16]。貝類通過濾食藻細胞將YTXs在體內(nèi)累積轉(zhuǎn)化并沿食物鏈傳遞,對貝類消費者及人類健康及生命安全造成了潛在的威脅。

目前對該藻的研究大多集中于其所產(chǎn)毒素的種類、結(jié)構(gòu)及毒素的檢測方法等,對于環(huán)境因子對網(wǎng)狀原角藻生長和產(chǎn)毒的影響的研究并不是太多。2001年,Seamer[17]最早開展了溫度、光照、鹽度、營養(yǎng)鹽單因素變化對新西蘭海域的網(wǎng)狀原角藻生長及產(chǎn)毒的影響研究；2004年,Mitrovic[18]等報道了微量元素Fe、Se和Co對相同海域中網(wǎng)狀原角藻生長和產(chǎn)毒的影響；之后,Paz等[19]和Rodríguez等[20]分別報道了溫度、光照和鹽度及成倍提高L1-Si中大量營養(yǎng)鹽(N、P)的濃度對西班牙海域的網(wǎng)狀原角藻生長與產(chǎn)毒的影響；Guerrini[21]等以分離自意大利亞得里亞海的網(wǎng)狀原角藻為研究對象,研究了鹽度、溫度及營養(yǎng)鹽對該藻產(chǎn)毒的影響； R?der等[13]報道了鹽度、溫度及營養(yǎng)鹽對北海德國灣的網(wǎng)狀原角藻生長與產(chǎn)毒的影響。通過分析已有的研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境因子會強烈影響藻細胞密度和藻毒素的種類與組成,但是由于采用了不同地理株系開展研究,很多情況下即使環(huán)境因子相同得到的結(jié)果卻不同甚至相互矛盾。可見,藻株生長、YTXs合成及毒素組分的變異性與藻株的地理分布密切相關(guān)[5,8-9]。

我國也是有毒赤潮高發(fā)的國家之一,貝類中赤潮毒素沾染情況亦較嚴重,而YTXs毒素是近年來貝類中累積含量較高的毒素之一,如陳建華等從2011年采自北黃海海域的蝦夷扇貝樣品中檢測到的YTX毒素含量竟高達6.68×103μg/kg[22],大大超出了歐盟規(guī)定的安全食用標準(3750 μg/kg),嚴重威脅消費者的食用安全。2014年國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心梁玉波研究團隊成功從北黃海海域分離純化到1株網(wǎng)狀原角藻,這也是目前國內(nèi)首次分離到產(chǎn)YTXs的網(wǎng)狀原角藻,為進一步研究該藻生長、產(chǎn)毒、赤潮發(fā)生發(fā)展及防控、毒素危害及致毒機理等提供了最基本的研究材料。

由于是首次在我國海域中分離到網(wǎng)狀原角藻,關(guān)于該株藻生長和產(chǎn)毒的相關(guān)信息尚為空白,加之近海貝類中YTXs污染情況嚴重,進行相應的研究就顯得非常迫切和必要。本研究以北黃海域的網(wǎng)狀原角藻為研究對象,選擇對藻細胞生長和產(chǎn)毒影響比較顯著的兩個環(huán)境因子——溫度和營養(yǎng)鹽,研究不同溫度和N、P營養(yǎng)鹽限制條件下該藻的生長與產(chǎn)毒情況的變化,為更深入地了解該藻存在、大量繁殖與現(xiàn)場環(huán)境因子之間的聯(lián)系,補充該藻的生理生態(tài)學相關(guān)信息,預防該藻赤潮爆發(fā)及海洋食品安全提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

實驗用網(wǎng)狀原角藻采自北黃海海域,經(jīng)分離純化而得。

藻種培養(yǎng)所用海水取自青島石老人海水浴場,鹽度為31, pH為7.9±0.1,砂濾后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,轉(zhuǎn)移至三角瓶中高溫高壓(120℃, 0.12 MPA)滅菌冷卻至室溫,按比例加入除菌的無Si L1培養(yǎng)基(L1-Si)(Guillard和Hargraves, 1993)[23],于15℃,光照強度為90 μmol m-2s-1的恒溫恒濕的氣候室中培養(yǎng),光暗比為12h:12h。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計

實驗中共設(shè)4個溫度梯度,分別為5、10、15、20℃；在每個溫度下再設(shè)3種培養(yǎng)基,分別為L1-Si培養(yǎng)基、N限制 L1-Si培養(yǎng)基(N濃度為L1-Si中的1/10,以下簡稱為1/10N)、P限制 L1-Si培養(yǎng)基(P濃度為L1-Si中的1/10,以下簡稱為1/10P),共12種組合,每種組合設(shè)3個平行樣,試驗周期為48 d。

在實驗正式開始前,將網(wǎng)狀原角藻在相應的溫度條件下馴化一個培養(yǎng)周期。

實驗采用一次性培養(yǎng)的方法。將近岸海水經(jīng)過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾并高溫滅菌后,按照不同的N、P濃度添加L1培養(yǎng)基各種營養(yǎng)鹽儲備液(經(jīng)0.2 μm一次性無菌針頭濾器(?25 mm, Pall, USA)過濾除菌),配制成實驗需要的3種培養(yǎng)基,并將配制好的培養(yǎng)基置于實驗需要的不同培養(yǎng)溫度下進行同步化。取經(jīng)馴化后的平臺期藻細胞進行接種,初始接種密度均為500 個細胞/mL,培養(yǎng)體積均為1000 mL,置于GZX- 250BS-Ⅱ型光照培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械廠)內(nèi)培養(yǎng),光強為90 μmol m-2s-1,光暗周期為12h:12h。接種當天取樣,之后每3 d取1次樣,時間為18：00點,試驗中所測參數(shù)之所需樣品的采集均同步進行。

1.2.2 樣品采集、處理及分析

(1)藻細胞計數(shù)、形態(tài)觀察及比生長速率計算

自接種日起每3d取1次樣,取樣前輕輕晃動培養(yǎng)瓶,使藻液充分混勻。取2 mL藻液,加入1% Lugol′s碘液固定,混勻后,用浮游植物計數(shù)板在TE2000倒置顯微鏡(Nikon, Japan)下計數(shù),同時觀察細胞形態(tài)的變化。

藻的比生長速率按以下公式計算：比生長速率(μ)=(lnN1-lnN0)/ (t1-t0), 式中μ為比生長速率(d-1),N0和N1分別為t0和t1時間的細胞密度。

(2) 毒素提取與分析

藻毒素提取 取20 mL藻液,低真空度抽濾至GF/F膜(?25 mm, WhatmanTM, UK),同時收集濾液用于胞外毒素分析。將帶有藻細胞的濾膜剪碎后,用4mL 80%的甲醇冰浴中超聲破碎,反復鏡檢,直至細胞全部破碎。4℃,6500 r/min離心10 min,收集上清；重復提取1次,合并兩次的上清液,80%甲醇定容至10 mL。用0.22 μm的尼龍膜(?13 mm,艾杰爾,北京)過濾,濾液置于-20℃保存至分析。

胞外毒素提取 根據(jù)Paz 等[12]的方法并稍作調(diào)整收集濾液中的毒素。具體洗脫步驟為：依次用10 mL 70%甲醇和10 mL 20%的甲醇平衡固相萃取(SPE)小柱后,將20 mL濾液上樣到SPE小柱；用10 mL 20%的甲醇洗脫SPE小柱,棄掉洗脫液；之后,用10 mL 70%的甲醇洗脫SPE小柱,收集洗脫液,用0.22 μm的尼龍膜過濾,濾液置于-20℃保存至分析。

毒素的分析檢測 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法進行藻毒素和胞外毒素的檢測。液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)為Agilent1200液相系統(tǒng)(包括G1311A四元泵、G1313A自動進樣器,G1316A柱溫箱)；API4000三重四極桿質(zhì)譜檢測器(Applied Biosystems GmbH, Germany),離子源為ESI電噴霧離子源；液相色譜柱為Phenomenex RP C18柱(150×3.0mm, 5μm)。

液相色譜條件 流動相A為水(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨),流動相B為95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)；流速為0.3 mL/min,進樣體積10 μL,柱溫30℃,梯度洗脫程序如表 1所示。質(zhì)譜檢測條件 采用ESI+/-切換多參數(shù)掃描方式(MRM),各項參數(shù)見表 2和表3 。

表1 液相梯度洗脫程序

A: 水(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨);B: 95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)

表2 多反應監(jiān)測參數(shù)(正離子模式)

Q1 Mass: 四級桿質(zhì)譜1 Quadrupole mass 1; Q3 Mass: 四級桿質(zhì)譜3 Quadrupole mass 3; DP: 去簇電壓Declustering potential；EP:射入電壓Entrance potential; CE: 碰撞電壓Collision energy；CXP：碰撞室出口電壓Cell exit potential

表3 多反應監(jiān)測參數(shù)(負離子模式)

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 13統(tǒng)計軟件分別進行方差的單變量分析和多重比較分析,分析不同溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻生長及產(chǎn)毒是否具有顯著影響。設(shè)定α=0.05,數(shù)據(jù)以M±S.D.表示(n=3)。當P<0.05時具有顯著性差異,P<0.01時具有極顯著差異。另外,利用Origin 9.0作圖軟件進行作圖分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻生長的影響

根據(jù)圖1和圖2,溫度和營養(yǎng)鹽限制均對藻細胞的生長有影響,但影響的程度與細胞生長階段不同。

圖1 不同溫度和營養(yǎng)鹽條件下網(wǎng)狀原角藻的生長情況Fig.1 Growth curves of P. reticulatum cultured at different temperature and nutrient levels

圖2 不同溫度和營養(yǎng)鹽條件下網(wǎng)狀原角藻比生長速率的變化Fig.2 Changes of specific growth rate of P. reticulatum in the exponential phase at different temperature and nutrient levels

在所有溫度條件下,網(wǎng)狀原角藻均在L1-Si培養(yǎng)基中生長最好,最大細胞密度和比生長速率也出現(xiàn)在該培養(yǎng)基中, P限制則顯著抑制藻的生長。以15℃為例,P限制培養(yǎng)基中最大細胞密度和比生長速率分別為0.47×107個細胞/L和0.132 d-1,僅為L1-Si的一半,差異極顯著(P<0.01)；另外,P限制明顯縮短了藻細胞的指數(shù)生長期和穩(wěn)定期,與L1-Si培養(yǎng)基相比至少提前6d結(jié)束指數(shù)生長期；N限制明顯縮短了穩(wěn)定期的持續(xù)時間,對指數(shù)生長期藻細胞的生長影響不大。

溫度的影響主要體現(xiàn)在L1-Si和N限制培養(yǎng)基中藻細胞指數(shù)生長期階段,在此階段藻細胞的生長基本與溫度變化呈正相關(guān),高溫區(qū)(15℃和20℃)和低溫區(qū)(5℃和10℃)之間細胞密度差異顯著(P<0.05)。但在P限制培養(yǎng)基中,5—15℃范圍內(nèi)藻細胞的生長與溫度變化呈負相關(guān)。指數(shù)生長期后,溫度的影響在營養(yǎng)鹽限制的培養(yǎng)基中變得不明顯,藻細胞密度均開始下降并快速進入衰敗期；20℃L1-Si培養(yǎng)基中藻細胞也表現(xiàn)出相似的生長情況,但其余溫度下藻細胞在經(jīng)過較長的穩(wěn)定期后密度又出現(xiàn)“返增”現(xiàn)象。

2.2 溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻產(chǎn)毒的影響

2.2.1 溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX含量的影響

HPLC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn),網(wǎng)狀原角藻主要產(chǎn)YTX及少量YTX衍生物,其中YTX占到96%,所以本實驗中主要以YTX含量的變化來考察溫度和N、P限制對其產(chǎn)毒的影響。

研究發(fā)現(xiàn),在所有培養(yǎng)條件下,網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX含量隨著藻細胞的生長階段有著相同的變化的趨勢：指數(shù)生長期藻細胞內(nèi)YTX含量較穩(wěn)定,從指數(shù)生長期后期開始,胞內(nèi)YTX濃度開始急劇增加,穩(wěn)定期末期時達到最高,之后開始下降。

與無營養(yǎng)鹽限制相比,N、P限制能顯著提高網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX的含量。1/10N培養(yǎng)基中,從指數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期前期,各溫度下胞內(nèi)YTX含量開始明顯升高,但增幅與溫度變化呈負相關(guān)：5℃時YTX含量最高,約為30 pg/細胞,15℃和20℃時毒素含量降低到20 pg/細胞左右；1/10P培養(yǎng)基中,從指數(shù)生長期的中期開始,胞內(nèi)YTX含量就開始升高,略早于L1-Si和1/10N培養(yǎng)基。在5—15℃范圍內(nèi),胞內(nèi)YTX毒素含量隨溫度升高而升高,20℃時,毒素含量開始下降,其中15℃時穩(wěn)定期末期單個藻細胞中YTX毒素含量最高,達到92.6 pg/細胞,顯著高于其余3個溫度(P<0.01)(圖3)。

圖3 不同溫度和營養(yǎng)鹽條件下網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX濃度變化情況Fig.3 Changes of intracellular YTX concentration of P. reticulatum at different temperature and nutrient levels

2.2.2 溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻胞外YTX含量的影響

圖4 不同溫度和營養(yǎng)鹽條件下指數(shù)生長期和穩(wěn)定期濾液中YTX毒素的細胞配比Fig.4 Percentage of YTX in the media filtrates of P. reticulatum in the exponential and the stationary phase respectively at different temperature and nutrient levels

濾液中的YTX毒素主要來源于藻細胞正常代謝分泌和死亡細胞的釋放而來。指數(shù)生長期和穩(wěn)定期細胞死亡較少,濾液中的毒素主要來源于藻細胞的代謝分泌,而穩(wěn)定期以后細胞逐漸衰敗死亡,胞內(nèi)大量毒素釋放。為了客觀地評價溫度和營養(yǎng)鹽限制對網(wǎng)狀原角藻胞外YTX毒素含量的影響,本研究只比較指數(shù)生長期和穩(wěn)定期濾液中毒素含量的變化。為了便于胞內(nèi)和胞外毒素進行比較,根據(jù)測定的濾液中毒素的濃度及相應的細胞密度,將濾液中YTX毒素折算成單細胞濃度,從而比較胞內(nèi)和胞外毒素的細胞配額的變化。

從圖4可以看出,在所有培養(yǎng)條件下及各個不同的生長階段,濾液中YTX毒素的濃度均很低。不論是指數(shù)生長期還是穩(wěn)定期,L1-Si培養(yǎng)基濾液中YTX毒素含量顯著高于N和P限制下濾液中YTX毒素含量(P<0.01),且隨溫度升高明顯升高； N 和P限制均不利于YTX的釋放,高溫能加劇N限制下YTX毒素的釋放,但對P限制無顯著影響。

3 討論

3.1 溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻生長的影響

溫度是影響赤潮生物生長、繁殖、代謝等的重要環(huán)境因子,也是赤潮爆發(fā)的關(guān)鍵影響因子之一。每種赤潮生物都有自己生存的最適生長溫度和溫度范圍。本研究中采用的網(wǎng)狀原角藻是2014年5月首次分離自我國的北黃海海域,當時該藻以較高密度存在于5 m以淺的表層海水中,海水表層溫度在15℃左右。而本研究的實驗結(jié)果表明,在20℃的L1-Si培養(yǎng)基中,藻細胞比生長速率和指數(shù)生長期結(jié)束時藻細胞密度最高,分別為0.256 d-1和1.1×107/L-1,比15℃時略高(分別為0.252 d-1和1.04×107/L-1)；但在20℃時,藻細胞在指數(shù)期結(jié)束后很快就進入衰退期,藻細胞密度降為原來的70%；而15℃條件下,藻細胞在經(jīng)過較長的穩(wěn)定期后細胞密度又開始增加。另外,在預實驗中我們也發(fā)現(xiàn),20℃培養(yǎng)時,藻細胞的生長周期比低溫度條件下短,25℃培養(yǎng)條件下藻細胞密度很低,且藻細胞嚴重變形；而30℃時在接種后的較短時間內(nèi)藻細胞即死亡(預實驗的結(jié)果,未顯示),可見,該株藻適宜在較低溫度下生長。Guerrini等[18]和R?der等[13]分別以分離自意大利和德國近岸海域的網(wǎng)狀原角藻進行研究也發(fā)現(xiàn)20℃和15℃分別是上述兩株藻的最適生長溫度。Koike等[24]在對日本北部Okkirai Bay水體中網(wǎng)狀原角藻種群的季節(jié)變化進行了1周年的調(diào)查后發(fā)現(xiàn),溫度在8.23—19.99℃范圍內(nèi),水體中能夠檢測到網(wǎng)狀原角藻細胞,形成赤潮并且細胞密度達到峰值時水溫在14.3—16.53℃之間。在我國北黃海海域分離到的網(wǎng)狀原角藻與上述研究中的藻株的適宜生長溫度非常接近,推測其在北黃海海域大量增殖并引發(fā)赤潮最有可能是在春末夏初季節(jié),這與現(xiàn)場調(diào)查結(jié)果也一致。Okolodkov等[25]在通過分析1976—1999年期間歐亞北極地區(qū)的28次調(diào)查(539個站位,1810個樣品)的數(shù)據(jù)和500多篇相關(guān)文獻后得出:網(wǎng)狀原角藻分布范圍大致在25—0℃等溫線之間,主要分布在15℃等溫線附近海域。上述研究結(jié)果也解釋了為什么在熱帶海域較少發(fā)生該藻赤潮[24, 26- 27]。

水體中氮、磷的種類、組成和含量不僅對赤潮生物的生長、生理生化過程有著重要的影響,而且對赤潮形成的規(guī)模和程度也起著決定性的作用。

本研究結(jié)果表明,網(wǎng)狀原角藻的生長更多地受P限制的影響而不是N限制,藻細胞大量增殖時對P的需求較大,當環(huán)境中P的濃度比較低時,P可能成為網(wǎng)狀原角藻生長的限制因子。這與Guerrini等[18]和R?der等[13]對網(wǎng)狀原甲藻的研究結(jié)果相同,也與其他許多產(chǎn)腹瀉性貝毒[28-29]和麻痹性貝毒[30-1]的甲藻中的研究結(jié)果相同。另外,Rodríguez等[21]開展的網(wǎng)狀原角藻對大量營養(yǎng)鹽需求的研究結(jié)果也間接證實了上述結(jié)論。他們發(fā)現(xiàn),L1培養(yǎng)基中P的濃度遠遠不能滿足網(wǎng)狀原角藻生長的需要,當P的濃度增加到217 μmol/L(6×L1)時藻細胞的生長速率和生物量達到最大,超過此濃度藻細胞的生長才會受到抑制；而N在882 μmol/L(1×L1)—8824 μmol/L(10×L1)濃度范圍內(nèi)對藻細胞的生長均無明顯影響,本研究中將N濃度降低至88.2 μmol/L(1/10×L1)時,對藻細胞的生長影響也不顯著,推測該藻對N濃度的改變不敏感。但是根據(jù)實驗室的研究結(jié)果外推現(xiàn)場中藻的生長狀況是很難的,即便是現(xiàn)場調(diào)查的結(jié)果,也很難得出確切的結(jié)論,如Koike等[24]在現(xiàn)場調(diào)查中發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的N和P濃度與網(wǎng)狀原角藻的爆發(fā)性增殖之間的沒有相關(guān)性,網(wǎng)狀原角藻赤潮發(fā)生前后水體中N和P的濃度始終處于較低的濃度水平。

研究中還發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定期后期,L1-Si培養(yǎng)基中藻細胞密度卻出現(xiàn)明顯的返增現(xiàn)象,這可能是取樣后期培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液體積減少,空氣增多,細胞周圍氣體不斷更新和交換,加之L1-Si培養(yǎng)基中N、P營養(yǎng)鹽本身就過量,培養(yǎng)后期仍有剩余,幾種因素共同促進了細胞的生長和繁殖。由于本研究并未對培養(yǎng)過程中營養(yǎng)鹽的變化進行檢測,所以L1-Si培養(yǎng)基中藻細胞密度在衰敗期返增現(xiàn)象的具體原因還需要進一步的研究。

3.2 溫度和N、P限制對網(wǎng)狀原角藻產(chǎn)毒的影響

溫度對有毒甲藻產(chǎn)毒能力的影響存在明顯的種間差異,即使是同一種甲藻,不同地理株系間產(chǎn)毒情況也不完全相同。本研究中,在無營養(yǎng)鹽限制的L1-Si培養(yǎng)基中,溫度對網(wǎng)狀原角藻的產(chǎn)毒能力影響不大。這與Manuel[32]研究分離自格陵蘭島附近海域的網(wǎng)狀原角藻產(chǎn)YTX的能力隨溫度變化情況相一致；而R?der等[13]的研究表明分離自德國北海灣的網(wǎng)狀原角藻在低溫下產(chǎn)YTX的能力更強；另外,Guerrini等[18]研究卻發(fā)現(xiàn),在較高溫度(26℃)下,分離自意大利海域的網(wǎng)狀原角藻能夠產(chǎn)生更多的YTX。但是,溫度對藻細胞產(chǎn)毒的影響在有營養(yǎng)鹽限制或不足時變得比較顯著,這可能是營養(yǎng)鹽限制使毒素合成過程中某些酶的活性對溫度更加敏感,從而直接或間接影響毒素的合成。

有研究表明,在營養(yǎng)平衡的條件下,藻類產(chǎn)毒量往往較低；而當營養(yǎng)失衡,尤其是在低磷濃度的條件下,能夠刺激藻類產(chǎn)毒增加,高濃度溶解無機磷,往往不利于毒素的蓄積[33],本研究結(jié)果也支持上述觀點。在15℃ P限制培養(yǎng)基中穩(wěn)定期的藻細胞中YTX含量最高,達到92.6 pg/細胞,是同一溫度相同生長階段L1-Si培養(yǎng)基中的7倍有余。由于P限制情況下,細胞密度顯著降低而細胞體積變大,如果以單位體積培養(yǎng)液來衡量毒素含量的變化,那么磷限制對毒素合成的影響就明顯削弱了,類似的結(jié)果在以往對亞歷山大藻的研究中已被多次報道[34-37]。盡管如此,P限制下單位體積培養(yǎng)液中YTX的含量仍是營養(yǎng)鹽平衡條件下的1.5—2倍。

甲藻對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的能力比其它藻類差,在營養(yǎng)限制條件下,甲藻的競爭能力會比其他硅藻和無毒甲藻差[38],而毒素的產(chǎn)生可能是其對低營養(yǎng)利用率的一種補償性競爭策略[39],可以作為對攝食浮游藻類生物的威懾,防止被攝食；當營養(yǎng)不平衡時,毒素作為營養(yǎng)儲存化合物,也可以減輕某些過剩營養(yǎng)物質(zhì)對藻造成的不利影響[34, 40]。YTX為多環(huán)聚醚類化合物,其分子中不含N、P原子,營養(yǎng)鹽對其合成的影響可能是通過直接或間接影響與YTX合成相關(guān)酶及相關(guān)中間產(chǎn)物來實現(xiàn)的。通過穩(wěn)定性同位素投喂實驗發(fā)現(xiàn),YTX分子中碳骨架結(jié)構(gòu)起源于聚酮類化合物(polyketides)[41],而聚酮類化合物碳鏈的組裝在一定程度上與脂肪酸的合成相關(guān)[42]。根據(jù)以上推測,當N、P限制時,YTX毒素的合成可能與網(wǎng)狀原角藻細胞的脂肪酸代謝有關(guān),但這需要實驗來驗證。

關(guān)于濾液中YTX的含量,Guerrini等[18]與Paz等[11]均認為濾液中檢測到的YTX是由細胞死亡后釋放到培養(yǎng)基中導致的。本研究的結(jié)果也基本與上述觀點一致,高溫及穩(wěn)定期中后期后死亡細胞增多,濾液中的YTX濃度升高。但本研究中,無論在什么培養(yǎng)條件下,整個培養(yǎng)過程中,只有很少一部分YTX釋放到濾液中,這與R?der等[13]對分離自德國北海的網(wǎng)狀原角藻在N限制下釋放43%的YTX毒素到濾液中的研究結(jié)果不同,這可能由于不同株系、不同培養(yǎng)條件及檢測方法等不同所導致。

4 結(jié)論

溫度和營養(yǎng)鹽限制對網(wǎng)狀原角藻生長和產(chǎn)毒均有影響,其中營養(yǎng)鹽的影響更為顯著和強烈。

本研究中,網(wǎng)狀原角藻在15℃L1-Si培養(yǎng)基中生長最好；N、P限制均有利于YTX毒素的合成和累積,15℃時P限制培養(yǎng)基中胞內(nèi)YTX含量最高。

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Effects of temperature and nutrient limitation on growth and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum

GAO Chunlei1, 2, 3,*, SUN Ping1, 2, 3,4, JIA Zhihui1, JIANG Meijie1, 2, 3, ZHAO Cuiqiong5, ZHANG Xuelei1, 2, 3，WU Zhenxing6，LIANG Chengzhu6

1FirstInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China2LaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalScience,Qingdao;NationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao266061,China3KeyLaboratoryofMarineEcologicalEnvironmentalScienceandEngineering,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China4OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China5EastChinaSeaForecastCenter,StateOceanicAdministration,Shanghai200081,China6InspectionandQuarantinetechnologyCenterofShandongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266002，China

Protoceratiumreticulatum,a marine dinoflagellate that produces yessotoxins (YTXs), is common in coastal waters worldwide and can form toxic algal blooms. There are marked differences in its growth and toxin-producing characteristics in different areas. This study investigated the effects of temperature and nutrient (N, P) limitation on the growth and toxin production ofP.reticulatumrecently isolated from the North Yellow Sea. The results showed that temperature and nutrient limitation affected growth and toxin production of the alga to different degrees, but nutrient limitation had a more significant influence. Lower temperatures were more suitable for the growth ofP.reticulatum. Growth of algal cells in L1-Si medium without nutrient limitation was best at 15℃. P limitation greatly reduced the specific growth rate and cell density (P< 0.01), and shortened the duration of the exponential and stationary phases. N-limited cultures, in contrast, resulted in a growth rate and maximum cell density similar to those in L1-Si medium, but with a shorter stationary phase. At all temperatures, both N and P limitation were favorable for the accumulation of YTX in algal cells, which was particularly marked in the latter. The maximum YTX content of 92.6pg/cell was observed in 1/10P medium at 15℃ at the end of the stationary phase. This was approximately 3.8 times and 7.1 times that of the YTX in the N limited and L1-Si medium at the same culture temperature, respectively. Changes in temperature had different influences on the content of intracellular YTX in N- and P-limitation cultures. In the range of 5—15℃, temperature change had a negative effect on YTX increase under N limitation, whereas in P-limited medium, the effect was positive. In all culture conditions, the YTX concentration in the filtrate began to increase during the stationary phase. Compared with L1-Si, both N- and P-limited media were not conducive to the release of toxins. Higher temperature helpful to YTX release in the L1-Si and N-limited media, but it did not significantly affect that in the P-limited medium.

Protoceratiumreticulatum; nutrient limitation; temperature; yessotoxin (YTX); North Yellow Sea

國家自然科學基金(41206161)；海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201305010)；國家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務專項資金項目(2012T08, GY2013G28)；國家基金委-山東省聯(lián)合基金項目“海洋生態(tài)與環(huán)境科學”(U1406403)；青島市創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目計劃(13-CX-28)

2016- 05- 20;

2017- 01- 16

10.5846/stxb201605200974

*通訊作者Corresponding author.E-mail: gaochunlei@fio.org.cn

高春蕾,孫萍,賈智慧,姜美潔,趙翠瓊,張學雷，吳振興，梁成珠.溫度和營養(yǎng)鹽限制對網(wǎng)狀原角藻生長與產(chǎn)毒的影響.生態(tài)學報,2017,37(12):4217- 4226.

Gao C L, Sun P, Jia Z H, Jiang M J, Zhao C Q, Zhang X L,Wu Z X，Liang C Z.Effects of temperature and nutrient limitation on growth and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4217- 4226.